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方法文章

从产前 Islmn:GFP 转基因小鼠中分离与培养动眼神经、滑车神经及脊髓运动神经元

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DOI：

10.3791/60440

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2019年11月12日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Boston Children's Hospital, 2FM Kirby Neurobiology Center, Boston Children's Hospital, 3Department of Neurology, Harvard Medical School, 4Medical Genetics Training Program, Harvard Medical School, 5Department of Ophthalmology, Boston Children's Hospital, 6Department of Ophthalmology, Harvard Medical School, 7Broad Institute of M.I.T. and Harvard, 8Howard Hughes Medical Institute, 9Department of Neurology, Kokura Memorial Hospital, 10Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine

本文内容

摘要

本研究提出了一种用于获得均一的原代动眼神经、滑车神经及脊髓运动神经元细胞培养物的实验方案。这些细胞培养物可用于比较分析眼外肌运动神经元与脊髓运动神经元在形态学、细胞学、分子生物学以及电生理学特性方面的差异。

摘要

动眼神经元（CN3s）和滑车神经元（CN4s）相较于脊髓运动神经元（SMNs），在肌萎缩侧索硬化症（ALS）等变性运动神经元疾病中表现出显著的抗变性能力。分离并培养原代小鼠CN3s、CN4s及SMNs的能力，将为研究这种选择性易损性的机制提供有效途径。迄今为止，大多数实验方案依赖于异质性细胞培养，这可能干扰实验结果的解读。为最大限度减少混合细胞群体带来的问题，纯化培养体系至关重要。本文首次详细描述了一种高效纯化和培养CN3s/CN4s以及来自同一批胚胎的SMNs的实验方案，所用材料为胚胎第11.5天（E11.5）的IslMN:GFP转基因小鼠胚胎。该方案详述了组织解剖与解离、基于流式细胞分选（FACS）的细胞分离，以及来自CN3/CN4和SMN核团细胞的体外培养步骤。本方案在现有方法基础上新增了一种全新的体外CN3/CN4培养体系，同时提供了物种和年龄匹配的纯SMN培养体系用于对照比较。在此培养系统中，可对运动神经元的形态学、细胞学、分子学及电生理学特性进行分析。该方案将推动关于运动神经元发育机制、选择性易损性及其相关疾病的研究。

引言

原代运动神经元的培养是一种强大的工具，可用于研究神经元的发育、功能以及对外源性应激因子的易感性。运动神经元培养对于研究肌萎缩侧索硬化症（ALS）等神经退行性疾病尤其有用1,2，而这类疾病的发病机制尚未完全阐明。有趣的是，尽管在ALS患者和ALS模型小鼠中脊髓运动神经元（SMNs）存在显著的细胞死亡，动眼神经元（CN3s）和滑车神经元（CN4s）的细胞死亡则相对较少1,3,4,5,6,7,8,9。因此，对CN3s/CN4s和SMNs的纯化培养物进行比较分析，可能为揭示其相对易损性的机制提供重要线索。然而，此类分析面临的主要障碍在于无法培养出这些运动神经元的纯化细胞群。

已有多种方案被用于从动物模型中纯化脊髓运动神经元（SMNs）。大多数方案采用密度梯度离心法10,11,12 和/或基于p75NTR抗体的细胞分选平皿技术13,14,15,16。密度梯度离心法利用了SMNs相对于其他脊髓细胞体积较大的特性，而p75NTR是脊髓中仅由SMNs特异性表达的一种细胞外蛋白。通过上述一种或两种方法，已成功获得接近100%纯度的SMN培养物11,12,14。然而，这些方案在制备CN3/CN4培养物时未能成功，因为CN3s/CN4s不表达p75NTR，且目前尚未鉴定出其他特异性的CN3/CN4标记物。此外，CN3s/CN4s体积小于SMNs，因此基于大小进行分离更为困难。目前对CN3s或CN4s的体外研究主要依赖于解离培养17,18,19,20,21、组织块培养17,22,23,24,25,26以及脑片培养27,28，但这些培养体系包含多种不同类型的细胞，尚无可用于原代CN3s或CN4s分离与培养的成熟方案。

