本研究提出了一种用于获得均一的原代动眼神经、滑车神经及脊髓运动神经元细胞培养物的实验方案。这些细胞培养物可用于比较分析眼外肌运动神经元与脊髓运动神经元在形态学、细胞学、分子生物学以及电生理学特性方面的差异。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
动眼神经元（CN3s）和滑车神经元（CN4s）相较于脊髓运动神经元（SMNs），在肌萎缩侧索硬化症（ALS）等变性运动神经元疾病中表现出显著的抗变性能力。分离并培养原代小鼠CN3s、CN4s及SMNs的能力，将为研究这种选择性易损性的机制提供有效途径。迄今为止，大多数实验方案依赖于异质性细胞培养，这可能干扰实验结果的解读。为最大限度减少混合细胞群体带来的问题，纯化培养体系至关重要。本文首次详细描述了一种高效纯化和培养CN3s/CN4s以及来自同一批胚胎的SMNs的实验方案，所用材料为胚胎第11.5天（E11.5）的IslMN:GFP转基因小鼠胚胎。该方案详述了组织解剖与解离、基于流式细胞分选（FACS）的细胞分离，以及来自CN3/CN4和SMN核团细胞的体外培养步骤。本方案在现有方法基础上新增了一种全新的体外CN3/CN4培养体系，同时提供了物种和年龄匹配的纯SMN培养体系用于对照比较。在此培养系统中，可对运动神经元的形态学、细胞学、分子学及电生理学特性进行分析。该方案将推动关于运动神经元发育机制、选择性易损性及其相关疾病的研究。
引言
原代运动神经元的培养是一种强大的工具，可用于研究神经元的发育、功能以及对外源性应激因子的易感性。运动神经元培养对于研究肌萎缩侧索硬化症（ALS）等神经退行性疾病尤其有用1,2，而这类疾病的发病机制尚未完全阐明。有趣的是，尽管在ALS患者和ALS模型小鼠中脊髓运动神经元（SMNs）存在显著的细胞死亡，动眼神经元（CN3s）和滑车神经元（CN4s）的细胞死亡则相对较少1,3,4,5,6,7,8,9。因此，对CN3s/CN4s和SMNs的纯化培养物进行比较分析，可能为揭示其相对易损性的机制提供重要线索。然而，此类分析面临的主要障碍在于无法培养出这些运动神经元的纯化细胞群。
已有多种方案被用于从动物模型中纯化脊髓运动神经元（SMNs）。大多....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有利用实验动物进行的实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物护理与使用的指南，并经波士顿儿童医院动物护理与使用委员会批准。
1. 解剖前设置定时交配
- 为获取用于运动神经元分离的产前胚胎小鼠，称量每只雌性小鼠，并在神经元分离日前11.5天安排成年IslMN:GFP转基因小鼠进行定时交配。本方案开发过程中使用了2−9月龄的129S1/C57BL/6J IslMN:GFP小鼠，并于傍晚安排定时交配。
- 次日上午检查雌性小鼠是否存在阴道栓。将发现阴道栓的当天记为胚胎发育第（E）0.5天。
- 在E8.5至E11期间，称量雌性小鼠并使用超声波仪（见材料表）检查是否怀孕，以确认交配成功。
- 通过检测雌性小鼠体重增加来确认交配成功（若胚胎数量超过5−6个，通常在E9.5时体重增加>1.5 g）。
- 通过超声波直观确认胚胎存在。胚胎在E9.5之后可通过超声波清晰检测。超声检查仅针对体重增加的雌性小鼠进行，因其更可能已怀孕。
注意：雌性小鼠体重增加可能由非妊娠因素引起，因此仅凭体重增加不能可靠判断是否妊娠。超声确认可避免不必要的非妊娠雌鼠牺牲，但在缺乏设备时并非必需步骤。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本方案旨在长期高度纯化并培养原代CN3s/CN4s和SMNs，以实现对运动神经元疾病潜在机制的比较分析（概述见图1和图2）。
神经元成功分离并在培养中生长后，获得了近乎纯的原代CN3/CN4和SMN培养物（图5A，B），并至少维持了14天体外培养（DIV）（图4 和 图6）。在2 DIV时，通过使用运动神经元标志物Islet1和神经元标志物TUJ1进行免疫细胞化学（ICC）检测，CN3/CN4和SMN培养物的纯度分别为93.5 ± 2.2%和86.7 ± 4.7%（图5
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
