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方法文章

卵巢癌组织和对照卵巢组织线粒体的制备用于定量蛋白质组学分析

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DOI：

10.3791/60435

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2019年11月18日

 ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Cancer Proteomics of Chinese Ministry of Health, Xiangya Hospital, Central South University, 2Hunan Engineering Laboratory for Structural Biology and Drug Design, Xiangya Hospital, Central South University, 3State Local Joint Engineering Laboratory for Anticancer Drugs, Xiangya Hospital, Central South University, 4National Clinical Research Center for Geriatric Disorders, Xiangya Hospital, Central South University, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Xiangya Hospital, Central South University

本文内容

摘要

本文介绍了一种结合差速离心与密度梯度离心的方法，用于从人卵巢癌组织及对照卵巢组织中分离线粒体，以进行定量蛋白质组学分析。该方法可获得高质量的线粒体样品，并实现对人卵巢癌线粒体蛋白质组的高通量、高重复性定量蛋白质组学分析。

摘要

卵巢癌是一种常见的妇科恶性肿瘤，具有较高的死亡率，但其分子机制尚不明确。大多数卵巢癌在晚期才被诊断，这严重阻碍了治疗。线粒体改变是人类卵巢癌的显著特征，而线粒体是能量代谢、细胞信号传导和氧化应激的中心。深入研究卵巢癌与对照卵巢组织之间线粒体蛋白质组的变化，有助于深入理解卵巢癌的分子机制，并发现有效且可靠的生物标志物和治疗靶点。本文介绍了一种有效的线粒体提取方法，并结合相对与绝对定量同重标签（iTRAQ）定量蛋白质组学技术，用于分析人类卵巢癌及对照组织的线粒体蛋白质组，具体步骤包括差速离心、密度梯度离心、线粒体样本质量评估、胰蛋白酶消化蛋白质、iTRAQ标记、强阳离子交换分级（SCX）、液相色谱（LC）、串联质谱（MS/MS）、数据库分析以及线粒体蛋白质的定量分析。通过该方法已成功鉴定出大量蛋白质，最大限度地覆盖了人类卵巢癌线粒体蛋白质组，并获得了人类卵巢癌中差异表达的线粒体蛋白质谱型。

引言

卵巢癌是一种常见的妇科恶性肿瘤，具有较高的死亡率，但其分子机制尚不明确1,2。大多数卵巢癌患者在确诊时已处于晚期，严重影响治疗效果。线粒体的改变是人类卵巢癌的显著特征之一，而线粒体是能量代谢、细胞信号传导和氧化应激的核心场所3,4,5,6,7。深入研究卵巢癌组织与正常卵巢组织之间线粒体蛋白质组的变化，有助于进一步理解卵巢癌的分子机制，并有助于发现有效且可靠的生物标志物和治疗靶点。线粒体代谢已被提出并公认作为癌症治疗的潜在靶点，抗线粒体治疗最终可能在预防癌症复发和转移方面发挥重要作用8。个体化代谢谱分析也已被用作癌症分层和预测策略的有效工具9,10。

本研究的长期目标是开发并应用一种定量线粒体蛋白质组学方法，用于研究卵巢癌，阐明卵巢癌与对照卵巢组织之间线粒体蛋白质组的改变，以及从系统性多组学角度分析其分子网络的变化11,12，从而发现靶向线粒体的分子生物标志物13，以阐明卵巢癌的分子机制，并实现对卵巢癌患者的预测和个体化治疗。相对与绝对定量同重标签（iTRAQ）标记3,4是一种有效量化线粒体蛋白变化的方法。制备高质量的人卵巢癌及对照卵巢组织线粒体样本，是进行线粒体蛋白质组iTRAQ定量分析的前提条件3。线粒体制备结合iTRAQ定量蛋白质组学技术已成功应用于关于人卵巢癌线粒体蛋白质组的长期研究项目中，包括建立线粒体蛋白质组参考图谱3、差异表达线粒体蛋白谱的分析4,14以及翻译后修饰（如磷酸化）的研究，这些工作已促成发现人卵巢癌中重要的信号通路网络变化5，包括能量代谢4、脂质代谢以及线粒体自噬通路系统的改变3。