本文描述了一种从同一批胚胎第11.5天（E11.5）的IslMN:GFP转基因小鼠中可视化、分离、纯化和培养CN3s、CN4s及SMNs的实验方案29（图1，图2A）。IslMN:GFP通过一种定位于细胞膜的法呢基化GFP特异性地标记运动神经元。该方案可实现对多种类型运动神经元在物种和年龄匹配条件下的比较，从而有助于阐明运动神经元疾病的病理机制。

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方案

所有利用实验动物进行的实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物护理与使用的指南，并经波士顿儿童医院动物护理与使用委员会批准。

1. 解剖前设置定时交配

  1. 为获取用于运动神经元分离的产前胚胎小鼠，称量每只雌性小鼠，并在神经元分离日前11.5天安排成年IslMN:GFP转基因小鼠进行定时交配。本方案开发过程中使用了2−9月龄的129S1/C57BL/6J IslMN:GFP小鼠，并于傍晚安排定时交配。
  2. 次日上午检查雌性小鼠是否存在阴道栓。将发现阴道栓的当天记为胚胎发育第（E）0.5天。
  3. 在E8.5至E11期间，称量雌性小鼠并使用超声波仪（见材料表）检查是否怀孕，以确认交配成功。
    1. 通过检测雌性小鼠体重增加来确认交配成功（若胚胎数量超过5−6个，通常在E9.5时体重增加>1.5 g）。
    2. 通过超声波直观确认胚胎存在。胚胎在E9.5之后可通过超声波清晰检测。超声检查仅针对体重增加的雌性小鼠进行，因其更可能已怀孕。
      注意：雌性小鼠体重增加可能由非妊娠因素引起，因此仅凭体重增加不能可靠判断是否妊娠。超声确认可避免不必要的非妊娠雌鼠牺牲，但在缺乏设备时并非必需步骤。

2. 解剖条件与器械准备

  1. 除盖玻片的酸洗步骤外，所有包被、培养基制备、组织解离（离心和孵育除外）以及培养操作均应在超净工作台内进行，以确保培养基和胚胎运动神经元的无菌性。
  2. 在注意无菌操作的前提下，组织解剖可在超净工作台外进行，但应尽量降低污染风险。
  3. 使用前将一个解剖板、一把显微解剖剪、一把拇指镊、两把Dumont #5镊子、一把显微解剖刀和一把Moria迷你带孔勺浸入70%乙醇中进行灭菌。

3. 培养皿/盖玻片的PDL/层粘连蛋白包被

注意：根据实验所需细胞数量，将解离的原代运动神经元培养于96孔板或24孔板中。若培养板孔具有光学透明性且厚度适合成像，则无需使用盖玻片，可直接在组织培养板中对细胞进行成像。

  1. 对于需要使用盖玻片的应用，应在神经元分离前至少2天，按照先前所述方法准备经酸清洗、灭菌并空气干燥的盖玻片30。盖玻片批次可提前较长时间制备，并可在不影响实验质量的情况下储存长达6个月。
  2. 在神经元分离前2天，用磷酸盐缓冲液（PBS）配制20 µg/mL的多聚D-赖氨酸（PDL）工作液。
    1. 提前将PDL（1 mg/mL）分装，并作为储备液储存于-20 °C。
  3. 用足量的PDL工作液覆盖每张盖玻片表面或组织培养板的孔（例如，在96孔板中每孔100 µL，或在24孔板中每孔500 µL，无论是否含有盖玻片），于37 °C孵育过夜。
  4. 次日用无菌水洗涤3次。
    1. 用封口膜密封培养板，若最后一次洗涤后盖玻片完全干燥，则可将PDL包被的培养板在4 °C保存长达1个月。
  5. 用1.2 mL PBS溶解10 µL层粘连蛋白（laminin，1.1−1.2 mg/mL），配制工作液。
    1. 提前将层粘连蛋白储备液（1.1−1.2 mg/mL）分装，并储存于-80 °C。
  6. 用足量的层粘连蛋白溶液覆盖每张盖玻片或每个孔的表面，确保均匀包被。使用前于37 °C孵育至少2小时。
    注意： PDL/层粘连蛋白包被的培养板和盖玻片可在37 °C保存最多1周，但建议使用新鲜包被的层粘连蛋白。接种细胞前应直接去除层粘连蛋白溶液30。层粘连蛋白不得干燥。若培养板需保存超过数小时，应使用封口膜包裹。

