使用生物活性珊瑚基质提高解离神经细胞培养物的耐久性

摘要

解离海马细胞培养是神经科学中的关键实验工具。当珊瑚骨架用作基质时，由于其神经保护和神经调节作用，神经细胞在培养中的存活和功能得到增强。因此，在珊瑚基质上生长的神经细胞显示出更高的耐久性，因此更适合培养。

摘要

解离的海马神经元和神经胶质细胞的培养是通过提供高细胞分离和受控环境来研究神经生长和功能的有价值的实验模型。然而，体外海马细胞的存活受到损害:大多数细胞在培养的第一周死亡。因此，确定提高培养中神经细胞耐久性的方法非常重要。

来自珊瑚骨架的结晶文石形式的碳酸钙可用作神经培养的优质活性基质。通过培育、保护和激活神经胶质细胞，珊瑚骨架比其他基质更好地增强这些细胞在体外的存活和生长。

该协议描述了一种在珊瑚基质上培养海马细胞的方法。该基质是通过将珊瑚骨架颗粒附着在培养皿、烧瓶和玻璃盖玻片上而产生的。颗粒通过将细胞引入精细的三维（3D）环境以生长并形成组织样结构来帮助改善细胞的环境。珊瑚骨架引入的3D环境可以通过研磨针对细胞进行优化，从而可以控制颗粒的大小和密度（即基质粗糙度），这种特性已被发现会影响神经胶质细胞的活性。此外，谷物的使用使培养物的观察和分析变得更加容易，尤其是在使用光学显微镜时。因此，该协议包括生成和优化珊瑚基质的程序，作为改善体外神经细胞维持和功能的工具。

引言

解离神经细胞（在本例中为海马细胞）的培养物是通过提供高细胞分离和可及性来研究神经生长和功能的有价值的实验模型¹，^2，3。这种类型的培养物经常用于神经科学、药物开发和组织工程，因为可以收集大量信息，例如生长速率和活力、神经毒性、神经突生长和网络、突触连接和可塑性、形态修饰、神经突组织和布线等1，⁴，⁵，^6，7。

尽管培养物很重要，但培养的细胞通常被迫在二维单层的玻璃盖玻片上生长。这些严格的环境修饰会随着时间的推移显着降低神经细胞的生存能力，因为玻璃盖玻片是具有低粘附强度的非培养基质，表现出较低的支持^{细胞生长的能力}8，⁹，^10，11。

由于培养的神经细胞被迫在具有挑战性的条件下生长，因此提高其生存能力的基本方法是尽可能模仿其自然环境^12，13。这可以通过使用生物材料来实现，这些生物材料将充当基质并模仿细胞的细胞外基质，使它们能够形成组织样结构并协助其营养¹⁴。

使用生物材料是改善细胞培养物的一种有前途的方法，因为它们充当生物相容性支架，提供机械稳定性并增强各种细胞特性，包括粘附、存活、增殖、迁移、形态发生和分化¹⁵，^16，17。几种类型的生物材料用于改善体外细胞的状况。其中包括生物聚合物，或生物成分，通常是细胞细胞外基质的一部分。这些生物材料大多用作聚合包衣剂或水凝胶¹⁸，^19，20的形式。一方面，上面提到的基质为细胞提供了一个熟悉的3D环境来生长，鼓励它们粘附在培养皿上，并给予它们机械支撑^21，22。另一方面，它们的聚合形式和细胞在水凝胶中的限制扰乱了细胞对生长培养基中存在的培养成分的访问，并且还使得通过显微镜方法对细胞的随访更加困难²³。

珊瑚外骨骼是源自海洋的生物基质。它们由碳酸钙制成，具有机械稳定性，并且可生物降解。与玻璃盖玻片相比，先前使用珊瑚骨架作为培养中生长神经细胞的基质的研究显示出更大的粘附力^24，25。此外，在珊瑚骨架上生长的神经细胞证明了它们摄入骨骼组成的钙的能力，这在营养匮乏的条件下保护神经细胞²⁶。此外，珊瑚骨架是一种支持和培育基质，可增加神经细胞的存活，促进神经网络的形成，提高突触连接率，并能够形成组织样结构^27，28。最近的研究还表明，珊瑚骨架基质的表面形貌在神经胶质细胞的分布和活化中起着至关重要的作用^8，29。此外，珊瑚骨架可有效作为培养其他细胞类型的基质，例如培养中的骨细胞³⁰，^31，肝细胞和心肌细胞（未发表的数据）。