既往研究发现，差速离心结合密度梯度离心是分离和纯化人卵巢癌组织及对照卵巢组织中线粒体的有效方法3,4,5,14。iTRAQ标记联合强阳离子交换（SCX）-液相色谱（LC）-串联质谱（MS/MS）是检测、鉴定和定量所制备线粒体样品中蛋白质的关键技术。

本文详细描述了线粒体提取与iTRAQ定量蛋白质组学相结合的实验方案。该方案已成功应用于人卵巢癌组织线粒体蛋白质组的分析。实验流程包括样品制备、差速离心、密度梯度离心、线粒体样品的质量评估、胰蛋白酶消化蛋白质、iTRAQ标记、强阳离子交换（SCX）分级、液相色谱（LC）、串联质谱（MS/MS）、数据库搜索以及线粒体蛋白质的定量分析。此外，该方案可便捷地推广应用于其他人类组织线粒体蛋白质组的分析。

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方案

本方案使用了包括卵巢癌组织（n = 7）和正常对照卵巢组织（n = 11）在内的卵巢组织样本。本方案已获得中国中南大学湘雅医院医学伦理委员会的批准3,4,5。

1. 人卵巢癌组织线粒体的制备

  1. 通过混合210 mM甘露醇、70 mM蔗糖、100 mM氯化钾（KCl）、50 mM Tris-HCl、1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）、0.1 mM乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA）、1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制剂、2 mM正钒酸钠（V）和0.2%牛血清白蛋白（BSA），配制250 mL线粒体分离缓冲液，调节pH至7.4。
  2. 将约1.5 g卵巢癌组织置于洁净的玻璃培养皿中。
  3. 加入2 mL预冷的线粒体分离缓冲液，轻轻冲洗组织表面，重复3次以去除血液。
  4. 使用洁净的眼科剪将组织彻底剪碎成约1 mm3大小的组织块，并将剪碎的组织转移至50 mL离心管中。
  5. 加入含0.2 mg/mL nagarse的线粒体分离缓冲液13.5 mL，然后使用电动匀浆器进行匀浆处理（设置档位2，每次10秒，共6次，间隔10秒），在4 °C条件下处理2分钟。
  6. 向组织匀浆液中再加入3 mL线粒体分离缓冲液，通过移液操作充分混匀。
  7. 将制备好的组织匀浆液在1,300 × g 条件下离心10分钟（4 °C），弃去粗制核组分（即沉淀），保留上清液。
  8. 将上清液再次离心（10,000 × g，10分钟，4 °C），弃去微粒体（即上清液），保留沉淀。
  9. 加入2 mL线粒体分离缓冲液，通过轻柔移液充分重悬沉淀。
  10. 将重悬的沉淀物在7,000 × g 条件下离心10分钟（4 °C），弃去上清液，保留粗制线粒体（即沉淀）。
  11. 加入12 mL 25%密度梯度介质（即Nycodenz），重悬提取得到的粗制线粒体。
  12. 自下而上依次向离心管中加入5 mL 34%、8 mL 30%、12 mL 25%（含步骤1.11中粗制线粒体）、8 mL 23%和3 mL 20%的密度梯度介质，形成不连续密度梯度，然后在52,000 × g 条件下离心90分钟（4 °C）。
  13. 使用长而钝的注射器从25%与30%密度梯度介质之间的界面处收集纯化的线粒体，并转移至洁净离心管中。
  14. 向收集的线粒体中加入线粒体分离缓冲液，稀释至原体积的三倍，然后在15,000 × g 条件下离心20分钟（4 °C），弃去上清液。
  15. 加入2 mL线粒体分离缓冲液重悬沉淀，再次在15,000 × g 条件下离心20分钟（4 °C），弃去上清液，保留沉淀。
  16. 收集最终的沉淀（即纯化的线粒体），于-20 °C保存。
    注：将所有来自卵巢癌组织的纯化线粒体合并，作为定量蛋白质组学分析的线粒体样品。

