离体海马神经细胞培养是神经科学领域一项关键的实验工具。当使用珊瑚骨骼作为培养基质时，由于其具有神经保护和神经调节作用，可增强神经细胞在培养过程中的存活率和功能。因此，生长在珊瑚基质上的神经细胞具有更高的耐久性，更适合用于细胞培养。
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摘要
摘要
离体海马神经元和胶质细胞培养是研究神经生长与功能的宝贵实验模型，可提供高细胞分离度和可控的环境。然而，海马细胞在体外培养中的存活受到限制：大多数细胞在培养的第一周内死亡。因此，寻找提高神经细胞在培养中存活能力的方法具有重要意义。
以珊瑚骨骼来源的结晶型文石形式存在的碳酸钙可用作神经培养的优质活性基质。珊瑚骨骼通过滋养、保护和激活胶质细胞，在体外环境中比其他基质更有效地促进这些细胞的存活与生长。
本方案描述了一种在珊瑚基质上培养海马神经元细胞的方法。该基质通过将珊瑚骨骼颗粒固定于培养皿、培养瓶和玻璃盖玻片上制备而成。这些颗粒为细胞提供了精细的三维（3D）生长环境，有助于改善细胞生长条件，并促进类组织结构的形成。珊瑚骨骼所提供的三维环境可通过研磨进行优化，从而调控颗粒的大小和密度（即基质粗糙度），而这一特性已被发现会影响胶质细胞的活性。此外，使用颗粒状基质可更方便地对培养物进行观察与分析，尤其是在使用光学显微镜时。因此，本方案包含了珊瑚基质的制备及优化步骤，旨在作为一种工具，以提升神经细胞在体外培养中的存活率与功能特性。
引言
分离的神经细胞培养物（本例中为海马细胞）是研究神经生长和功能的宝贵实验模型，因其可实现高程度的细胞分离和操作可及性1,2,3。由于能够获取大量信息，例如生长速率和存活率、神经毒性、神经突起生长与网络形成、突触连接性与可塑性、形态学改变、神经突的组织与连接等，此类培养物在神经科学、药物开发和组织工程领域被广泛使用1,4,5,6,7。
尽管这些培养方法具有重要意义，但培养的细胞通常被迫在玻璃盖玻片上以二维单层形式生长。这种严格的环境改变显著降低了神经细胞长期存活的能力，因为玻璃盖玻片是一种缺乏营养支持且黏附强度低的基质，支持细胞生长的能力较弱8,9,10,11。
由于培养的神经细胞被迫在具有挑战性的条件下生长，因此提高其存活率的关键方法是尽可能模拟其天然环境12,13。这可以通过使用生物材料来实现，这些材料可作为基质，模拟细胞的细胞外基质，使其形成类似组织的结构，并促进其营养供给14。
生物材料的应用是改善细胞培养的一种有前景的策略，因为它们可作为生物相容性支架，提供机械稳定性，并增强多种细胞特性，包括黏附、存活、增殖、迁移、形态发生和分化15,16,17。目前已有多种类型的生物材料被用于改善体外细胞的培养条件，其中包括通常作为细胞外基质组成部分的生物聚合物或生物组分。这些生物材料主要以聚合涂层剂或水凝胶的形式使用18,19,20。一方面，上述基质可为细胞提供熟悉的三维生长环境，促进其在培养皿上的黏附，并给予机械支撑21,22；另一方面，其聚合形态以及细胞在水凝胶中的受限状态会阻碍细胞接触培养基中的营养成分，同时也使通过显微镜方法对细胞进行观察变得更加困难23。
珊瑚外骨骼是一种来源于海洋生物的基质，由碳酸钙构成，具有机械稳定性且可生物降解。以往研究显示，与玻璃盖玻片相比，使用珊瑚外骨骼作为体外培养神经细胞的基质可显著增强细胞黏附性24,25。此外，生长在珊瑚外骨骼上的神经细胞表现出摄取其组成成分——钙的能力，从而在营养缺乏条件下对神经细胞起到保护作用26。更重要的是，珊瑚外骨骼是一种具有支持性和营养性的基质，能够提高神经细胞的存活率，促进神经网络的形成，提升突触连接的速率，并支持类组织结构的构建27,28。近期研究还表明，珊瑚外骨骼基质的表面拓扑结构在胶质细胞的分布与活化过程中发挥关键作用8,29。此外，珊瑚外骨骼作为其他多种细胞类型的培养基质也具有显著效果，例如成骨细胞30,31、肝细胞和心肌细胞的体外培养（未发表数据）。
因此，珊瑚骨骼是一种有前景的体外细胞培养基质。本方案详细描述了在珊瑚骨骼上培养神经细胞的技术，可获得比现有方法更稳定且更旺盛的神经细胞培养效果。该方案也可用于心肌细胞、肝细胞及其他细胞类型的培养。
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方案
