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方法文章

利用荧光激活细胞分选技术分离石珊瑚细胞群体

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DOI：

10.3791/60446

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2020年5月31日

 ,  ,  , 
1Department of Marine Biology and Ecology, Rosenstiel School of Marine and Atmospheric Science, University of Miami, 2Department of Biology, University of Miami, 3The Shraga Segal Department of Microbiology, Immunology, and Genetics, Faculty of Health Sciences, and Regenerative Medicine and Stem Cell Research Center, Ben Gurion University of the Negev

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

珊瑚能够形成生物多样性丰富的生态系统，对人类和海洋生物都具有重要意义。然而，目前我们对许多珊瑚细胞的全部潜能和功能仍缺乏充分理解。本文介绍了一种用于分离、标记和分选石珊瑚细胞群体的实验方案。

摘要

珊瑚礁正面临人为压力因素的威胁。珊瑚对这些压力因素的生物反应可能发生在细胞层面，但其作用机制尚不明确。为了研究珊瑚对压力因素的响应，我们需要能够分析细胞反应的工具。特别是需要一些工具来促进功能性检测的应用，以更好地理解细胞群体对压力的反应方式。在本研究中，我们采用荧光激活细胞分选技术（FACS）来分离和区分石珊瑚中的不同细胞群体。该实验方案包括：（1）将珊瑚组织从骨骼中分离；（2）制备单细胞悬液；（3）使用多种标记物对珊瑚细胞进行标记，用于流式细胞术分析；（4）设门策略与细胞分选方法。该技术将使研究人员能够在细胞水平上对珊瑚进行分析，开展不同细胞群体的功能性检测和基因表达研究。

引言

珊瑚礁是地球上最重要的生态系统之一。它们通过为鱼类和无脊椎动物提供关键栖息地来促进生物多样性，并通过提供食物和旅游业带来的经济生计，在维持人类社区方面发挥着至关重要的作用1。作为珊瑚礁的主要构建者，珊瑚动物（刺胞动物门：Cnidaria）还能帮助沿海社区形成巨大的碳酸钙结构，从而减轻海浪和风暴造成的破坏2。

珊瑚在成年阶段为固着生物，其体内共生着多种多样的内共生伙伴，包括病毒、古菌、细菌、原生生物、真菌，尤其是甲藻门中的虫黄藻科（Symbiodiniaceae）成员3。环境变化可能导致这一共生群落失衡，常常引发疾病暴发以及珊瑚白化现象，即共生的虫黄藻从珊瑚群体中被排出，从而切断了珊瑚主要的营养来源。上述两种情况通常会导致珊瑚宿主死亡4,5,6。由人类活动引起的压力因素（如气候变化的快速加剧）正在加速大规模珊瑚死亡事件的发生，导致全球珊瑚礁持续衰退7。

近年来，人们已开发出多种不同方法以减轻珊瑚礁的退化。这些方法包括在现有珊瑚礁上移植珊瑚、利用耐热基因型进行遗传杂交，以及对珊瑚体内寄居的微生物和共生群落进行细胞层面的操控8,9。尽管已有这些努力，目前对珊瑚细胞多样性及细胞功能仍知之甚少10,11,12,13。要理解珊瑚生物体在正常和胁迫条件下的行为机制，必须全面了解其细胞类型的多样性及细胞功能。深入认识细胞多样性与基因功能之间的关联，将有助于提高珊瑚修复与保护工作的效率。

以往关于细胞多样性和功能的研究主要集中在组织学分析和整个组织的RNA取样14,15,16,17。为了更详细地了解珊瑚中特定细胞类型的功能，需要建立能够分离活体珊瑚细胞特定群体的方法。在非经典模式生物中，已成功采用荧光激活细胞分选（FACS）流式细胞术实现这一目标18。FACS利用调谐至不同波长的激光组合，在单细胞水平上检测细胞的多种内源性特性，例如相对细胞大小、细胞颗粒度和自发荧光。此外，还可使用荧光标记化合物对细胞进行标记，以检测特定的目标特性18,19。