传统上，对 CN3 和/或 CN4 运动神经元的体外研究依赖于异质性培养，例如分散培养17,18,19,20,21、外植体培养17,22,23,24,25,26以及脑片培养27,28，因为这些细胞无法根据大小.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢 Brigitte Pettmann（美国马萨诸塞州剑桥市 Biogen 公司）在 SMN 解剖技术方面提供的指导；感谢达纳-法伯癌症研究所流式细胞术实验室、哈佛医学院免疫学部流式细胞术实验室、乔斯林糖尿病中心流式细胞术核心实验室、布莱根妇女医院流式细胞术核心实验室以及波士顿儿童医院流式细胞术研究设施在原代运动神经元 FACS 分选方面的支持；感谢 A.A. Nugent、A.P. Tenney、A.S. Lee、E.H. Nguyen、M.F. Rose、Engle 实验室其他成员以及 Project ALS 合作组织成员在技术协助和深入讨论方面提供的帮助。本研究由 Project ALS 资助。此外，R.F. 获得日本心脏基金会/Bayer Yakuhin 海外研究基金以及美国国立卫生研究院遗传学培训项目（T32 GM007748）资助；J.J. 获得美国国立卫生研究院眼科研究所（NEI）通过 Schepens 眼科研究所资助的眼科疾病分子基础培训项目（5T32EY007145-16）以及通过波士顿儿童医院资助的发育神经病学培训项目博士后奖学金（5T32NS007473-19）支持；M.C.W. 获得眼科研究所（NEI，5K08EY027850）和儿童医院眼科基金会（Faculty Discovery Award）资助；E.C.E. 为霍华德·休斯医学研究所研究员。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 标记的山羊抗小鼠 IgG（H+L） | 赛默飞世尔科技 | A-11001 | 1:400 |
| Alexa Fluor 594 标记的 F(ab')2 片段山羊抗兔 IgG (H+L) | 赛默飞世尔科技 | A-11072 | 1:400 |
| B27 补充剂（50 倍浓缩，无血清） | 赛默飞世尔科技 | 17504-044 | |
| BD FACSAria llu SORP 流式细胞仪 | BD生物科学 | - | 配备405、488、594和640 nm激光器的四激光系统。 |
| BD Falcon 70μm 尼龙细胞筛 | CORNING | 352350 | 用于在流式细胞术分选前过滤解离的细胞。 |
| BD Falcon 圆底带盖 snap 盖试管 | CORNING | 352054 | |
| BDNF 人源 | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-207 | |
| 细胞培养微孔板，96孔，聚苯乙烯，F型底（烟囱孔） | Greiner Bio-One International | 655090 | 我们尝试了多种96孔板，此款在免疫细胞化学检测前的培养和分析中效果最佳 |
| 用于显微镜的圆形盖玻片 | Karl Hecht &和助手 | 1001/14 | 我们选用这种盖玻片是因为其面积较大（直径：14 mm）。 |
| CNTF 人源 | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-272 | |
| 环匹阿酸来自 Penicillium cyclopium | Sigma-Aldrich | C1530 | CPA。一种内质网应激诱导剂。 |
| 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | 赛默飞世尔科技 | D1306 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D2650 | DMSO |
| Dumont #5 镊子，不锈钢尖端，尺寸 0.05 mm × 0.01 mm，Biologie 尖头 | Roboz 外科手术器械 | RS-5015 | |
| Forskolin | 赛默飞世尔科技 | BP25205 | |
| GDNF 人源 | ProSpec-Tany TechnoGene, Ltd. | CYT-305 | |
| GlutaMAX 补充剂 | 赛默飞世尔科技 | 35050-061 | |