本方案中动物的使用已获得国家动物护理与使用委员会的批准。
注意：应使用文石结晶形态的碳酸钙珊瑚骨架。迄今为止用于神经培养的珊瑚类型有 多孔珊瑚（Porites lutea），指枝鹿角珊瑚（Stylophora pistillata），以及 Trachyphyllia geoffroyi 骨骼可整块或研磨后购买。
1. 清洗珊瑚骨骼碎片
警告：以下步骤应在室温下的化学通风橱中进行，因为下述溶液具有危险性，可能引起灼伤和刺激。
- 使用锤子敲碎珊瑚骨骼，并将其分割成 0.5–2 cm 的碎片。为溶解有机和无机残留物，将珊瑚骨骼碎片浸泡在 10% 次氯酸钠溶液中 10 分钟，然后用双蒸水（DDW）洗涤一次。
- 为去除残留的有机物，将碎片浸泡在 1 M NaOH 溶液中 5 分钟，然后用 DDW 洗涤一次。接着将碎片浸泡在 30% H2O2 溶液中 10 分钟以进一步去除有机沉积物，之后用 DDW 洗涤 3 次。
- 尽可能去除多余的 DDW，并将珊瑚碎片置于通风橱中干燥（1–8 小时）。
2. 清洁玻璃盖玻片
- 将玻璃盖玻片转移至一个100 mm的玻璃培养皿中，加入10 mL 95%乙醇，处理15分钟。
- 移除乙醇，用去离子水洗涤3次，每次间隔10分钟。将培养皿置于预热至80 °C的加热板上，直至去离子水完全蒸发。干燥过程中需轻轻搅拌盖玻片数次，防止其相互粘连。
- 对盖玻片进行高压灭菌处理。
3. 珊瑚骨骼颗粒的制备
- 使用研钵和研杵（手动研磨）研磨珊瑚骨骼碎片，直至完全破碎。所得颗粒混合物的粒径范围为 20 µm–200 µm。
- 或者，使用电动研磨机以 1,000 rpm 的速度研磨珊瑚骨骼碎片 30 秒（刀片长度 = 6 cm；宽度 = 0.5 cm–1.0 cm）。所得颗粒大小与手动研磨产生的粒径范围相似。
4. 特定粒径范围内颗粒的纯化
注意：如果需要控制基质中颗粒的大小，请使用以下基于过滤的颗粒纯化步骤。
- 将颗粒转移至手动或电动的 40 µm 滤网筛中。
- 通过筛网过滤将颗粒分为两个特定范围（若使用电动筛分仪，建议采用以下条件：振动频率 = 600 次/分钟，弹跳频率 = 6 次/秒）。此步骤可得到两组颗粒尺寸，一组 <40 µm，另一组 >40 µm。
注：可通过使用不同孔径的筛网来确定两种粒径范围。若需更严格的粒径范围，可将步骤 4.2 中得到的每组颗粒分别用不同孔径的筛网再次筛分。 - 对颗粒进行高压灭菌。
5. 珊瑚颗粒包被培养皿或盖玻片的制备
- 用于包被培养瓶、培养板或培养皿
注意：以下步骤应在无菌条件下进行。- 将珊瑚骨骼颗粒加入溶于Hanks溶液的20 µg/mL多聚-D-赖氨酸（PDL）溶液中。推荐浓度为每1 mL PDL溶液中加入5 mg/10 mg颗粒。
- 将溶液倒入培养瓶和培养皿中（约2 mL/25 cm2），于4 °C孵育过夜。颗粒会沉降并附着于底部。
- 次日，用无菌去离子水（DDW）清洗培养瓶和培养皿一次，然后在超净台中晾干。
注意：建议使用新鲜包被的培养瓶和培养皿。若在4 °C保存，包被后的器皿可在一周内使用，但基质的有效性可能下降。
- 包被玻璃盖玻片（直径12 mm，厚度0.17 mm）
- 将珊瑚骨骼颗粒按任意所需浓度加入去离子水（DDW）中。神经细胞培养常用的密度为5 mg/mL和10 mg/mL。取40 µL颗粒悬液滴加至盖玻片中央（图4）。
- 将盖玻片置于预热至80 °C的加热板上，等待完全蒸发（通常约15分钟）。在此条件下，颗粒会牢固粘附于盖玻片表面。对包被后的盖玻片进行高压灭菌，并在无菌条件下保存。
- 接种前一天，将盖玻片放置于无菌24孔板的盖子上。向每片盖玻片加入100 µL 20 µg/mL PDL溶液。用移液枪头轻触液滴，确保液体覆盖全部颗粒区域及盖玻片其余表面。
- 用24孔板底部盖住其盖子，并用封口膜包裹孔板边缘。于4 °C孵育过夜。
- 次日，用去离子水（DDW）清洗一次，并在超净台中晾干。
注意：建议使用新鲜包被的盖玻片。
6. 在珊瑚骨骼颗粒包被的玻璃盖玻片上培养海马区分离细胞
注意：海马体分离细胞培养的方法基于先前发表的方案24,27进行修改。本方法描述了四只幼年大鼠的培养制备过程。每个海马体的预期细胞产量为 1–1.5 × 106 个细胞。