4. 解剖、运动神经元培养基及解离溶液的制备

注意： 括号中的浓度表示每种试剂的最终浓度。

  1. 准备解剖培养基。
    1. 将热灭活的马血清在 4 °C 下过夜解冻，分装成 1 mL 的等分试样，并于 -20 °C 保存。使用前在室温下直接解冻等分试样。
    2. 将 B27 补充剂（50 倍浓度）以 1 mL 等分试样在 -20 °C 下保存。使用前立即在室温下解冻。避免反复冻融。
    3. 将谷氨酰胺补充剂（100 倍浓度）保存在 4 °C 或 -20 °C。若在 -20 °C 保存，可分装为 0.5 mL 等分试样。
    4. 将青霉素-链霉素（10,000 U/mL）以 1 mL 等分试样在 -20 °C 下保存。使用前立即在室温下解冻等分试样。
    5. 配制解剖培养基：将 9.4 mL Hibernate E 培养基与 200 µL 马血清（2%）、200 µL 50 倍 B27 补充剂（1 倍浓度）、100 µL 100 倍谷氨酰胺补充剂（1 倍浓度）（例如 GlutaMAX）以及 100 µL 10,000 U/mL 青霉素-链霉素（终浓度 100 U/mL）混合。该培养基用于收集解剖组织及制备解离细胞的终末悬液。
    6. 在神经元分离前一天，向各个 1.7 mL 微量离心管中分别加入 500 µL 解剖培养基，用于组织收集。每种待收集的组织类型（例如阳性对照、阴性对照、CN3/CN4、SMN）各准备一管，并在使用前于 4 °C 保存。
    7. 将 49 mL 低荧光 Hibernate E 培养基与 1 mL B27 补充剂（1 倍浓度）混合，并于神经元分离前一天将该培养基加入 24 孔板中（每孔 2 mL）。此培养皿用于收集小鼠胚胎。使用前于 4 °C 保存。
  2. 准备运动神经元培养基。
    1. 将 2-巯基乙醇（25 mM）用 Leibovitz's L15 培养基配制成 250 µL 等分试样。于 -20 °C 保存。
    2. 将 BDNF、CNTF 和 GDNF 分别用无菌水稀释成 100 µg/mL 的溶液，并分装为 5 µL 等分试样。于 -80 °C 保存，使用前立即在室温下解冻。
    3. 将 64 µL 二甲基亚砜（DMSO）加入 5 mg（1.0670 µM）佛司可林中，充分涡旋至完全溶解。然后向 DMSO 溶液中加入无菌水（1.003 mL），再次充分涡旋。将 10 mM 佛司可林溶液分装为 12 µL 等分试样，于 -20 °C 保存，使用前立即在室温下解冻。
    4. 将异丁基甲基黄嘌呤（IBMX）用 DMSO 稀释成 100 mM 溶液，并分装为 12 µL 等分试样。于 -20 °C 保存，使用前立即在室温下解冻。
    5. 配制运动神经元培养基：将 9.4 mL Neurobasal 培养基与 200 µL 马血清（2%）、200 µL 50 倍 B27 补充剂（1 倍浓度）、100 µL 100 倍谷氨酰胺补充剂（1 倍浓度）、100 µL 10,000 U/mL 青霉素-链霉素（终浓度 100 U/mL）以及 20 µL 25 mM 2-巯基乙醇（终浓度 50 µM）混合，建议在使用前立即配制。此步骤可在神经元分离前最多 1 天完成。
    6. 使用前，向运动神经元培养基中加入 BDNF（100 µg/mL）1 µL（终浓度 10 ng/mL）、CNTF（100 µg/mL）1 µL（终浓度 10 ng/mL）、GDNF（100 µg/mL）1 µL（终浓度 10 ng/mL）、10 mM 佛司可林 10 µL（终浓度 10 µM）以及 100 mM IBMX 10 µL（终浓度 100 µM）。将培养基预热至 37 °C。
  3. 准备解离溶液。
    1. 根据制造商说明书配制木瓜蛋白酶溶液（20 U/mL 木瓜蛋白酶和 0.005% DNase）和白蛋白-卵黏蛋白抑制剂溶液（1 mg/mL 卵黏蛋白抑制剂、1 mg/mL 白蛋白和 0.005% DNase）。
    2. 将卵黏蛋白抑制剂溶液和木瓜蛋白酶溶液分别分装为 500 µL 等分试样，并于 -80 °C 保存。使用前立即在 37 °C 下解冻。