因此，珊瑚骨架是体外培养细胞的有前途的基质。因此，下面详述的方案描述了在珊瑚骨架上培养神经细胞的技术，以产生比现有方法更稳定和繁荣的神经培养物。该方案也可用于培养心肌细胞，肝细胞和其他细胞类型。

方案

该协议中动物的使用得到了国家动物护理和使用委员会的批准。

注意:碳酸钙珊瑚骨架应以文石的结晶形式使用。到目前为止，用于神经培养物的珊瑚类型是 Porites Lutea，Stylophora pistillata和 Trachyphyllia Geoffroyi。 骨架可以全部购买或磨碎。

1. 清洁珊瑚骨架碎片

注意:以下步骤应在室温下的化学罩中进行，因为下面描述的溶液是危险的，可能会导致灼伤和刺激。

1. 用锤子打破珊瑚骨架并将其分成0.5-2厘米的碎片。为了溶解有机和非有机残留物，将珊瑚骨架碎片浸泡在10%次氯酸钠溶液中10分钟，然后用双蒸水（DDW）洗涤一次。
2. 为了去除残留的有机残留物，将碎片浸泡在1M NaOH溶液中5分钟，然后用DDW洗涤一次。通过将片段浸泡在30%H₂O₂ 溶液中10分钟，继续去除有机沉积物，然后用DDW洗涤片段3倍。
3. 尽可能多地去除多余的DDW，并将珊瑚碎片留在引擎盖中干燥（1-8小时）。

2. 清洁玻璃盖玻片

1. 将玻璃盖玻片转移到100毫米玻璃培养皿中。加入 10 mL 95% 乙醇 15 分钟。
2. 取出乙醇并用DDW 3x洗涤，每次洗涤之间等待10分钟。将培养皿放在80°C预热的加热板上，直到DDW蒸发。干燥时轻轻搅拌盘内的盖玻片几次，以防止它们相互粘连。
3. 高压灭菌盖玻片。

3.珊瑚骨架颗粒的制备

1. 使用研钵和研杵研磨珊瑚骨架碎片（手动研磨），直到完全分解。结果是尺寸范围为20μm-200μm的颗粒混合物。
2. 或者，使用电动研磨机以 1，000 rpm 的速度研磨珊瑚骨架碎片 30 秒（刀片长度 = 6 厘米;宽度 = 0.5 厘米–1.0 厘米）。得到的晶粒尺寸与手工研磨产生的粒度范围相似。

4. 特定尺寸范围的谷物的纯化

注意:如果需要控制基质中颗粒的大小，请使用以下基于过滤的颗粒纯化程序。

1. 将颗粒转移到手动或电动40μm过滤网过滤器上。
2. 通过过滤器筛分谷物，将谷物分为两个特定范围（如果使用电动过滤器，建议使用以下条件:振荡= 600振幅/分钟，弹跳= 6 / s）。该过程产生两组晶粒尺寸，一组<40μm，第二组>40μm。
   注意:这两种尺寸可以通过使用不同网格的过滤器来确定。如果需要更有限的范围，则通过具有不同网格的过滤器重新筛选步骤4.2中的每个组。
3. 高压灭菌谷物。

5. 准备珊瑚粒涂层的餐具或盖玻片

1. 用于包衣烧瓶、平板或培养皿
   注意:以下步骤应在无菌条件下进行。
   1. 将珊瑚骨架颗粒加入溶解在汉克斯溶液中的 20 μg/mL 聚-D-赖氨酸 （PDL） 溶液中。推荐浓度为每 1 mL PDL 溶液 5 mg/10 mg 谷物。
   2. 将溶液倒入烧瓶和培养皿（约2mL / 25cm²）中，并在4°C下孵育过夜。 颗粒下沉并附着在底部。
   3. 第二天，用无菌DDW清洗烧瓶和盘子一次。让烧瓶和培养皿在引擎盖中干燥。
      注意:最好使用新鲜涂层的烧瓶和培养皿。如果在4°C下保存，包被的烧瓶和培养皿可以在包衣后使用长达一周。 但是，矩阵的有效性可能会受到影响。
2. 镀膜玻璃盖玻片（直径 12 毫米，厚度 0.17 毫米）
   1. 将珊瑚骨架颗粒以任何所需的浓度添加到DDW中。用于神经细胞的常见密度为 5 mg/mL 和 10 mg/mL。将 40 μL 谷物溶液倒在盖玻片的中心（图 4）。
   2. 将盖玻片放在预热至80°C的加热板上，等待完全蒸发（通常为15分钟）。在这些条件下，颗粒粘附在盖玻片上。高压灭菌涂层盖玻片。储存在无菌条件下。
   3. 培养前一天，将盖玻片放在无菌24孔板的盖子上。向每个盖玻片中加入 100 μL 20 μg/mL PDL 溶液。使用尖端确保液体覆盖整个颗粒区域和盖玻片表面的其余部分。
   4. 用盘子底部盖住盖子。用石蜡膜包裹板的侧面。在4°C孵育过夜。
   5. 第二天，用DDW清洗一次，然后在引擎盖中晾干。
      注意:最好使用新涂覆的盖玻片。

