离体海马神经细胞培养是神经科学领域一项关键的实验工具。当使用珊瑚骨骼作为培养基质时，由于其具有神经保护和神经调节作用，可增强神经细胞在培养过程中的存活率和功能。因此，生长在珊瑚基质上的神经细胞具有更高的耐久性，更适合用于细胞培养。
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摘要
摘要
离体海马神经元和胶质细胞培养是研究神经生长与功能的宝贵实验模型，可提供高细胞分离度和可控的环境。然而，海马细胞在体外培养中的存活受到限制：大多数细胞在培养的第一周内死亡。因此，寻找提高神经细胞在培养中存活能力的方法具有重要意义。
以珊瑚骨骼来源的结晶型文石形式存在的碳酸钙可用作神经培养的优质活性基质。珊瑚骨骼通过滋养、保护和激活胶质细胞，在体外环境中比其他基质更有效地促进这些细胞的存活与生长。
本方案描述了一种在珊瑚基质上培养海马神经元细胞的方法。该基质通过将珊瑚骨骼颗粒固定于培养皿、培养瓶和玻璃盖玻片上制备而成。这些颗粒为细胞提供了精细的三维（3D）生长环境，有助于改善细胞生长条件，并促进类组织结构的形成。珊瑚骨骼所提供的三维环境可通过研磨进行优化，从而调控颗粒的大小和密度（即基质粗糙度），而这一特性已被发现会影响胶质细胞的活性。此外，使用颗粒状基质可更方便地对培养物进行观察与分析，尤其是在使用光学显微镜时。因此，本方案包含了珊瑚基质的制备及优化步骤，旨在作为一种工具，以提升神经细胞在体外培养中的存活率与功能特性。
引言
分离的神经细胞培养物（本例中为海马细胞）是研究神经生长和功能的宝贵实验模型，因其可实现高程度的细胞分离和操作可及性1,2,3。由于能够获取大量信息，例如生长速率和存活率、神经毒性、神经突起生长与网络形成、突触连接性与可塑性、形态学改变、神经突的组织与连接等，此类培养物在神经科学、药物开发和组织工程领域被广泛使用1,4,5,6,7。
尽管这些培养方法具有重要意义，但培养的细胞通常被迫在玻璃盖玻片上以二维单层形式生长。这种严格的环境改变显著降低了神经细胞长期存活的能力，因为玻璃盖玻片是一种缺乏营养支持且黏附强度低的基质，支持细胞生长的能力较弱8,9,10,
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方案
本方案中动物的使用已获得国家动物护理与使用委员会的批准。
注意：应使用文石结晶形态的碳酸钙珊瑚骨架。迄今为止用于神经培养的珊瑚类型有 多孔珊瑚（Porites lutea），指枝鹿角珊瑚（Stylophora pistillata），以及 Trachyphyllia geoffroyi 骨骼可整块或研磨后购买。
1. 清洗珊瑚骨骼碎片
警告：以下步骤应在室温下的化学通风橱中进行，因为下述溶液具有危险性，可能引起灼伤和刺激。
- 使用锤子敲碎珊瑚骨骼，并将其分割成 0.5–2 cm 的碎片。为溶解有机和无机残留物，将珊瑚骨骼碎片浸泡在 10% 次氯酸钠溶液中 10 分钟，然后用双蒸水（DDW）洗涤一次。
- 为去除残留的有机物，将碎片浸泡在 1 M NaOH 溶液中 5 分钟，然后用 DDW 洗涤一次。接着将碎片浸泡在 30% H2O2 溶液中 10 分钟以进一步去除有机沉积物，之后用 DDW 洗涤 3 次。
- 尽可能去除多余的 DDW，并将珊瑚碎片置于通风橱中干燥（1–8 小时）。
2. 清洁玻璃盖玻片
- 将玻璃盖玻片转移至一个100 mm的玻....