5. 腹侧中脑和脊髓解剖

注意：除步骤 5.1.1−5.1.3 和 5.1.5−5.1.6 外，其余所有步骤均需在荧光解剖体视显微镜下进行。每次实验的总解剖时间通常为 3−5 小时，具体时长取决于解剖技术的熟练程度以及每个实验所需的运动神经元数量。

  1. 腹侧中脑解剖
    1. 使用二氧化碳气体结合颈椎脱位法处死一只受孕约11.5天的小鼠。
    2. 用乙醇彻底喷洒腹部，使用无菌显微解剖剪和有齿镊取出子宫。将子宫在无菌PBS中短暂清洗后，转移至盛有预冷无菌PBS的解剖板中。
    3. 在显微镜强光下，于冰上无菌PBS中，使用无菌显微解剖剪、有齿镊和Dumont #5镊子小心地从子宫中取出IslMN:GFP阳性胚胎。使用无菌Moria微型穿孔勺将每个胚胎转移至24孔板的独立孔中，孔内含有添加了1× B27的预冷低荧光Hibernate-E培养基。将24孔板置于冰上保存。
    4. 将一个胚胎转移至无菌解剖板，并完全覆盖冰上预冷的无菌Hank's平衡盐溶液（HBSS）。
    5. 确保解剖步骤在显微镜的异硫氰酸荧光素（FITC）照明下进行。使用镊子去除胚胎的尾部和面部，注意不要损伤中脑（图2Ba）。将胚胎腹侧朝下放置，四肢分开于下方，尾部朝向显微镜前方，即解剖者方向（以星号标示，图2Bb）。
    6. 使用镊子切开第四脑室顶部，形成一个小开口。利用该开口将镊子插入第四脑室与其顶部之间的空隙。沿胚胎背侧表面，从大脑皮层前方、底板和运动柱外侧进行解剖（图2Ca,b）。将解剖后的组织以“摊开书本”方式展开，以暴露GFP阳性的动眼神经核（CN3）和滑车神经核（CN4）。
      注意： 此时将暴露出一块包含间充质、CN3和CN4的腹侧中脑小组织块。
    7. 使用镊子和显微解剖刀小心地将腹侧中脑从胚胎中分离，并去除脑膜组织。使用镊子和显微解剖刀将双侧GFP阳性的CN3和CN4核团从底板及其他GFP阴性周围组织中分离出来（图2D）。在切除组织中尽可能保留更多的GFP阳性运动神经元，但避免触碰或损伤这些细胞。
    8. 若需分别收集CN3和CN4核团，可沿这两个核团的中线（图2D中黄色虚线）进行切割。使用P1000移液器收集解剖所得的腹侧中脑组织，尽量减少HBSS的携带量，并将其放入预先标记的盛有解剖液的1.7 mL微量离心管中（见步骤4.1.5）。置于冰上保存，直至进行组织解离。
    9. 继续将来自其他胚胎的腹侧中脑组织汇集至同一离心管中，直至总数满足实验需求（参见步骤8以获取理想细胞数量）。
      注意： 建议至少汇集10个腹侧中脑组织，以获得约1 × 104个CN3/CN4运动神经元，因为组织在解离和分选过程中会受到应激影响。
  2. 腹侧脊髓解剖
    1. 将胚胎保持腹侧朝下，头部朝向显微镜前方，即解剖者方向。用一对镊子固定胚胎，并将另一对镊子的尖端插入未打开的第四脑室尾侧部分。
    2. 沿胚胎头尾轴全长，从第四脑室开始，使用镊子作为剪刀，向尾侧脊髓中央管方向剪开背侧组织，从而完全打开后脑和脊髓的背侧（图2Ca,b）。操作过程中注意避免触碰或损伤腹侧脊髓。
    3. 用一对镊子固定胚胎，用另一对镊子从两侧夹除背侧组织瓣（图2Ea,b）。
      注意： 切除的背侧组织包含背侧皮肤、间充质、背根神经节（DRGs）、背侧后脑及脊髓。应尽可能去除这些组织，但不得损伤SMN核团，因为这些组织具有黏附性，可能在过滤或FACS分选过程中捕获SMN或造成堵塞。
    4. 使用显微解剖刀直接在GFP阳性的SMN下方穿刺，以取出腹侧脊髓。通过两侧锯齿状动作抬起腹侧脊髓（图2Fa,b）。在C1节段上方横向切断漂浮的腹侧脊髓，此处为第一个GFP阳性前角突起的位置（图2G）。同时在下肢上界处进行横向切断（图2G）。完成上述操作后，取出从颈段（C1）至腰段（L2-L3）的腹侧脊髓部分。
    5. 将腹侧脊髓背侧朝上放置，用一对镊子夹住GFP阳性SMN柱之间的GFP阴性组织以固定。使用显微解剖刀修剪GFP阳性SMN柱的两侧，去除残留的间充质、DRGs和背侧脊髓组织（图2H）。注意在不损伤细胞的前提下，尽可能保留GFP阳性运动神经元。
    6. 使用P1000移液器收集解剖所得的腹侧脊髓组织，尽量减少HBSS的携带量，并放入标记为SMN的盛有解剖液的1.7 mL微量离心管中。置于冰上保存，直至进行组织解离。继续将来自其他胚胎的腹侧脊髓组织汇集至同一离心管中，直至总数满足实验需求。
      注意： 建议至少收集三个腹侧脊髓组织，以获得约2.1 × 104个SMN，因为组织在解离和分选过程中会受到应激影响。
    7. 收集IslMN:GFP小鼠胚胎的面神经运动核及四肢组织，分别作为荧光激活细胞分选（FACS）中的GFP阳性和GFP阴性对照。四肢为GFP阴性，因为在此胚胎发育阶段，SMN的GFP阳性轴突尚未延伸至四肢。