迄今为止，流式细胞术在珊瑚细胞中的应用主要集中在利用共生虫黄藻（Symbiodiniaceae）及其他细菌群体强烈的天然自发荧光，对其进行分析20,21,22。荧光激活细胞分选（FACS）还被用于通过比较荧光DNA标记信号与参考模式生物细胞的信号，估算珊瑚基因组大小23,24。FACS的有效应用为细胞生物学研究提供了三种独特工具：1）单个细胞的形态学和功能描述；2）特定细胞群体的鉴定、分离与纯化，用于后续研究；3）在单细胞水平上进行功能检测分析。

用于研究珊瑚细胞的各种外源性荧光标记物的开发与应用至今几乎尚未被探索。这类标记物可能包括带标签的蛋白质、酶的带标签底物，或对其他化合物产生荧光响应的物质。这些标记物可用于鉴定具有独特特性的细胞类型，例如突出显示产生不同数量特定细胞区室结构（如溶酶体）的细胞。另一个例子是使用荧光标记的微珠，以功能性地识别具备吞噬能力的细胞，即能够吞噬特定病原体的细胞25。在施加这些外源性微珠并完成吞噬后，可通过流式细胞术（FACS）快速鉴定参与免疫反应的细胞群体。相较于传统组织学方法需要固定组织且耗时数小时才能大致估算出吞噬微珠阳性细胞的比例，基于FACS的病原体吞噬功能检测可在分离的活细胞上相对快速地完成。除了研究细胞特异性的应激反应外，该技术还有望阐明基因特异性表达，并揭示刺胞动物门所特有的细胞类型（如钙质细胞和刺细胞）的进化与发育历程。

近期，我们对超过30种细胞标志物进行了系统性筛选，结果鉴定出24种能够标记珊瑚细胞的标志物，其中16种可用于区分不同的细胞群体18，使其成为分化簇（CD）。本文描述了从鹿角杯形珊瑚（Pocillopora damicornis）中分离细胞的过程，包括从碳酸钙骨骼中释放细胞，到利用流式细胞分选技术（FACS）鉴定并分离特定细胞群体的完整流程（图1）。

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方案

1. 通过喷枪和压缩机从珊瑚骨骼中解离组织

注意：在冰上操作，并戴手套保护双手。

  1. 通过连接空气压缩机、软管和喷笔来组装喷笔工具包（图2），并将压力表调节至276−483 kPa之间。
    注意：本研究推荐使用的压缩机和气管预设最大压力为393 kPa。若使用压力超出276–483 kPa范围，可能导致细胞无法充分从骨骼上脱离，或造成细胞膜破裂。此压力范围可能因物种而异，需进行细胞活性检测以优化条件。可通过取少量细胞悬液，使用血细胞计数板和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色排除法，在复式显微镜下观察，完成细胞活性检测。
  2. 在已灭菌的玻璃容器中配制100 mL细胞染色液：加入33 mL 10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS；不含钙和镁），使终浓度为3.3x；加入2 mL胎牛血清（FCS；于56 °C加热灭活30分钟），使终体积占比为2%；加入2 mL 1 M HEPES缓冲液，使终浓度为20 mM；最后用无菌水定容至100 mL。
    注意：选择3.3x PBS浓度是为了模拟海水盐度，如Rosental等18所述。对于生活在其他环境中的物种，需根据其生存环境的盐度调整该浓度。
  3. 将10 mL细胞染色液转移至喷笔瓶中（图2中标记为"F"），并安装适用于喷笔连接口的适配盖。
    注意：组织层较厚或体型较大的珊瑚碎片可能需要更多染色液以实现充分的组织剥离。
  4. 对于本实验所用的分枝状珊瑚物种，使用骨剪剪取一段长约3−5 cm或面积约为4 cm2的珊瑚碎片。
    注意：所取碎片必须清除大型藻类及其他多细胞生物，因为这些杂质在后续步骤中难以去除，会在流式细胞术（FACS）分析与分选过程中污染样本。P. damicornis约1 cm长的碎片在经过过滤、染色和洗涤后，可获得约2−10 × 106个细胞。
  5. 将珊瑚碎片放入塑料收集袋中，使用喷笔将细胞染色液喷洒至珊瑚表面（图2）。持续操作直至大部分骨骼暴露，随后将残留的骨骼从收集袋中取出。