| 汉克斯’ 平衡盐溶液（HBSS） | 赛默飞世尔科技 | 14175-095 | |
| Hibernate E | BrainBits | 苏木精-伊红 | |
| 低荧光 Hibernate E 培养基 | BrainBits | HELF | 应降低干扰胚胎GFP表达观察的荧光。 |
| 马血清，热灭活，新西兰来源 | 赛默飞世尔科技 | 26050-070 | |
| IBMX | Tocris Cookson | 2845 | 异丁基甲基黄嘌呤 |
| 层粘连蛋白 | 赛默飞世尔科技 | 23017-015 | |
| 莱博维茨’L15 培养基 | 赛默飞世尔科技 | 11415064 | |
| 2-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 显微解剖剪 | Roboz 外科手术器械 | RS-5913 | |
| Micro Knife 4.75" 1.7 mm × 27 mm 刀片 | Roboz 外科手术器械 | RS-6272 | |
| Moria 迷你穿孔匙 | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| 神经元III类小鼠单克隆抗体 β微管蛋白（TUBB3） | BioLegend | 801202 | 1:500，TUJ1 |
| 尼康Perfect Focus Eclipse Ti活细胞荧光显微镜及Elements软件 | 尼康 | - | 使用这些设备采集了细胞培养物的微分干涉差显微图像和免疫细胞化学图像 |
| 硝酸 90%，发烟（符合美国化学会标准） | Fisher Scientific | A202-212 | 用于冲洗盖玻片 |
| 奥林巴斯 1.7 mL 微量离心管，透明 | Genesee Scientific | 22-281 | 这些是我们之前描述过的试管 "1.7 mL 微量离心管" 在该背景下。 |
| 木瓜蛋白酶解离系统 | 沃辛顿生化公司 | LK003150 | 使用该试剂盒配制木瓜蛋白酶溶液和白蛋白-卵黏蛋白抑制剂溶液。 |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | 赛默飞世尔科技 | 15140-122 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 赛默飞世尔科技 | 10010-023 | |
| 聚D-赖氨酸（PDL） | MilliporeSigma | A-003-E | |
| 兔单克隆抗体 Islet1 | Abcam | ab109517 | 1:200 |
| SMZ18 和 SMZ1500 变焦体视显微镜配 DS-Ri1 相机 | 尼康 | - | 解剖操作完成后，在这些荧光显微镜下拍摄解剖后的胚胎和组织图像。 |
| Sylgard 170 黑色硅胶封装材料 - A+B 0.9 kg 套件 | 道康宁 | 1696157 | 我们使用该试剂盒制备解剖培养皿。 |
| TC处理培养皿，100 mm × 20 mm | Genesee Scientific | 25-202 | 我们使用这种培养皿制作解剖用培养皿。 |
| 桑氏敷料镊 4.5" 锯齿状，2.2 mm 尖端宽度 | Roboz 外科手术器械 | RS-8100 | |
| LOGOQ e VET 转导器 | GE Healthcare | L8-18i-RS | 对雌性小鼠进行超声检查 |
| 兽用超声波仪 | GE Healthcare | LOGOQ e VET | 对雌性小鼠进行超声检查 |
| 蔡司LSM 700系列激光扫描共聚焦显微镜与Zen软件 | 卡尔·蔡司 | - | 使用以下设备拍摄了胚胎的共聚焦图像 |
参考文献
- Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
- Wood-Allum, C., Shaw, P. J. Motor neurone disease: a practical update on diagnosis and management. Clinical Medicine (London, England). 10 (3), 252-258 (2010). ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