2. 人对照卵巢组织线粒体的制备

  1. 按照步骤1.1所述配制250 mL线粒体分离缓冲液。
  2. 将约1.5 g正常对照卵巢组织置于洁净的玻璃培养皿中。
  3. 加入2 mL预冷的线粒体分离缓冲液，轻轻冲洗组织表面，重复3次以去除血液。
  4. 使用洁净的眼科剪将组织彻底剪碎成约1 mm3大小的组织块，并将剪碎的组织转移至50 mL离心管中。
  5. 向剪碎的对照组织中加入8 mL含0.05%胰蛋白酶/20 mM EDTA的磷酸盐缓冲液（PBS），在室温下消化30分钟，以帮助裂解组织和细胞并释放线粒体。随后离心（200 × g，5分钟）。弃去上清液，保留组织和细胞沉淀。
  6. 加入13.5 mL含0.2 mg/mL nagarse的线粒体分离缓冲液，使用电动匀浆器对剪碎的组织进行匀浆处理（设置档位2，每次10秒，重复6次，间隔10秒），在4 °C下持续2分钟。
  7. 向组织匀浆液中再加入3 mL线粒体分离缓冲液，通过移液操作充分混匀。
  8. 将制备好的组织匀浆液离心（1,300 × g，10分钟，4 °C）。弃去粗核组分（即沉淀），保留上清液。
  9. 将上清液再次离心（10,000 × g，10分钟，4 °C）。弃去微粒体（即上清液），保留沉淀。
  10. 加入2 mL线粒体分离缓冲液，通过轻柔移液充分重悬沉淀。
  11. 将沉淀悬液离心（7,000 × g，10分钟，4 °C）。弃去上清液，保留粗线粒体（即沉淀）。
  12. 加入12 mL 25%密度梯度介质，重悬提取的粗线粒体。
  13. 通过从下至上依次加入8 mL 38%、5 mL 34%、8 mL 30%、12 mL 25%（含步骤2.12中提取的粗线粒体）、8 mL 23%和3 mL 20%的密度梯度介质，构建不连续密度梯度，并进行离心（52,000 × g，90分钟，4 °C）。
  14. 使用长而钝的注射器，从25%与30%界面至34%与38%界面之间的区域收集纯化的线粒体，转移至洁净离心管中。
  15. 向收集的线粒体中加入线粒体分离缓冲液，稀释至原体积的三倍。离心（15,000 × g，20分钟，4 °C），弃去上清液。
  16. 加入2 mL线粒体分离缓冲液重悬沉淀，再次离心（15,000 × g，20分钟，4 °C）。弃去上清液，保留沉淀。
  17. 收集最终沉淀（即纯化的线粒体），于-20 °C保存。
    注：将来自对照卵巢组织的所有纯化线粒体合并，作为定量蛋白质组学分析的线粒体样品。