- 实验准备
- 准备一个空的 60 mm 培养皿。向 60 mm 培养皿中加入 2 mL 最低必需培养基（MEM），并置于冰上。
- 向 35 mm 培养皿中加入 2 mL MEM，并置于 37 °C、5–10% CO2 的培养箱中。向 15 mL 离心管中加入 2 mL MEM，并保存在 4 °C。
- 向 15 mL 离心管中加入 1 mL 第一天培养基，并置于 37 °C、5–10% CO2 的培养箱中。
注：第一天培养基的组成详见材料表。 - 解冻 200 µL 的 2.5% 胰蛋白酶溶液，并在 37 °C 下孵育。
- 使用火焰制备三根玻璃巴斯德吸管，其头部直径分别为 0.5 mm、0.75 mm 和 1.0 mm。
- 准备充足的手术器械：一把大剪刀、两把小剪刀、一把大镊子、四把小镊子和一把手术刀。
- 在生物安全柜中准备好体视显微镜。
- 使用大剪刀将 0–3 日龄 Sprague Dawley 大鼠幼崽断头处死，将其头部分离至一个空的 60 mm 培养皿中（见步骤 6.1.1），身体部分丢弃处理。
- 用大镊子夹住幼鼠头部的口部提起，用小剪刀剪开头骨表面的皮肤。
- 使用干净的剪刀从颅骨下方（小脑侧）插入，向左右两侧剪开颅骨以便移除。用小镊子将颅骨从脑组织上剥离。
- 使用干净的镊子将脑组织从头部取出，并放入含有 2 mL 冷 MEM 的 60 mm 培养皿中（见步骤 6.1.2）。
- 在体视显微镜下使用两把小镊子分离海马体。将分离出的海马体转移至已准备好的含 MEM 的 35 mm 培养皿中（来自步骤 6.1.2）。
注：步骤 6.3–6.6 应对每只幼鼠重复操作。 - 使用手术刀将海马体切成约 1 mm 厚的切片。加入 200 µL 胰蛋白酶溶液（稀释至终浓度为 0.25%），轻轻混匀，并在 37 °C、5–10% CO2 条件下孵育 30 分钟。
- 孵育结束后，向培养皿中加入 2 mL 冷 MEM（步骤 6.1.2）以终止胰蛋白酶反应。使用最大直径的玻璃巴斯德吸管（步骤 6.1.5），将经胰蛋白酶处理的组织转移至含有 1 mL 预热至 37 °C 的第一天培养基的 15 mL 离心管中（步骤 6.1.3）。
注：后续处理中最佳的培养基与组织体积比为 1 mL/8 个海马体。尽量避免随组织转移过多培养基。 - 通过最大直径的玻璃吸管吹打组织 10–15 次进行机械解离。然后使用中等直径的玻璃吸管重复该过程。最后使用最小直径的吸管继续吹打。操作过程中避免产生气泡，以减少细胞死亡。
- 让未完全解离的 组织碎片静置沉降 2–5 分钟，随后将上清液转移至另一支 15 mL 离心管中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。
注：理想的细胞密度为 200,000–400,000 个细胞/mL。可根据需要使用第一天培养基稀释，或在 470 x g 条件下离心以浓缩细胞。 - 将 100 µL 细胞悬液接种到每张玻璃盖玻片上。接种时确保细胞均匀覆盖整个盖玻片表面。置于 37 °C、5–10% CO2 条件下培养。
- 次日，向各孔中加入 500 µL 神经元生长培养基。
注：神经元生长培养基的组成详见材料表。 - 用镊子轻轻将每张盖玻片转移至相应的孔中，同时通过倾斜盖玻片的方式去除第一天培养基。 用吸管吸除盖子内残留的液体。
- 置于 37 °C、5–10% CO2 条件下培养。整个培养过程中避免更换培养基。 在上述条件下，培养物可维持长达 1 个月。主要需注意湿度问题，因此应确保培养箱始终保持最大湿度。
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结果
为制备珊瑚骨骼基质，需将整块珊瑚骨骼（图1A) 用锤子敲碎成 0.5–2 cm 的碎片（图1B）并通过三步法（方案中的步骤1）使用10%次氯酸盐溶液、1 M NaOH溶液和30% H2O2 溶液（图1C）。当珊瑚骨骼的颜色由棕色变为图1D）变为白色（图1E）。然后，将清洗后的片段（图 2A) 使用研钵和研杵研磨图2B）或电动研磨机（图 2C）。两种方法得到的结果相似：均获得粒径介于 20 µm–200 µm 大小（图2D-G).<...