6. 组织解离

注意：每次实验的总解离时间通常为 1.5 小时。

  1. 在解离前30分钟，将木瓜蛋白酶（papain）和白蛋白-卵黏蛋白抑制剂溶液分装物预热至37 °C。
  2. 将显微解剖的组织在低速下短暂离心。
  3. 使用P100移液器小心吸除尽可能多的Hibernate E培养基，避免吸取组织。
    注意：此步骤后务必彻底去除残留的Hibernate E，以免影响下一步木瓜蛋白酶解离的效果。
  4. 向每个含有显微解剖组织样本的1.7 mL微量离心管中加入适量体积的木瓜蛋白酶溶液（表1）。
    注意：木瓜蛋白酶的适宜用量已通过优化确定，旨在最大化解离效率的同时尽量减少对细胞的损伤。
  5. 使用P200移液器轻柔吹打8次。所有吹打操作均应轻柔进行，以保持运动神经元的活性。
  6. 将含有组织的离心管在37 °C孵育30分钟，每隔10分钟用手轻弹管壁振荡10次。孵育结束后，用P200移液器对每份悬液轻柔吹打8次，然后在300 × g下离心5分钟。
  7. 为确保下一步卵黏蛋白抑制的有效性，使用P1000移液器尽可能吸除上清液并弃去，注意避免吸取组织沉淀。
  8. 用适量体积的白蛋白-卵黏蛋白抑制剂溶液（表1）重悬沉淀，使用P200移液器轻柔吹打8次。
  9. 静置2分钟，使任何未完全解离的组织碎片沉降至管底。
  10. 使用P200移液器尽可能收集上清液，避免吸取未解离的组织，将上清液转移至新的1.7 mL微量离心管中。
  11. 若在步骤6.10后仍有部分组织块未解离，可对原始1.7 mL微量离心管中残留的未解离组织重复执行步骤6.8−6.10，以最大限度提高最终解离细胞的得率，同时避免对已在步骤6.10上清液中解离的细胞造成额外损伤。
  12. 在300 × g下离心5分钟，沉淀细胞。使用P1000移液器小心吸除并弃去上清液。
  13. 用适量体积的解剖培养基（表1）重悬沉淀，使用P1000移液器吹打8次。最终悬液的适宜体积已确定，以确保细胞密度不超过107个/mL（防止堵塞流式细胞仪液流），同时避免细胞过度稀释导致分选速度下降。
  14. 将细胞悬液通过70 µm细胞滤网过滤，以去除任何大块聚集体或未消化的组织。将滤过的悬液转移至5 mL圆底聚苯乙烯试管中，置于冰上保存备用。

