本文介绍了一种结合差速离心与密度梯度离心的方法，用于从人卵巢癌组织及对照卵巢组织中分离线粒体，以进行定量蛋白质组学分析。该方法可获得高质量的线粒体样品，并实现对人卵巢癌线粒体蛋白质组的高通量、高重复性定量蛋白质组学分析。
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本文内容
摘要
摘要
卵巢癌是一种常见的妇科恶性肿瘤，具有较高的死亡率，但其分子机制尚不明确。大多数卵巢癌在晚期才被诊断，这严重阻碍了治疗。线粒体改变是人类卵巢癌的显著特征，而线粒体是能量代谢、细胞信号传导和氧化应激的中心。深入研究卵巢癌与对照卵巢组织之间线粒体蛋白质组的变化，有助于深入理解卵巢癌的分子机制，并发现有效且可靠的生物标志物和治疗靶点。本文介绍了一种有效的线粒体提取方法，并结合相对与绝对定量同重标签（iTRAQ）定量蛋白质组学技术，用于分析人类卵巢癌及对照组织的线粒体蛋白质组，具体步骤包括差速离心、密度梯度离心、线粒体样本质量评估、胰蛋白酶消化蛋白质、iTRAQ标记、强阳离子交换分级（SCX）、液相色谱（LC）、串联质谱（MS/MS）、数据库分析以及线粒体蛋白质的定量分析。通过该方法已成功鉴定出大量蛋白质，最大限度地覆盖了人类卵巢癌线粒体蛋白质组，并获得了人类卵巢癌中差异表达的线粒体蛋白质谱型。
引言
卵巢癌是一种常见的妇科恶性肿瘤，具有较高的死亡率，但其分子机制尚不明确1,2。大多数卵巢癌患者在确诊时已处于晚期，严重影响治疗效果。线粒体的改变是人类卵巢癌的显著特征之一，而线粒体是能量代谢、细胞信号传导和氧化应激的核心场所3,4,5,6,7。深入研究卵巢癌组织与正常卵巢组织之间线粒体蛋白质组的变化，有助于进一步理解卵巢癌的分子机制，并有助于发现有效且可靠的生物标志物和治疗靶点。线粒体代谢已被提出并公认作为癌症治疗的潜在靶点，抗线粒体治疗最终可能在预防癌症复发和转移方面发挥重要作用8。个体化代谢谱分析也已被用作癌症分层和预测策略的有效工具9,10。
本研究的长期目标是开发并应用一种定量线粒体蛋白质组学方法，用于研究卵巢癌，阐明卵巢癌与对照卵巢组织之间线粒体蛋白质组的改变，以及....
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方案
本方案使用了包括卵巢癌组织（n = 7）和正常对照卵巢组织（n = 11）在内的卵巢组织样本。本方案已获得中国中南大学湘雅医院医学伦理委员会的批准3,4,5。
1. 人卵巢癌组织线粒体的制备
- 通过混合210 mM甘露醇、70 mM蔗糖、100 mM氯化钾（KCl）、50 mM Tris-HCl、1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）、0.1 mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA）、1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制剂、2 mM正钒酸钠（V）和0.2%牛血清白蛋白（BSA），配制250 mL线粒体分离缓冲液，调节pH至7.4。
- 将约1.5 g卵巢癌组织置于洁净的玻璃培养皿中。
- 加入2 mL预冷的线粒体分离缓冲液，轻轻冲洗组织表面，重复3次以去除血液。
- 使用洁净的眼科剪将组织彻底剪碎成约1 mm3大小的组织块，并将剪碎的组织转移至50 mL离心管中。
- 加入含0.2 mg/mL nagarse的线粒体分离缓冲液13.5 mL，然后使用电动匀浆器进行匀浆处理（设置档位2，每次10秒，共6次，间隔10秒），在4 °C条件下处理2分钟。
- 向组织匀浆....
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结果
卵巢癌组织与对照卵巢组织在制备线粒体方面存在差异。本研究发现，从卵巢癌组织中制备线粒体比从对照卵巢组织中制备更为容易3,4。因此，针对对照卵巢组织的线粒体制备方案需进行一些改进。首先，在组织匀浆前，需在已加入PBS溶液的剪碎对照组织中添加8 mL 0.05%胰蛋白酶/20 mM EDTA，室温消化30分钟，随后以200 × g 离心5分钟（见方案步骤2.5），此步骤可提高线粒体制备效果。其次，对照卵巢组织与卵巢癌组织的不连续密度梯度配置不同（图1）。对于卵巢癌组织，按从下到上的顺序在离心管中依次加入5 mL 34%、8 mL 30%、12 mL 25%（含粗线粒体）、8 mL 23%和3 mL 20%的密度梯度介质。离心后，纯化的线粒体位于25%与30%之间的界面处（图1A，见方案步骤1.......