3. 纯化组织线粒体样品质量的验证

  1. 取一管纯化的线粒体样品（即步骤1.16中卵巢癌组织和步骤2.17中对照卵巢组织所得的沉淀）用于透射电子显微镜（EM）验证。
    注意：详细实验方案此前已有描述15,16。
  2. 通过混合8 M尿素、2 M硫脲、40 mM Tris、1 mM EDTA、130 mM二硫苏糖醇（DTT）和4%（w:v）3-((3-胆酰胺丙基)二甲基铵)-1-丙磺酸（CHAPS）配制线粒体蛋白提取缓冲液。调节pH至8.52。
  3. 取一管纯化的线粒体样品（即步骤1.16中卵巢癌组织和步骤2.17中对照卵巢组织所得的沉淀），加入线粒体蛋白提取缓冲液（线粒体样品与蛋白提取缓冲液体积比为1:5），重悬沉淀。在液氮中冻融3次，室温下保存2小时。
  4. 在4 °C条件下以12,000 × g离心30分钟，收集上清液（即提取的线粒体蛋白样品），并使用二辛可宁酸（BCA）蛋白定量试剂盒测定蛋白含量。
  5. 通过混合9.08 g Tris和40 mL ddH2O，用HCl调节pH至8.8，再加ddH2O定容至50 mL，配制50 mL 1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）。4 °C保存。
  6. 通过混合6.06 g Tris和40 mL ddH2O，用HCl调节pH至6.8，再加ddH2O定容至50 mL，配制50 mL 1 M Tris-HCl（pH 6.8）。4 °C保存。
  7. 通过混合29 g丙烯酰胺、1 g双丙烯酰胺和80 mL ddH2O，再加ddH2O定容至100 mL，配制100 mL 30%丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液。置于棕色瓶中4 °C保存。
  8. 通过混合29 g甘氨酸、58 g Tris、3.7 g十二烷基硫酸钠（SDS）和800 mL ddH2O，再加ddH2O定容至1,000 mL，配制1,000 mL 10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液。
  9. 通过混合2 mL甘油、0.02 g溴酚蓝、0.4 g SDS、2 mL Tris-HCl（pH 6.8）和7 mL ddH2O，再加ddH2O定容至10 mL，配制10 mL上样缓冲液。
  10. 通过混合4 mL ddH2O、3.3 mL 30%丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液、2.5 mL 1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）、0.1 mL 10% SDS、0.1 mL 10%过硫酸铵和0.004 mL四甲基乙二胺（TEMED），配制10 mL 10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离胶。将SDS-PAGE分离胶溶液倒入玻璃板之间，至梳子底部位置。在胶面上覆盖2 mL异丙醇。静置30分钟。
  11. 去除异丙醇，用ddH2O洗涤上层3次。倒入浓缩胶溶液（含4.1 mL ddH2O、1.0 mL 30%丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液、0.75 mL 1 M Tris-HCl（pH 6.8）、0.06 mL 10% SDS、0.06 mL 10%过硫酸铵和0.006 mL TEMED）。立即插入梳子，静置30分钟后取出梳子。
  12. 将100 mL 10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液用900 mL ddH2O稀释，配制1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，并倒入电泳槽中。
  13. 取步骤3.4中获得的卵巢癌组织和对照卵巢组织线粒体蛋白各30 µg，加入上样缓冲液至终体积20 µL。沸水浴5分钟，然后在100 V恒定电压下使用10% SDS-PAGE分离胶进行电泳分离。当溴酚蓝迁移至凝胶底部时，停止电泳。
  14. 通过混合150 mL 10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液、1,050 mL ddH2O和300 mL甲醇，配制1.5 L电转缓冲液。
  15. 将PVDF膜在100%甲醇中浸泡10分钟，再在电转缓冲液中浸泡至少5分钟。将五张滤纸浸泡于1×电转缓冲液中至少5分钟。
  16. 取出含有蛋白的SDS-PAGE凝胶，置于电转缓冲液中浸泡10分钟。
  17. 从下至上依次放置湿润的海绵、三层湿润滤纸、PVDF膜、含有蛋白的SDS-PAGE凝胶、两层湿润滤纸和湿润海绵，组装转膜夹心结构（转膜夹）。确保无气泡产生。
  18. 将转膜夹放入电泳槽中，加入电转缓冲液，在恒定200 mA电流下转膜2小时。
  19. 通过混合12.114 g Tris、29.22 g NaCl，并加ddH2O定容至500 mL，配制10×Tris缓冲盐水（TBS）储存液。通过混合200 mL 10×TBS、2 mL Tween-20和1,798 mL ddH2O，配制2 L 1×TBST。通过混合100 mL TBST和5 g BSA，配制100 mL封闭液。
  20. 转膜完成后，取出PVDF膜，用TBST轻轻洗涤5分钟，然后在封闭液中室温封闭1小时。
  21. 将PVDF膜与针对不同亚细胞器的特异性一抗在4 °C孵育过夜，包括lamin B（细胞核；山羊抗人抗体，1:1,000稀释于封闭液）、flotillin-1（细胞膜；兔抗人抗体，1:500稀释于封闭液）、COX4I1（线粒体；兔抗人抗体，1:1,000稀释于封闭液）、GM130（高尔基体；小鼠抗人抗体，1:1,000稀释于封闭液）、过氧化氢酶（过氧化物酶体；兔抗人抗体，1:1,000稀释于封闭液）和组织蛋白酶B（溶酶体；兔抗人抗体，1:1,000稀释于封闭液）。用TBST轻轻洗涤5分钟，重复3次。
  22. 将PVDF膜在室温下与相应的二抗（兔抗山羊、山羊抗兔或山羊抗小鼠）孵育1小时。用TBST轻轻洗涤5分钟，重复3次。使用化学发光（ECL）法显影。