2. 从珊瑚组织中解离细胞

注意：所有步骤均需在冰上操作，并佩戴手套保护双手。

  1. 将细胞悬液通过40 µm尼龙细胞筛过滤至50 mL离心管中，以获得单细胞悬液。
    注意：不同物种可能需要更合适的细胞筛孔径。然而，较大的孔径可能导致组织解离不充分，因为碎片和细胞团块可能通过滤网。
    1. 对于黏液层较厚的样本，可使用1 mL塑料注射器的无菌推杆轻轻在滤膜上研磨，以打散细胞团块并促进细胞通过细胞筛。随后用细胞染色缓冲液冲洗细胞筛和推杆，冲洗液收集至离心管中。
  2. 在4 °C条件下，以450 × g 离心5分钟，使细胞沉淀。弃去上清液，并将细胞重悬于1 mL细胞染色缓冲液中。

3. 细胞染色

注意：所有步骤均需在冰上操作，并佩戴手套保护双手。本方案中所示染料仅用于示意目的。若使用其他染料，则需要不同的浓度和孵育时间。

  1. 取500 µL重悬的细胞转移至一个5 mL圆底管中，作为对照样品保留，此份样品中不添加任何染料。
  2. 向剩余的细胞悬液中加入0.42 µL的12 mM DAPI活力染料（材料表）、1 µL的5 µM活性氧（ROS）染料（材料表）以及0.1 µL的0.2 µM溶酶体染料（材料表）。用移液器充分混匀后，置于冰上避光孵育30分钟，以防止光漂白。
    注意：本示例中使用DAPI作为DNA染色剂和细胞活力染料，用于在FACS仪器中对死细胞进行差异性设门。该方法基于DAPI可穿透因膜完整性受损而处于死亡状态的细胞的假设。ROS染料在约520 nm波长处发射绿光，而溶酶体标记物在约668 nm波长处发射红光。
  3. 将500 µL染色后的细胞在4 °C下以450 × g 离心5分钟，沉淀细胞。弃去上清液，将沉淀用500 µL细胞染色缓冲液重悬，转移至新的5 mL圆底管中，并置于冰上保存。

4. FACS 启动

注意：由于不同型号的流式细胞仪所配备的激光器和通道存在差异，实验步骤可能有所不同。本方案使用配备波长为405、488、535和640 nm激光器的流式细胞仪。本方案中所示滤光片仅用于示意说明。若使用其他细胞染料，可能需要不同的滤光片和激光器组合。

  1. 在分选软件中开始创建新的项目模板，并选择激光面板。针对所用的染料组合及自然荧光特性，选择全部四种激光器（405、488、535 和 640 nm）。
  2. 为实验中预期出现的每种荧光颜色选择相应的滤光片。
    1. 为检测 DAPI 发射光并辅助区分活细胞与死细胞，使用带通（BP）为 450/50（波长范围 425−475 nm）的滤光片，例如 DAPI、Hoeschst 或 Pacific Blue 滤光片。
    2. 为检测绿色活性氧（ROS）信号所发射的光，使用带通为 530/30（波长范围 515–545 nm）的滤光片，例如异硫氰酸荧光素（FITC）或绿色荧光蛋白（GFP）滤光片。该滤光片用于测定每个细胞内的 ROS 浓度。
    3. 添加一个带通为 670/30（波长范围 655–685 nm）的额外滤光片，例如别藻蓝蛋白（APC）滤光片，用于检测溶酶体染料的发射光。
      注意：APC 通道可用于测量吞噬活性。该通道同时会检测来自虫黄藻科（Symbiodiniaceae）珊瑚共生藻产生的自发荧光。然而，可通过使用波长更长于 APC 滤光片的额外通道将此信号分离。
    4. 加入一个带通为 780/60（波长范围 750–810 nm）的滤光片，例如最常用的藻红蛋白-花青素染料滤光片（APC-Cy7），用于检测 Symbiodiniaceae 产生的远红区自发荧光，并有助于无共生藻细胞的分离。

5. FACS 门控设置

注意：步骤可能因流式细胞仪的型号和与仪器配套的数据采集程序的不同而有所差异。

  1. 在流式细胞术软件的项目实验界面上，创建一个散点图，并选择前向散射（FCS）作为 X 轴参数，侧向散射（SSC）作为 Y 轴参数。
    注意：FCS 与细胞大小相关，SSC 与细胞颗粒度相关。此设置有助于去除大部分碎片，因为大多数碎片的尺寸小于完整细胞。
  2. 将坐标轴设置为对数或双指数刻度，因为细胞大小和颗粒度可能相差多个数量级（图 3A），尤其是在珊瑚中。