6. 珊瑚骨架颗粒涂层玻璃盖玻片上海马解离细胞的培养

注意:海马解离细胞培养的方法是从先前发表的程序^24，27修改而来的。描述了四只大鼠幼崽的培养物的制备。每个海马体的预期产量为1-1.5 x 10⁶ 个细胞。

1. 设置
   1. 准备一个空的60毫米培养皿。将 2 mL 最小必需培养基 （MEM） 倒入 60 mm 培养皿中，放在冰上。
   2. 将 2 mL MEM 倒入 35 mm 培养皿中，并将其放入 37 °C、5–10% CO₂ 的培养箱中。将 2 mL MEM 倒入 15 mL 管中，并保持在 4 °C。
   3. 将 1 mL 首日培养基倒入 15 mL 管中，并将其放入 37 °C、5-10% CO₂ 的培养箱中。
      注意:首日培养基的成分在 材料表中描述。
   4. 解冻200μL的2.5%胰蛋白酶溶液并在37°C下孵育。
   5. 使用火焰准备三个直径为 0.5 mm、0.75 mm 和 1.0 mm 的玻璃巴斯德移液器。
   6. 准备足够的手术工具:一把大剪刀、两把小剪刀、一把大镊子、四把小镊子和一把手术刀。
   7. 在引擎盖中准备一个体视显微镜。
2. 使用一把大剪刀，将0-3天大的Sprague Dawley大鼠幼崽从身体上分离到一个空的60毫米培养皿中（步骤6.1.1）。处理尸体。
3. 用大镊子从嘴里拿起头。用小剪刀剪开覆盖头骨的皮肤。
4. 用干净的剪刀进入颅骨下方（小脑一侧），将头骨向右和向左切割以使其被移除。用小镊子，从大脑上剥下头骨。
5. 用干净的镊子将大脑与头部分开，并将其放入含有2mL冷MEM的60毫米培养皿中（见步骤6.1.2）。
6. 使用两个小镊子，在体视显微镜下解剖海马体。将海马体转移到含有MEM的制备的35毫米培养皿（来自步骤6.1.2）中。
   注意:应为每个小狗重复步骤 6.3–6.6。
7. 用手术刀将海马切成约1毫米的切片。加入 200 μL 胰蛋白酶溶液（稀释至终浓度为 0.25%）。轻轻混合并在37°C，5–10%CO₂ 下孵育30分钟。
8. 孵育后，向培养皿中加入 2 mL 冷 MEM（步骤 6.1.2）以使胰蛋白酶失活。使用最大直径的玻璃巴斯德移液管（步骤6.1.5）将胰蛋白酶消化组织转移到含有预热至37°C的15 mL首日培养基的15 mL管中（步骤6.1.3）。
   注意:用于进一步处理组织的最佳培养基与组织 （v:v） 比率为 1 mL/8 海马体。尽可能避免将培养基与组织一起转移。
9. 通过最大直径的玻璃移液管10-15次来研磨组织。然后，使用中等直径的玻璃移液管重复此过程。继续使用最小直径的移液器研磨。避免冒泡以减少细胞死亡。
10. 让剩余的组织碎片下沉2-5分钟，然后将上清液转移到另一个15mL管中。使用血细胞计数器计数细胞。
    注意:优选的细胞密度为 200，000–400，000 个细胞/mL。使用首日培养基以470 x g 稀释或离心以浓缩细胞。
11. 在每个玻璃盖玻片上接种 100 μL 细胞。接种时，确保用细胞覆盖整个盖玻片。在37°C，5–10%CO₂下孵育。
12. 第二天，向孔中加入 500 μL 神经元生长培养基。
    注意:神经元生长培养基的组成在 材料表中描述。
13. 使用镊子轻轻地将每个盖玻片转移到适当的孔中，同时通过倾斜盖玻片去除第一天培养基。从盖子上吸出剩余的介质。
14. 在37°C，5–10%CO 2下孵育_。 避免在整个孵育过程中更换培养基。 在这些条件下，培养物可以维持长达 1 个月。主要问题是湿度。因此，请确保保持培养箱的最大加湿。