4. iTRAQ-SCX-LC-MS/MS 分析

注意：第4节的详细步骤请参见iTRAQ说明书（材料表）。

  1. 向纯化的线粒体样品（即步骤 1.16 来自卵巢癌组织的沉淀物和步骤 2.17 来自对照卵巢组织的沉淀物）中加入 SDT 缓冲液（4% SDS、100 mM Tris-HCl pH 7.6 和 100 mM DTT）。涡旋震荡样品直至无可见沉淀物。
    注意：线粒体样品与 SDT 缓冲液的比例应为 1:5。
  2. 将经 SDT 处理的样品煮沸 5 分钟，然后在冰上冷却，并离心（2,000 × g，2 分钟）。
  3. 收集上清液作为提取的线粒体蛋白样品，并使用 BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白含量。
  4. 取 SDT 提取的线粒体蛋白（每个样品 200 µg）进行还原、烷基化、胰蛋白酶消化、脱盐和冻干3,4。每个样品设三个重复。
  5. 用 100 mM 四乙基溴化铵溶液（pH 8.5）处理步骤 4.4 中获得的胰蛋白酶肽段（每个样品 100 µg），并根据说明书使用 6-plex iTRAQ 试剂之一对肽段进行标记3,4。每个样品标记三次。
  6. 等量混合 6 个标记后的胰蛋白酶肽段样品（三个来自卵巢癌组织，三个来自对照卵巢组织），并用真空浓缩仪干燥。
  7. 通过强阳离子交换色谱（SCX）将混合的 iTRAQ 标记肽段分离为 60 个组分（每分钟收集一个组分），然后将每两个组分合并为一个 SCX 分级样品（n = 30）。
  8. 将每个 SCX 分级样品在质谱仪上进行 LC-MS/MS 分析3,4，联用纳米液相系统，在 60 分钟液相分离梯度内获取 MS/MS 数据。
  9. 利用搜索引擎（材料表）对 MS/MS 数据进行检索以鉴定蛋白质。
  10. 利用 iTRAQ 报告离子强度对每种蛋白质进行定量，并筛选变化倍数 ≥1.5 或 ≤-1.5 且 p 值 >1.5 或 <-1.5 倍、p < 0.05 的线粒体差异表达蛋白（mtDEPs）。

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结果

卵巢癌组织与对照卵巢组织在制备线粒体方面存在差异。本研究发现，从卵巢癌组织中制备线粒体比从对照卵巢组织中制备更为容易3,4。因此，针对对照卵巢组织的线粒体制备方案需进行一些改进。首先，在组织匀浆前，需在已加入PBS溶液的剪碎对照组织中添加8 mL 0.05%胰蛋白酶/20 mM EDTA，室温消化30分钟，随后以200 × g 离心5分钟（见方案步骤2.5），此步骤可提高线粒体制备效果。其次，对照卵巢组织与卵巢癌组织的不连续密度梯度配置不同（图1）。对于卵巢癌组织，按从下到上的顺序在离心管中依次加入5 mL 34%、8 mL 30%、12 mL 25%（含粗线粒体）、8 mL 23%和3 mL 20%的密度梯度介质。离心后，纯化的线粒体位于25%与30%之间的界面处（图1A，见方案步骤1...