7. 荧光激活细胞分选（FACS）

注意：本实验方案使用配备15 mW 405 nm紫色激光、100 mW 488 nm蓝色激光、75 mW 594 nm橙色激光和40 mW 640 nm红色激光的流式细胞分选仪进行优化。细胞在无菌PBS中作为鞘液，在无菌条件下通过100 µm喷嘴进行分选。为尽量减少细胞应激，设置样品压力为1−3，使每秒获取的事件数最多为1,000−4,000个。每次实验的总流式分选时间通常为1−2小时。

  1. 设置前向散射和侧向散射的电压，以便正确可视化细胞群体。为细胞分选设置合适的电压较为复杂，需要经验丰富的流式细胞分选（FACS）操作人员。
  2. 为了区分不同的细胞群体，根据前向散射面积（FSC-A）反映的细胞大小与侧向散射面积（SSC-A）反映的细胞内部复杂性对细胞进行作图。在图3Aa和图Ba所示位置围绕活细胞绘制门控区域，以排除碎片和死细胞。将门控区域内细胞归为群体1（P1）。
  3. 为排除细胞团块和双联体，接下来根据侧向散射宽度（SSC-W）与侧向散射面积（SSC-A）对P1细胞进行作图。将单细胞群体设门为群体2（P2）（图3Ab和图Bb）。
  4. 根据前向散射宽度（FSC-W）与前向散射面积（FSC-A）对P2细胞进行作图，并将单细胞群体设门为群体3（P3）（图3Ac和图Bc）。
    注：步骤7.3和7.4中连续使用两个门控可排除细胞团块和双联体（高FSC-W和高FSC-A）。
  5. 根据GFP与别藻蓝蛋白（APC）信号对P3细胞设门。APC通道用于检测自发荧光，对该通道设门可避免捕获自发荧光细胞。使用GFP阴性细胞调整FITC/GFP荧光通道的电压。理想情况下，这些细胞群体的门控位置应设在约102处。针对每种运动神经元类型，分别设定GFP阳性群体4（P4）的门控阈值（图3Ad和图Bd）。
    注：为获得高纯度培养物，脊髓运动神经元（SMNs）的GFP门控应显著高于CN3s/CN4s（图3Ad和图Bd）。若SMN培养中使用较低的GFP门控，会导致胶质细胞和非运动神经元污染。这可能是由于部分胶质细胞和非运动神经元中存在启动子渗漏，导致低水平GFP表达。GFP阳性细胞占总细胞的比例通常为：CN3s/CN4s为0.5−1.5%，SMNs为1.5−2.5%。若解剖操作成功，这些数值可作为参考基准，用于确定GFP阳性门控的合适位置（图3Ae和图Be）。
  6. 按照制造商的操作说明进行流式细胞分选（FACS）。将P4细胞收集至预先加入500 µL运动神经元培养基的新鲜1.7 mL微量离心管中。收集后置于冰上保存，直至接种。
    注：尽管可将细胞直接分选至孔板中，但这会导致每孔细胞数量不均。建议先将细胞分选至1.75 mL微量离心管，再手动接种，以获得更均匀的细胞分布。