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结果
为制备珊瑚骨骼基质，需将整块珊瑚骨骼（图1A) 用锤子敲碎成 0.5–2 cm 的碎片（图1B）并通过三步法（方案中的步骤1）使用10%次氯酸盐溶液、1 M NaOH溶液和30% H2O2 溶液（图1C）。当珊瑚骨骼的颜色由棕色变为图1D）变为白色（图1E）。然后，将清洗后的片段（图 2A) 使用研钵和研杵研磨图2B）或电动研磨机（图 2C）。两种方法得到的结果相似：均获得粒径介于 20 µm–200 µm 大小（图2D-G).<.......
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讨论
本文介绍了一种改进神经细胞在体外培养中维持状态和功能的方法。该方法通过将细胞黏附于由珊瑚骨架颗粒构成的基质上，为细胞提供营养，并促进其生长和活性。采用该技术可提高神经细胞培养模型模拟脑内细胞环境的能力。
将基质作为培养基底，相较于经典神经细胞培养方法中使用的其他基底，具有多项优势。首先，它增强了细胞的黏附性。珊瑚骨架与多聚赖氨酸（PDL）的组合所产生的黏附力强于玻璃与PDL（未显示）。研究表明，黏附性的增强对于培养中贴壁非漂浮细胞的存活至关重要32。其次，珊瑚骨架颗粒中的碳酸钙晶体可为细胞提供可被实际吸收的钙离子。这极有可能解释了为何在珊瑚骨架基质上培养的神经细胞表现出更强的耐久性和更高的密度（图5C,D），相较于缺乏该基质时的存活水平26。
第三个优势在于珊瑚骨骼基质实际上是三维非平面结构，而不同于玻璃盖玻片。这些颗粒具有复杂的曲面结构和.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由以色列贸易和劳工部的KAMIN项目以及美国佛罗里达州迈阿密市砖街大道777号（邮编33131）的Qrons公司资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24孔板 | 格雷纳 | #60-662160 | |
| B-27 | Gibco | #17504-044 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | #A4503 | |
| D – 葡萄糖 | Sigma | #G8769 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Sigma | #D5796 | |
| 电筛 | Ari Levy | #3700 | |
| 胎牛血清（FBS） | 生物工业公司 | #04-007-1A | |
| 第一天培养基 | 85.1% 最低必需培养基（Eagle）’MEM 培养基，11.5% 灭活胎牛血清，1.2% L-谷氨酰胺和 2.2% D-葡萄糖 | ||
| 烧瓶 | 格雷纳 | #60-690160 | 25 cm²，经组织培养处理 |
| 氟脱氧尿苷 | Sigma | #F0503 | |
| 玻璃盖玻片 | Menzel-Glaser | #BNCB00120RA1 | |
| H2O2 | 胃肠道的 | #007130-72-19 | 危险的 |
| Ham's F-12营养混合物 | Sigma | #N4888 | |
| HANK'S 溶液 | Sigma | #H6648 | |
| 犬尿喹啉酸 | Sigma | #K3375 | |
| L-谷氨酰胺 | Sigma | #G7513 | |
| 手动过滤器（40µm) | VWR | #10199-654 | |
| 最小必需培养基（MEM） | Sigma | #M2279 | |
| 研钵和研杵 | 德-格鲁特 | 4-P090 | |
| NaClO（次氯酸钠） | Sigma | #425044 | 危险的 |
| NaOH | Sigma | #S8045 | 危险的 |
| 神经元生长培养基 | 45% MEM，40% DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基），10% Ham F-12营养混合物，0.25%（w/v）牛血清白蛋白（BSA），0.75% D-葡萄糖，0.25% L-谷氨酰胺，0.5% B-27添加剂，0.1% 犬尿烯酸，0.01% 70% 尿苷和30% 氟代脱氧尿苷 | ||
| 培养皿 | 格雷纳 | #60-628160, #60-627160 | 60 mm，35 mm，分别。 |
| 聚D – 赖氨酸 | Sigma | #P7280 | |
| 智能牙本质研磨仪 | KometaBio | #GR101 | |
| 胰蛋白酶 | Gibco | #15-090-046 | |
| 尿苷 | Sigma | #U3750 |
参考文献
- Pan, L., et al. An in vitro method to manipulate the direction and functional strength between neural populations. Frontiers in Neural Circuits. 9, 32(2015).
- Wellbourne-Wood, J., Chatton, J. Y.
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