6. 流式细胞分析与细胞分离

注意：步骤可能因流式细胞仪的型号和配套的采集程序不同而有所差异。

  1. 将对照组（即未染色的细胞亚群）放入流式细胞仪的样品室中，并启动读取过程。当计算机开始接收来自每个细胞或事件的数据时，散点图上将开始出现点状信号。为清除前次实验残留在流式细胞仪腔室中的碎片，请等待约30秒后再开始分析。
  2. 在散点图中调节光电倍增管（PMT）电压，以使点群居中。
    注意：PMT电压用于放大所检测光子的信号强度；若PMT电压过低，则读取到的细胞数量会减少；若电压过高，则细胞信号将接近最大值，不同类型细胞之间将难以区分。适当的PMT电压可确保独立可分辨的事件在散点图上清晰分布。通过在FSC和SSC散点图上使用对数或双指数坐标刻度，可更直观地观察事件之间的分离情况。
  3. 开始记录事件。为节约样本，在读取约15,000个事件后暂停数据采集。在大多数情况下，这已足以观察整体细胞群体的分布模式。若需分析并分离较小的特化细胞亚群，则应记录更多事件。
  4. 在FSC与SSC的第一个图中，围绕FSC横轴102标记及以上区域创建一个选区，即设门（gate）。低于此阈值的信号通常为细胞碎片。对于轮廓清晰、界限分明的细胞群体，可使用矩形设门，这是流式细胞分析软件中的常规选项。对于在散点图上呈不规则形状分布的细胞群体，应使用多边形设门功能。
    注意：FSC前向散射设定最低阈值为102时，通常可保留最小的珊瑚细胞，但可能混入碎片污染。为避免此问题，可提高设门的下限，以采取更保守的筛选策略。
  5. 创建一个新的散点图，X轴表示DAPI滤光通道，Y轴表示APC-Cy7滤光通道。为此，请选择在步骤6.4中建立的完整细胞门控区域，右键单击，并选择创建新散点图的选项。将坐标轴调整为对数或双指数刻度。
    注意：不同软件程序中创建新图的具体操作步骤可能有所不同。
  6. 现在将对照样本从流式细胞仪样品室中取出，替换为已染色的细胞样本。等待30秒后再开始分析和数据记录。记录约15,000个细胞后暂停。
    注意：在APC-Cy7通道高端出现的明显细胞群体，代表来自虫黄藻（Symbiodiniaceae）的强红色自发荧光。无需染色即可识别这些群体，它们也可在对照样本的记录中观察到（图3C）。应选择Y轴较低位置的珊瑚自身细胞群体，用于进一步区分分析。
  7. 针对无共生体细胞创建新的散点图，以观察活性氧浓度（FITC滤光通道）以及溶酶体阳性细胞（APC滤光通道），同样采用对数或双指数坐标刻度。
    注意：若存在多个不同的无共生体细胞亚群，可分别在各自的散点图中进一步区分（图3C,D）。
  8. 将染色样本组与对照组（未染色亚群）进行比较，可通过调用对照样本的首次记录数据，或重新插入并重测对照组样本实现。圈选仅在染色样本组中出现的独特事件群体。

7. FACS 分选与收集

注意：步骤可能因流式细胞仪的型号及其配套采集软件的不同而有所差异。

  1. 选择待收集的细胞后，将微量离心管（根据收集细胞数量和储存方法，管中加入 250−500 µL 细胞培养基或裂解缓冲液）放入流式细胞仪的收集室。
    注意：所示流式细胞仪可同时分选四种不同细胞群，仪器可配置为容纳多种收集装置，包括不同规格的离心管和 96 孔板。
  2. 当流式细胞仪开始读取样本，并经过适当时间以冲洗掉碎片后，开始分选目标细胞群，收集数量可从 20,000 个细胞至数百万个不等。
    1. 若收集细胞数量超过 500,000 个，需调整细胞培养基或裂解缓冲液的体积以及收集装置的容量。
    2. 对于体外研究，将细胞置于冰上保存，直至转移至培养箱或无菌环境。
    3. 对于分子生物学研究，应立即开始 DNA/RNA/蛋白质提取，或进行速冻后于 -80 °C 保存直至提取。
  3. 每次使用新的染料、物种或分选仪器时，均需对目标细胞群进行纯度检测：将至少 20,000 个目标细胞分选至 500 µL 染色缓冲液中，重新分析分选后的细胞，并确认细胞仍位于最初用于分选的设门范围内（图 4）。