结果

为了制备珊瑚骨架基质，使用锤子将整个珊瑚骨架（图1A）破碎成0.5-2厘米的碎片（图1B），并通过三个步骤（方案中的步骤1）彻底清除有机残留物使用10%次氯酸盐溶液，1M _NaOH溶液和30%H 2 O₂溶液（图1C）。当骨骼颜色从棕色（图1D）变为白色（图1E）时，珊瑚碎片被很好地清理干净。然后，使用研钵和研杵（图2B）或电动研磨机（图2C）研磨清洁的碎片（图2A）。两种程序产生了相似的结果:尺寸在20μm-200μm之间的颗粒混合物（图2D-G...

讨论

这里介绍的技术描述了一种改善培养中神经细胞的维持和功能的方法。这是通过将细胞粘附在由珊瑚骨架颗粒制成的基质上来实现的，该基质滋养细胞并促进其生长和活性。使用这种技术增加了神经培养模型模仿大脑中细胞环境的能力。

与经典神经细胞培养方法中使用的其他底物相比，引入基质作为培养底物具有几个优点。首先，它增加了细胞粘附性。珊瑚骨架和PDL的组合产生比玻璃和PDL更强的粘合性（未显示）。粘附性的这种增加已被证明对于培养物中贴壁非浮动细胞的存活至关重要³²。其次，珊瑚骨架颗粒的碳酸钙晶体是钙离子的来源，实际上被细胞吸收。与珊瑚骨架基质上的存活水平相比，这很可能是增强持久性和增加密度（图5C，D）的原因²⁶。

第三个优点在于，与玻璃盖玻片不同，珊瑚骨架矩阵实际上是非平面的。颗粒是3D结构的，具有复杂的曲面结构。当考虑到细胞面对不同形态、尺寸和密度的颗粒种群...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24 孔板	Greiner	#60-662160
B-27	Gibco	#17504-044
牛血清白蛋白 （BSA）	Sigma	#A4503
D – 葡萄糖	Sigma	#G8769
Dulbecco 最低必需 Eagle （DMEM）	Sigma	#D5796
电筛	Ari Levy	#3700
胎牛血清 （FBS）	Biological Industries	#04-007-1A
第一天培养基			85.1% 最低必需 Eagle's 培养基 （MEM），11.5% 热灭活胎牛血清，1.2% L-谷氨酰胺和 2.2% D-葡萄糖。
培养瓶	Greiner	#60-690160	25cm^2，组织培养处理
氟脱氧尿苷	Sigma	#F0503
玻璃盖玻片	Menzel-Glaser	#BNCB00120RA1
H2O2	Romical	#007130-72-19	危险
火腿的 F-12 营养混合物	Sigma	#N4888
HANK'S 解决方案	Sigma	#H6648
犬尿喹啉酸	Sigma	#K3375
L - 谷氨酰胺	Sigma	#G7513
手动过滤器 （40µm）	VWR	#10199-654
Minimun Essential Eagle （MEM）	Sigma	#M2279
研钵和研杵	De-Groot	4-P090
NaClO（次氯酸钠）	Sigma	#425044	有害
NaOH	Sigma	#S8045	有害
神经元生长培养基			45% MEM、40% Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM）、10% 营养混合物 F-12 火腿、0.25% （w/v） 牛血清白蛋白 （BSA）、0.75% D-葡萄糖、0.25% L-谷氨酰胺、0.5% B-27 补充剂、0.1% 犬尿喹啉酸、0.01% 70% 尿苷和 30% 氟脱氧尿苷。
培养皿	Greiner	#60-628160、#60-627160	分别为 60 毫米、35 毫米。
多边形 D –赖氨酸	Sigma	#P7280
智能牙本质研磨机	KometaBio	#GR101
胰蛋白酶	Gibco	#15-090-046
尿苷	Sigma	#U3750