8. 纯化原代运动神经元的培养

  1. 将FACS分离的CN3/CN4和SMN悬液用预热至37 °C的运动神经元培养基分别稀释至浓度为5 × 103 和1 × 104 个细胞/mL。
    注意：一个E11.5胚胎大约可获得1 × 103 个CN3/CN4细胞和7 × 103 个SMN细胞。然而，实际得率在很大程度上取决于解剖组织的纯度、细胞解离的充分性以及FACS过程中GFP门控阈值设置的准确性。
  2. 将预先包被多聚赖氨酸（PDL）和层粘连蛋白（laminin）的96孔板从37 °C细胞培养孵箱转移至超净工作台，吸除每孔中的层粘连蛋白溶液。请立即使用该板和盖玻片，无需洗涤。
  3. 向PDL/层粘连蛋白包被的96孔板每孔中加入200 µL稀释后的CN3/CN4和SMN悬液。最终每孔细胞密度应分别为CN3/CN4：1 × 103 个细胞/孔，SMN：2 × 103 个细胞/孔。
    注意：在96孔板中，SMN的初始接种密度（2 × 103 个细胞/孔）是CN3/CN4（1 × 103 个细胞/孔）的两倍，目的是在体外培养第2天和第9天（DIV）获得相近的最终运动神经元数量和密度（分别为每孔4−6 × 102 和2−4 × 102 个细胞）。
  4. 将神经元置于37 °C、5% CO2 的孵箱中进行培养。
  5. 每5天换液一次，移除一半旧培养基（100 µL），并补充等体积的新鲜运动神经元培养基。确保在体外培养第1天（1 DIV）可见神经元突起，在第14天（14 DIV）时突起变得更粗更长（图4）。在长期培养中，神经元胞体增大，并倾向于聚集，尤其是SMN（图4）。
    注意：所有培养基和溶液更换操作均应保留一半原始培养基体积，以避免培养细胞脱落。此原则同样适用于固定和免疫细胞化学（ICC）步骤。若完全移除培养基，无论操作多么轻柔，大多数细胞都会脱落并被冲洗掉。

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结果

本方案旨在长期高度纯化并培养原代CN3s/CN4s和SMNs，以实现对运动神经元疾病潜在机制的比较分析（概述见图1和图2）。

神经元成功分离并在培养中生长后，获得了近乎纯的原代CN3/CN4和SMN培养物（图5A，B），并至少维持了14天体外培养（DIV）（图4 和 图6）。在2 DIV时，通过使用运动神经元标志物Islet1和神经元标志物TUJ1进行免疫细胞化学（ICC）检测，CN3/CN4和SMN培养物的纯度分别为93.5 ± 2.2%和86.7 ± 4.7%（图5