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讨论
本文介绍了一种改进神经细胞在体外培养中维持状态和功能的方法。该方法通过将细胞黏附于由珊瑚骨架颗粒构成的基质上，为细胞提供营养，并促进其生长和活性。采用该技术可提高神经细胞培养模型模拟脑内细胞环境的能力。
将基质作为培养基底，相较于经典神经细胞培养方法中使用的其他基底，具有多项优势。首先，它增强了细胞的黏附性。珊瑚骨架与多聚赖氨酸（PDL）的组合所产生的黏附力强于玻璃与PDL（未显示）。研究表明，黏附性的增强对于培养中贴壁非漂浮细胞的存活至关重要32。其次，珊瑚骨架颗粒中的碳酸钙晶体可为细胞提供可被实际吸收的钙离子。这极有可能解释了为何在珊瑚骨架基质上培养的神经细胞表现出更强的耐久性和更高的密度（图5C,D），相较于缺乏该基质时的存活水平26。
第三个优势在于珊瑚骨骼基质实际上是三维非平面结构，而不同于玻璃盖玻片。这些颗粒具有复杂的曲面结构和...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由以色列贸易和劳工部的KAMIN项目以及美国佛罗里达州迈阿密市砖街大道777号（邮编33131）的Qrons公司资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24孔板 | 格雷纳 | #60-662160 | |
| B-27 | Gibco | #17504-044 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | #A4503 | |
| D – 葡萄糖 | Sigma | #G8769 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Sigma | #D5796 | |
| 电筛 | Ari Levy | #3700 | |
| 胎牛血清（FBS） | 生物工业公司 | #04-007-1A | |
| 第一天培养基 | 85.1% 最低必需培养基（Eagle）’MEM 培养基，11.5% 灭活胎牛血清，1.2% L-谷氨酰胺和 2.2% D-葡萄糖 | ||
| 烧瓶 | 格雷纳 | #60-690160 | 25 cm²，经组织培养处理 |
| 氟脱氧尿苷 | Sigma | #F0503 | |
| 玻璃盖玻片 | Menzel-Glaser | #BNCB00120RA1 | |
| H2O2 | 胃肠道的 | #007130-72-19 | 危险的 |
| Ham's F-12营养混合物 | Sigma | #N4888 | |
| HANK'S 溶液 | Sigma | #H6648 | |
| 犬尿喹啉酸 | Sigma | #K3375 | |
| L-谷氨酰胺 | Sigma | #G7513 | |
| 手动过滤器（40µm) | VWR | #10199-654 | |
| 最小必需培养基（MEM） | Sigma | #M2279 | |
| 研钵和研杵 | 德-格鲁特 | 4-P090 | |
| NaClO（次氯酸钠） | Sigma | #425044 | 危险的 |
| NaOH | Sigma | #S8045 | 危险的 |
| 神经元生长培养基 | 45% MEM，40% DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基），10% Ham F-12营养混合物，0.25%（w/v）牛血清白蛋白（BSA），0.75% D-葡萄糖，0.25% L-谷氨酰胺，0.5% B-27添加剂，0.1% 犬尿烯酸，0.01% 70% 尿苷和30% 氟代脱氧尿苷 | ||
| 培养皿 | 格雷纳 | #60-628160, #60-627160 | 60 mm，35 mm，分别。 |
| 聚D – 赖氨酸 | Sigma | #P7280 | |
| 智能牙本质研磨仪 | KometaBio | #GR101 | |
| 胰蛋白酶 | Gibco | #15-090-046 | |
| 尿苷 | Sigma | #U3750 |
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