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结果

总体而言，该实验方案具有重要意义，因为它有助于鉴定和收集可用于功能分析的活体珊瑚细胞群体。该流程首先通过机械方法将珊瑚组织从下方的碳酸钙骨架上分离（图1）。这是最关键的初始步骤之一，因为操作不当会导致细胞死亡率升高，并产生大量碎片。不建议使用酶解法分离，因其可能导致组织剪切加剧和细胞死亡率显著升高。采用喷枪进行机械分离可有效降低这些挑战（图2），使平均细胞死亡率降至约10%（数据未显示）。在通过喷枪介导的机械方法将组织与骨架分离后，将所得悬液经细胞筛过滤，获得单细胞悬液。随后，使用DNA染料（DAPI）、活性氧（ROS）及溶酶体标记物对细胞悬液进行染色，并通过流式细胞仪检测。接着，根据所使用的细胞标记物设计门控策略，以分离特定的细胞群体。最后，将门控后的细胞群体分选至收集管中（图1）。

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讨论

本方案改编自 Rosental 等人18，并针对 P. damicornis 细胞的鉴定与分离而开发。该方法学侧重于通过分析细胞的内在特性（包括相对细胞大小、相对细胞颗粒度、细胞自发荧光以及完整细胞膜的存在）来过滤样品，以去除碎片、无活力细胞及含有共生甲藻（Symbiodiniaceae）的细胞。这些技术可应用于其他珊瑚物种，但由于不同物种间细胞群体特征的特异性差异，流式细胞术（FACS）设门策略可能有所不同。

FACS 在理解珊瑚健康方面的实用性在于其能够利用多种细胞内在因素来差异性地识别和分离细胞。此外，本方案还描述了外源性细胞染色的额外应用，以根据细胞活力、活性氧浓度和溶酶体含量来区分珊瑚细胞。在 Rosental 等人先前测试的 30 多种商业标记物中18，有 24 种可标记 P. damicornis 细胞，其中 16 种产生差异性信号，形成可区分的细胞簇，从而允许选择特定的细胞亚群。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

NTK 感谢迈阿密大学自然科学与工程研究奖为本研究提供的资助。BR 感谢 Alex 和 Ann Lauterbach 对比较与进化免疫学实验室的资助。 BR 的工作得到了以色列科学基金会（ISF）项目编号 1416/19 和 2841/19 以及 HFSP 研究资助 RGY0085/2019 的支持。我们感谢 Zhanna Kozhekbaeva 和 Mike Connelly 提供的技术协助。我们还要感谢中国台湾迈阿密大学米勒医学院西尔维斯特综合癌症中心的共享流式细胞术资源平台提供 FACS 流式细胞仪的使用权限，并感谢 Shannon Saigh 提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
喷枪工具包 &压缩机TCP 全球ABD KIT-H-SETPaasche H 系列单作用虹吸式喷笔套装（含 Master TC-20 压缩机） &和空气软管
BD FACSAria IIBD644832
骨剪Bulk Reef Supply205357海洋奇观 珊瑚 石质骨骼切割器
细胞筛康宁35234040 微米；BD Falcon；独立包装；无菌；尼龙
CellRox GreenLife TechnologiesC104442.5 mM（溶于DMSO）；激发/发射波长：485/520 nm
收集袋格雷格纳38UV35Reloc Zippit 6"L × 4"带拉链封口的透明W型标准可重复密封聚乙烯袋；厚度为2密耳
DAPIInvitrogenD130610 mg 溶于 H2O；激发/发射波长：358/461 nm
胎牛血清Sigma-AldrichF2442-100ML57℃热灭活 °30 分钟，37°C
血细胞计数板Sigma-AldrichZ359629亮线血细胞计数板
HEPES缓冲液Sigma-AldrichH0887
LysoTracker Deep RedLife TechnologiesL124921 mM DMSO溶液；吸收/发射：647/668 nm
微量离心管VWR87003-2941.7 mL
磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco70011-044pH 7.4；10倍浓度
圆底试管VWR3520635 mL 聚丙烯圆底管
注射器BD3096281 mL BD Luer-Lok 注射器，无菌，一次性使用聚碳酸酯

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