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讨论

传统上，对 CN3 和/或 CN4 运动神经元的体外研究依赖于异质性培养，例如分散培养17,18,19,20,21、外植体培养17,22,23,24,25,26以及脑片培养27,28，因为这些细胞无法根据大小...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢 Brigitte Pettmann（美国马萨诸塞州剑桥市 Biogen 公司）在 SMN 解剖技术方面提供的指导；感谢达纳-法伯癌症研究所流式细胞术实验室、哈佛医学院免疫学部流式细胞术实验室、乔斯林糖尿病中心流式细胞术核心实验室、布莱根妇女医院流式细胞术核心实验室以及波士顿儿童医院流式细胞术研究设施在原代运动神经元 FACS 分选方面的支持；感谢 A.A. Nugent、A.P. Tenney、A.S. Lee、E.H. Nguyen、M.F. Rose、Engle 实验室其他成员以及 Project ALS 合作组织成员在技术协助和深入讨论方面提供的帮助。本研究由 Project ALS 资助。此外，R.F. 获得日本心脏基金会/Bayer Yakuhin 海外研究基金以及美国国立卫生研究院遗传学培训项目（T32 GM007748）资助；J.J. 获得美国国立卫生研究院眼科研究所（NEI）通过 Schepens 眼科研究所资助的眼科疾病分子基础培训项目（5T32EY007145-16）以及通过波士顿儿童医院资助的发育神经病学培训项目博士后奖学金（5T32NS007473-19）支持；M.C.W. 获得眼科研究所（NEI，5K08EY027850）和儿童医院眼科基金会（Faculty Discovery Award）资助；E.C.E. 为霍华德·休斯医学研究所研究员。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠 IgG（H+L）赛默飞世尔科技A-110011:400
Alexa Fluor 594 标记的 F(ab')2 片段山羊抗兔 IgG (H+L)赛默飞世尔科技A-110721:400
B27 补充剂（50 倍浓缩，无血清）赛默飞世尔科技17504-044
BD FACSAria llu SORP 流式细胞仪BD生物科学-配备405、488、594和640 nm激光器的四激光系统。
BD Falcon 70μm 尼龙细胞筛CORNING352350用于在流式细胞术分选前过滤解离的细胞。
BD Falcon 圆底带盖 snap 盖试管CORNING352054
BDNF 人源ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.CYT-207
细胞培养微孔板，96孔，聚苯乙烯，F型底（烟囱孔）Greiner Bio-One International655090我们尝试了多种96孔板，此款在免疫细胞化学检测前的培养和分析中效果最佳
用于显微镜的圆形盖玻片Karl Hecht &和助手1001/14我们选用这种盖玻片是因为其面积较大（直径：14 mm）。
CNTF 人源ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.CYT-272
环匹阿酸来自 Penicillium cyclopiumSigma-AldrichC1530CPA。一种内质网应激诱导剂。
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）赛默飞世尔科技D1306
二甲基亚砜Sigma-AldrichD2650DMSO
Dumont #5 镊子，不锈钢尖端，尺寸 0.05 mm × 0.01 mm，Biologie 尖头Roboz 外科手术器械RS-5015
Forskolin赛默飞世尔科技BP25205
GDNF 人源ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd.CYT-305
GlutaMAX 补充剂赛默飞世尔科技35050-061
汉克斯’ 平衡盐溶液（HBSS）赛默飞世尔科技14175-095
Hibernate EBrainBits苏木精-伊红
低荧光 Hibernate E 培养基BrainBitsHELF应降低干扰胚胎GFP表达观察的荧光。
马血清，热灭活，新西兰来源赛默飞世尔科技26050-070
IBMXTocris Cookson2845异丁基甲基黄嘌呤
层粘连蛋白赛默飞世尔科技23017-015
莱博维茨’L15 培养基赛默飞世尔科技11415064
2-巯基乙醇Sigma-AldrichM6250
显微解剖剪Roboz 外科手术器械RS-5913
Micro Knife 4.75" 1.7 mm × 27 mm 刀片Roboz 外科手术器械RS-6272
Moria 迷你穿孔匙Fine Science Tools10370-19
神经元III类小鼠单克隆抗体 β微管蛋白（TUBB3）BioLegend8012021:500，TUJ1
尼康Perfect Focus Eclipse Ti活细胞荧光显微镜及Elements软件尼康-使用这些设备采集了细胞培养物的微分干涉差显微图像和免疫细胞化学图像
硝酸 90%，发烟（符合美国化学会标准）Fisher ScientificA202-212用于冲洗盖玻片
奥林巴斯 1.7 mL 微量离心管，透明Genesee Scientific22-281这些是我们之前描述过的试管 "1.7 mL 微量离心管" 在该背景下。
木瓜蛋白酶解离系统沃辛顿生化公司LK003150使用该试剂盒配制木瓜蛋白酶溶液和白蛋白-卵黏蛋白抑制剂溶液。
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）赛默飞世尔科技15140-122
磷酸盐缓冲液（PBS）赛默飞世尔科技10010-023
聚D-赖氨酸（PDL）MilliporeSigmaA-003-E
兔单克隆抗体 Islet1Abcamab1095171:200
SMZ18 和 SMZ1500 变焦体视显微镜配 DS-Ri1 相机尼康-解剖操作完成后，在这些荧光显微镜下拍摄解剖后的胚胎和组织图像。
Sylgard 170 黑色硅胶封装材料 - A+B 0.9 kg 套件道康宁1696157我们使用该试剂盒制备解剖培养皿。
TC处理培养皿，100 mm × 20 mmGenesee Scientific25-202我们使用这种培养皿制作解剖用培养皿。
桑氏敷料镊 4.5" 锯齿状，2.2 mm 尖端宽度Roboz 外科手术器械RS-8100
LOGOQ e VET 转导器GE HealthcareL8-18i-RS对雌性小鼠进行超声检查
兽用超声波仪GE HealthcareLOGOQ e VET对雌性小鼠进行超声检查
蔡司LSM 700系列激光扫描共聚焦显微镜与Zen软件卡尔·蔡司-使用以下设备拍摄了胚胎的共聚焦图像

参考文献

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动眼神经元滑车神经元Isl1-GFP 小鼠FACS 细胞分离组织解剖原代神经元培养运动神经元纯化胚胎第11.5天GFP阳性细胞
从产前 Islmn:GFP 转基因小鼠中分离与培养动眼神经、滑车神经及脊髓运动神经元
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