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讨论

线粒体改变是卵巢癌的一个显著特征。从人卵巢癌组织及对照组织中制备高质量的线粒体样本，用于大规模定量蛋白质组学研究，有助于深入理解线粒体在卵巢癌发病机制中的功能以及线粒体分子网络的变化，并为进一步基于线粒体发现靶向治疗策略和有效生物标志物阐明其分子机制4,5,8。采用差速离心结合密度梯度离心法，可有效分离和纯化人卵巢癌组织及对照卵巢组织中的线粒体。所制备的线粒体样品纯度高，适用于后续的定量蛋白质组学分析。

制备的线粒体样品中含有少量过氧化物酶体3,17,18和细胞质蛋白19,20。这些成分不应被简单...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由湖南省百人计划（资助编号：X.Z.）、湘雅医院人才引进基金（资助编号：XZ）、国家自然科学基金（资助编号：81572278 和 81272798，授予 XZ）、中国"863"计划项目（资助编号：2014AA020610-1，授予 XZ）以及湖南省自然科学基金（资助编号：14JJ7008，授予 XZ）资助。X.Z. 提出了本论文的研究构想，获取了线粒体样品的 iTRAQ 定量蛋白质组学数据，撰写并修改了论文，协调了相关工作，并负责经费支持与通讯事宜。H.L. 制备了线粒体样品。S.Q. 参与了部分工作。X.H.Z 参与了论文撰写并对英文语言进行了编辑。N.L. 分析了 iTRAQ 蛋白质组学数据。所有作者均批准了最终稿件。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BCA 蛋白检测试剂盒VazymeE112BCA 蛋白检测试剂盒是我们广受欢迎的 BCA 试剂的一种特殊三组分版本，已优化用于测定稀释蛋白溶液（0.5 至 20 微克/毫升）的总蛋白浓度（A562nm）。
牛血清白蛋白（BSA）SolarbioA8020-5G热激组分，澳大利亚来源，无蛋白酶，低脂肪酸，低 IgG，pH 7，≥98%
离心机XiangYiTDZ4--WS
CHAPSSigmaC9426-5G生物试剂，适用于电泳，≥98%（HPLC）（Sigma-Aldrich）
二胺四乙酸（EDTA）Sigma798681-100G无水，自由流动，Redi-Dri，≥98%
DTTSigma101977770011,4-二硫苏糖醇
Easy nLCProxeon Biosystems（现为 Thermo Fisher Scientific）
乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA）SigmaE0396-10GBioXtra，≥97.0%
匀浆器SilentShakeHYQ-3110
iTRAQ 试剂盒Applied BiosystemsApplied Biosystems iTRAQ 试剂–化学参考指南，货号 4351918A
低温超速离心机Eppendorf5424R
甘露醇MacklinM813424-100G甘露醇是一种多元醇（多元醇），由果糖氢化制得，用作甜味剂、保湿剂和填充剂。它具有低吸湿性和较差的油溶性。
MASCOT 搜索引擎Matrix Science，英国伦敦；版本 2.2
NagarseSolarbioP9090
N-羟基琥珀酰亚胺（SDT）Sigma56480-25GPurum，≥97.0%（T）
NycodenzAlere/Axis-Shield1002424-1
苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制剂SolarbioP0100-1MLPMSF 是一种蛋白酶抑制剂，可与丝氨酸残基反应，从而抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶和木瓜蛋白酶。
氯化钾MacklinP816354-25G氯化钾，KCI，又称氯化钾和钾盐，是一种无色结晶固体，具有咸味，熔点为 776°C（1420 OF）。它溶于水，但不溶于酒精。氯化钾用于肥料、制药、摄影以及作为食盐替代品。
Proteome Discoverer 1.4Matrix Science，英国伦敦
PVDF 膜Millipore05317每卷 26.5 cm × 1.875 m，孔径 0.45 µm，疏水性 PVDF 转印膜，背景荧光低，适用于 Western 印迹。兼容可见光和红外荧光探针。
Q Exactive 质谱仪Thermo Fisher Scientific
SCX 柱Sigma58997粒径 5-μm，长度 5 cm × 内径 4.6 mm（Supelco）。
正钒酸钠（V）MacklinS817660-25G正钒酸钠（钒酸盐）是一种广谱的竞争性蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂。加入 EDTA 或稀释后，正钒酸钠的抑制作用可逆。
蔗糖MacklinS824459-500GVetec 试剂级，99%
硫脲Sigma62-56-6ACS 试剂，≥99.0%
Tris 碱Sigma10708976001Tris 碱在 pH 7.0–9.0 范围内有效。在 25°C 时 pKa 为 8.1。
胰蛋白酶（细胞培养用）Gibco25200-056该液体形式的胰蛋白酶含有 EDTA 和酚红。Gibco 胰蛋白酶-EDTA 由胰蛋白酶粉末制成，是一种经辐照处理的来源于猪胰腺的蛋白酶混合物。由于其较强的消化能力，胰蛋白酶广泛用于细胞解离、常规细胞传代培养以及原代组织解离。
尿素SigmaU5378-100G粉末，生物试剂，适用于分子生物学，可用于细胞培养