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讨论
线粒体改变是卵巢癌的一个显著特征。从人卵巢癌组织及对照组织中制备高质量的线粒体样本，用于大规模定量蛋白质组学研究，有助于深入理解线粒体在卵巢癌发病机制中的功能以及线粒体分子网络的变化，并为进一步基于线粒体发现靶向治疗策略和有效生物标志物阐明其分子机制4,5,8。采用差速离心结合密度梯度离心法，可有效分离和纯化人卵巢癌组织及对照卵巢组织中的线粒体。所制备的线粒体样品纯度高，适用于后续的定量蛋白质组学分析。
制备的线粒体样品中含有少量过氧化物酶体3,17,18和细胞质蛋白19,20。这些成分不应被简单.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由湖南省百人计划（资助编号：X.Z.）、湘雅医院人才引进基金（资助编号：XZ）、国家自然科学基金（资助编号：81572278 和 81272798，授予 XZ）、中国"863"计划项目（资助编号：2014AA020610-1，授予 XZ）以及湖南省自然科学基金（资助编号：14JJ7008，授予 XZ）资助。X.Z. 提出了本论文的研究构想，获取了线粒体样品的 iTRAQ 定量蛋白质组学数据，撰写并修改了论文，协调了相关工作，并负责经费支持与通讯事宜。H.L. 制备了线粒体样品。S.Q. 参与了部分工作。X.H.Z 参与了论文撰写并对英文语言进行了编辑。N.L. 分析了 iTRAQ 蛋白质组学数据。所有作者均批准了最终稿件。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| BCA 蛋白检测试剂盒 | Vazyme | E112 | BCA 蛋白检测试剂盒是我们广受欢迎的 BCA 试剂的一种特殊三组分版本，已优化用于测定稀释蛋白溶液（0.5 至 20 微克/毫升）的总蛋白浓度（A562nm）。 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Solarbio | A8020-5G | 热激组分，澳大利亚来源，无蛋白酶，低脂肪酸，低 IgG，pH 7，≥98% |
| 离心机 | XiangYi | TDZ4--WS | |
| CHAPS | Sigma | C9426-5G | 生物试剂，适用于电泳，≥98%（HPLC）（Sigma-Aldrich） |
| 二胺四乙酸（EDTA） | Sigma | 798681-100G | 无水，自由流动，Redi-Dri，≥98% |
| DTT | Sigma | 10197777001 | 1,4-二硫苏糖醇 |
| Easy nLC | Proxeon Biosystems（现为 Thermo Fisher Scientific） | ||
| 乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA） | Sigma | E0396-10G | BioXtra，≥97.0% |
| 匀浆器 | SilentShake | HYQ-3110 | |
| iTRAQ 试剂盒 | Applied Biosystems | Applied Biosystems iTRAQ 试剂–化学参考指南，货号 4351918A | |
| 低温超速离心机 | Eppendorf | 5424R | |
| 甘露醇 | Macklin | M813424-100G | 甘露醇是一种多元醇（多元醇），由果糖氢化制得，用作甜味剂、保湿剂和填充剂。它具有低吸湿性和较差的油溶性。 |
| MASCOT 搜索引擎 | Matrix Science，英国伦敦；版本 2.2 | ||
| Nagarse | Solarbio | P9090 | |
| N-羟基琥珀酰亚胺（SDT） | Sigma | 56480-25G | Purum，≥97.0%（T） |
| Nycodenz | Alere/Axis-Shield | 1002424-1 | |
| 苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制剂 | Solarbio | P0100-1ML | PMSF 是一种蛋白酶抑制剂，可与丝氨酸残基反应，从而抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶和木瓜蛋白酶。 |
| 氯化钾 | Macklin | P816354-25G | 氯化钾，KCI，又称氯化钾和钾盐，是一种无色结晶固体，具有咸味，熔点为 776°C（1420 OF）。它溶于水，但不溶于酒精。氯化钾用于肥料、制药、摄影以及作为食盐替代品。 |
| Proteome Discoverer 1.4 | Matrix Science，英国伦敦 | ||
| PVDF 膜 | Millipore | 05317 | 每卷 26.5 cm × 1.875 m，孔径 0.45 µm，疏水性 PVDF 转印膜，背景荧光低，适用于 Western 印迹。兼容可见光和红外荧光探针。 |
| Q Exactive 质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | ||
| SCX 柱 | Sigma | 58997 | 粒径 5-μm，长度 5 cm × 内径 4.6 mm（Supelco）。 |
| 正钒酸钠（V） | Macklin | S817660-25G | 正钒酸钠（钒酸盐）是一种广谱的竞争性蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂。加入 EDTA 或稀释后，正钒酸钠的抑制作用可逆。 |
| 蔗糖 | Macklin | S824459-500G | Vetec 试剂级，99% |
| 硫脲 | Sigma | 62-56-6 | ACS 试剂，≥99.0% |
| Tris 碱 | Sigma | 10708976001 | Tris 碱在 pH 7.0–9.0 范围内有效。在 25°C 时 pKa 为 8.1。 |
| 胰蛋白酶（细胞培养用） | Gibco | 25200-056 | 该液体形式的胰蛋白酶含有 EDTA 和酚红。Gibco 胰蛋白酶-EDTA 由胰蛋白酶粉末制成，是一种经辐照处理的来源于猪胰腺的蛋白酶混合物。由于其较强的消化能力，胰蛋白酶广泛用于细胞解离、常规细胞传代培养以及原代组织解离。 |
| 尿素 | Sigma | U5378-100G | 粉末，生物试剂，适用于分子生物学，可用于细胞培养 |
参考文献
- Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites. Journal of Ovarian Research. 10, 57(2017).
- Gadducci, A., et al.
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