使用生物活性珊瑚基质提高解离神经细胞培养物的耐久性

摘要

解离海马细胞培养是神经科学中的关键实验工具。当珊瑚骨架用作基质时，由于其神经保护和神经调节作用，神经细胞在培养中的存活和功能得到增强。因此，在珊瑚基质上生长的神经细胞显示出更高的耐久性，因此更适合培养。

摘要

解离的海马神经元和神经胶质细胞的培养是通过提供高细胞分离和受控环境来研究神经生长和功能的有价值的实验模型。然而，体外海马细胞的存活受到损害:大多数细胞在培养的第一周死亡。因此，确定提高培养中神经细胞耐久性的方法非常重要。

来自珊瑚骨架的结晶文石形式的碳酸钙可用作神经培养的优质活性基质。通过培育、保护和激活神经胶质细胞，珊瑚骨架比其他基质更好地增强这些细胞在体外的存活和生长。

该协议描述了一种在珊瑚基质上培养海马细胞的方法。该基质是通过将珊瑚骨架颗粒附着在培养皿、烧瓶和玻璃盖玻片上而产生的。颗粒通过将细胞引入精细的三维（3D）环境以生长并形成组织样结构来帮助改善细胞的环境。珊瑚骨架引入的3D环境可以通过研磨针对细胞进行优化，从而可以控制颗粒的大小和密度（即基质粗糙度），这种特性已被发现会影响神经胶质细胞的活性。此外，谷物的使用使培养物的观察和分析变得更加容易，尤其是在使用光学显微镜时。因此，该协议包括生成和优化珊瑚基质的程序，作为改善体外神经细胞维持和功能的工具。

引言

解离神经细胞（在本例中为海马细胞）的培养物是通过提供高细胞分离和可及性来研究神经生长和功能的有价值的实验模型¹，^2，3。这种类型的培养物经常用于神经科学、药物开发和组织工程，因为可以收集大量信息，例如生长速率和活力、神经毒性、神经突生长和网络、突触连接和可塑性、形态修饰、神经突组织和布线等1，⁴，⁵，^6，7。

尽管培养物很重要，但培养的细胞通常被迫在二维单层的玻璃盖玻片上生长。这些严格的环境修饰会随着时间的推移显着降低神经细胞的生存能力，因为玻璃盖玻片是具有低粘附强度的非培养基质，表现出较低的支持^{细胞生长的能力}8，⁹，^10，11。

方案

该协议中动物的使用得到了国家动物护理和使用委员会的批准。

注意:碳酸钙珊瑚骨架应以文石的结晶形式使用。到目前为止，用于神经培养物的珊瑚类型是 Porites Lutea，Stylophora pistillata和 Trachyphyllia Geoffroyi。 骨架可以全部购买或磨碎。

1. 清洁珊瑚骨架碎片

注意:以下步骤应在室温下的化学罩中进行，因为下面描述的溶液是危险的，可能会导致灼伤和刺激。

1. 用锤子打破珊瑚骨架并将其分成0.5-2厘米的碎片。为了溶解有机和非有机残留物，将珊瑚骨架碎片浸泡在10%次氯酸钠溶液中10分钟，然后用双蒸水（DDW）洗涤一次。
2. 为了去除残留的有机残留物，将碎片浸泡在1M NaOH溶液中5分钟，然后用DDW洗涤一次。通过将片段浸泡在30%H₂O₂ 溶液中10分钟，继续去除有机沉积物，然后用DDW洗涤片段3倍。
3. 尽可能多地去除多余的DDW，并将珊瑚碎片留在引擎盖中干燥（1-8小时）。

2. 清洁玻璃盖玻片

1. 将玻璃盖玻片转移到100毫米玻璃培养皿中。加入 10 mL 95% 乙醇 15 分钟。

结果

为了制备珊瑚骨架基质，使用锤子将整个珊瑚骨架（图1A）破碎成0.5-2厘米的碎片（图1B），并通过三个步骤（方案中的步骤1）彻底清除有机残留物使用10%次氯酸盐溶液，1M _NaOH溶液和30%H 2 O₂溶液（图1C）。当骨骼颜色从棕色（图1D）变为白色（图1E）时，珊瑚碎片被很好地清理干净。然后，使用研钵和研杵（图2B）或电动研磨机（图2C）研磨清洁的碎片（图2A）。两种程序产生了相似的结果:尺寸在20μm-200μm之间的颗粒混合物（图2D-G.......

讨论

这里介绍的技术描述了一种改善培养中神经细胞的维持和功能的方法。这是通过将细胞粘附在由珊瑚骨架颗粒制成的基质上来实现的，该基质滋养细胞并促进其生长和活性。使用这种技术增加了神经培养模型模仿大脑中细胞环境的能力。

与经典神经细胞培养方法中使用的其他底物相比，引入基质作为培养底物具有几个优点。首先，它增加了细胞粘附性。珊瑚骨架和PDL的组合产生比玻璃和PDL更强的粘合性（未显示）。粘附性的这种增加已被证明对于培养物中贴壁非浮动细胞的存活至关重要³²。其次，珊瑚骨架颗粒的碳酸钙晶体是钙离子的来源，实际上被细胞吸收。与珊瑚骨架基质上的存活水平相比，这很可能是增强持久性和增加密度（图5C，D）的原因²⁶。

第三个优点在于，与玻璃盖玻片不同，珊瑚骨架矩阵实际上是非平面的。颗粒是3D结构的，具有复杂的曲面结构。当考虑到细胞面对不同形态、尺寸和密度的颗粒种群.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24 孔板	Greiner	#60-662160
B-27	Gibco	#17504-044
牛血清白蛋白 （BSA）	Sigma	#A4503
D – 葡萄糖	Sigma	#G8769
Dulbecco 最低必需 Eagle （DMEM）	Sigma	#D5796
电筛	Ari Levy	#3700
胎牛血清 （FBS）	Biological Industries	#04-007-1A
第一天培养基			85.1% 最低必需 Eagle's 培养基 （MEM），11.5% 热灭活胎牛血清，1.2% L-谷氨酰胺和 2.2% D-葡萄糖。
培养瓶	Greiner	#60-690160	25cm^2，组织培养处理
氟脱氧尿苷	Sigma	#F0503
玻璃盖玻片	Menzel-Glaser	#BNCB00120RA1
H2O2	Romical	#007130-72-19	危险
火腿的 F-12 营养混合物	Sigma	#N4888
HANK'S 解决方案	Sigma	#H6648
犬尿喹啉酸	Sigma	#K3375
L - 谷氨酰胺	Sigma	#G7513
手动过滤器 （40µm）	VWR	#10199-654
Minimun Essential Eagle （MEM）	Sigma	#M2279
研钵和研杵	De-Groot	4-P090
NaClO（次氯酸钠）	Sigma	#425044	有害
NaOH	Sigma	#S8045	有害
神经元生长培养基			45% MEM、40% Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM）、10% 营养混合物 F-12 火腿、0.25% （w/v） 牛血清白蛋白 （BSA）、0.75% D-葡萄糖、0.25% L-谷氨酰胺、0.5% B-27 补充剂、0.1% 犬尿喹啉酸、0.01% 70% 尿苷和 30% 氟脱氧尿苷。
培养皿	Greiner	#60-628160、#60-627160	分别为 60 毫米、35 毫米。
多边形 D –赖氨酸	Sigma	#P7280
智能牙本质研磨机	KometaBio	#GR101
胰蛋白酶	Gibco	#15-090-046
尿苷	Sigma	#U3750