参考文献

  1. Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites. Journal of Ovarian Research. 10, 57(2017).
  2. Gadducci, A., et al. Surveillance procedures for patients treated for epithelial ovarian cancer: a review of the literature. International Journal of Gynecological Cancer. 17, 21-31 (2007).
  3. Li, N., Li, H., Cao, L., Zhan, X. Quantitative analysis of the mitochondrial proteome in human ovarian carcinomas. Endocrine-Related Cancer. 25, 909-931 (2018).
  4. Li, N., Zhan, X., Zhan, X. The lncRNA SNHG3 regulates energy metabolism of ovarian cancer by an analysis of mitochondrial proteomes. Gynecologic Oncology. 150, 343-354 (2018).
  5. Li, N., Zhan, X. Signaling pathway network alterations in human ovarian cancers identified with quantitative mitochondrial proteomics. EPMA Journal. 10, 153-172 (2019).
  6. Deng, P., Haynes, C. M. Mitochondrial dysfunction in cancer: Potential roles of ATF5 and the mitochondrial UPR. Semin Cancer Biology. 47, 43-49 (2017).
  7. Georgieva, E., et al. Mitochondrial dysfunction and redox imbalance as a diagnostic marker of "free radical diseases". Anticancer Research. 37, 5373-5381 (2017).
  8. Sotgia, F., et al. A mitochondrial based oncology platform for targeting cancer stem cells (CSCs): MITO-ONC-RX. Cell Cycle. 17, 2091-2100 (2018).
  9. Lee, J. H., et al. Individualized metabolic profiling stratifies pancreatic and biliary tract cancer: a useful tool for innovative screening programs and predictive strategies in healthcare. EPMA Journal. 9, 287-297 (2018).
  10. Zhan, X., Long, Y., Lu, M. Exploration of variations in proteome and metabolome for predictive diagnostics and personalized treatment algorithms: Innovative approach and examples for potential clinical application. Journal of Proteomics. 188, 30-40 (2018).
  11. Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA Journal. 9, 77-102 (2018).
  12. Hu, R., Wang, X., Zhan, X. Multi-parameter systematic strategies for predictive, preventive and personalised medicine in cancer. EPMA Journal. 4, 2(2013).
  13. Cheng, T., Zhan, X. Pattern recognition for predictive, preventive, and personalized medicine in cancer. EPMA Journal. 8, 51-60 (2017).
  14. Zhan, X., Zhou, T., Li, N., Li, H. The differentially mitochondrial proteomic dataset in human ovarian cancer relative to control tissues. Data in Brief. 20, 459-462 (2018).
  15. McMillan, J. D., Eisenback, M. A. Transmission electron microscopy for analysis of mitochondria in mouse skeletal muscle. Bio-protocol. 8, e2455(2018).
  16. Paul, P. K., et al. Targeted ablation of TRAF6 inhibits skeletal muscle wasting in mice. Journal of Cell Biology. 191, 1395-1411 (2010).
  17. Pascual-Ahuir, A., Manzanares-Estreder, S., Proft, M. Pro- and antioxidant functions of the peroxisome-mitochondria connection and its impact on aging and disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 9860841(2017).
  18. Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. Peroxisome-mitochondria interplay and disease. Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).
  19. Bartolák-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors. International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812(2017).
  20. Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells. Molecular & Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).
  21. Zhan, X., et al. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome? Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).
  22. Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms. Med One. 3, e180008(2018).

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