利用CyanoGate模块化克隆工具包通过接合进行蓝细菌的遗传改造

摘要

本文介绍了一种实验方案，用于：i）利用CyanoGate模块化克隆工具包构建一种可自我复制的载体；ii）通过接合转移将该载体导入蓝细菌宿主；以及iii）使用酶标仪或流式细胞术对转基因蓝细菌菌株进行表征分析。

摘要

蓝细菌是一类多样化的原核光合生物，可通过遗传改造用于可再生地生产有价值的工业产品。近年来，合成生物学的进步推动了多种克隆工具包的开发，例如CyanoGate，这是一种标准化的模块化克隆系统，用于构建质粒载体，以便后续转化或接合转移至蓝细菌中。本文详细阐述了一种组装自复制载体（例如携带荧光标记表达盒）并将其通过接合转移导入蓝细菌菌株Synechocystis sp. PCC 6803或Synechococcus elongatus UTEX 2973的方法。此外，我们还介绍了如何利用酶标仪或流式细胞术对接合元件（例如启动子）的功能进行表征。

引言

蓝细菌是一类自养细菌，可用于生物合成多种天然及异源高价值代谢产物^1,2,3,4,5,6。尽管如此，要提升其商业应用潜力仍需克服若干障碍，其中最显著的是与异养生物平台（如 Escherichia coli 和酵母）相比，其产物产量相对较低⁷。近年来，随着可用于蓝细菌的基因工程工具不断增多，以及合成生物学理念在蓝细菌研究中的广泛应用，这些挑战正逐步得到解决，蓝细菌作为高效生物制造平台的开发也得以进一步推进^8,9,10。

将DNA导入蓝细菌的主要方法包括转化、接合和电穿孔。通过转化或电穿孔转移至蓝细菌的载体为"自杀型"载体（即能够介导同源重组的整合型载体），而自复制型载体则可通过转化、接合或电穿孔的方式转移至蓝细菌。对于前者，已有适用于自然转化模式物种的基因操作方案¹¹。最近，一种名为CyanoGate的蓝细菌模块化克隆（MoClo）工具包已被开发出来，该工具包采用标准化的Golden Gate载体组装方法，可用于基于自然转化、电穿孔或接合的蓝细菌基因工程¹²。

近年来，黄金门（Golden Gate）型组装技术日益流行，目前已有适用于多种生物的组装标准和元件库可供使用^{13,14,15,16,17}. Golden Gate 克隆技术利用 IIS 型限制性内切酶（例如 BsaI、BpiI、BsmBI、BtgZI 和 AarI）以及一系列受体载体和独特的黏性末端，实现多个 DNA 序列的定向、层级化组装 "一锅法" 连接反应。IIS型限制性内切酶识别一段独特的不对称序列，并在其识别位点之外的特定距离处切割，产生一个交错的末端。 "黏性末端" 切割（通常产生4个核苷酸[NT]突出端），可随后用于驱动有序的DNA组装反应^15,18这促进了由通用语法规则（如 PhytoBricks 标准）定义的大量模块化 Level 0 部件（例如启动子、开放阅读框和终止子）文库的构建¹⁹0级元件可轻松组装成1级表达盒，随后可在选定的受体载体中构建更复杂的高阶组装体（如多基因表达载体）^12,15黄金门（Golden Gate）型组装技术的一个关键优势在于其适用于DNA合成工厂等高通量设施的自动化操作。^20,21，这使得能够测试那些难以通过人工操作实现的复杂实验设计。

CyanoGate 基于已建立的植物 MoClo 系统构建^12,15为了将新元件加入CyanoGate系统，必须首先对元件序列进行驯化，即 "非法" BsaI 和 BpiI 的识别位点必须被去除。对于编码开放阅读框（即编码序列，CDS）的片段，可通过在序列中引入同义突变（即将密码子替换为编码相同氨基酸残基的其他密码子）来破坏这些识别位点。该操作可通过多种方法实现，包括从DNA合成到基于聚合酶链式反应（PCR）扩增的策略（如Gibson组装）等。²²根据所使用的表达宿主，应避免引入稀有密码子，以防影响翻译效率²³去除启动子和终止子序列中的识别位点通常风险较高，因为这些修饰可能影响其功能，导致元件无法按预期发挥作用。例如，对启动子内潜在的转录因子结合位点或核糖体结合位点的改动，可能改变其启动强度以及对诱导或抑制的响应性。同样，对终止子关键结构特征（如富含GC的茎环结构、环状区域和poly-U尾部）的修饰，可能改变终止效率，进而影响基因表达。^24,25尽管已有多种在线资源可用于预测启动子和终止子序列的活性，并判断所提出的突变是否会影响其功能表现^26,27，这些工具通常难以准确预测蓝细菌中的表现^28,29,30.因此，仍建议对修饰后的元件进行体内表征以确认其活性。为了协助难克隆序列的克隆，CyanoGate 包含一种基于 BioBrick 载体 pSB4K5 的低拷贝克隆接受载体^12,16,31此外，一个 "设计与构建" 可通过爱丁堡基因组工场（Edinburgh Genome Foundry）的门户进行载体设计（dab.genomefoundry.org）。最后但最重要的是，CyanoGate 包含两种 Level T 接受载体设计（相当于 Level 2 接受载体）¹⁵ 用于将DNA导入蓝细菌的自杀型载体，或可在多种蓝细菌中自我复制的广宿主范围载体^32,33,34.

本文将重点描述一种用于生成T级自我复制载体，并通过接合（也称为三亲交配）对集胞藻（Synechocystis）PCC 6803和长椭圆聚球藻（Synechococcus elongatus）UTEX 2973（下文简称Synechocystis PCC 6803和S. elongatus UTEX 2973）进行遗传改造的实验方案。细菌细胞间的DNA接合转移是一种已被充分描述的过程，此前已被用于蓝细菌物种的基因工程改造，特别是那些不具备天然感受态的菌株，例如S. elongatus UTEX 2973^{35,36,37,38,39,40,41}。简而言之，将蓝细菌培养物与携带待转移载体（即"货物"载体）的大肠杆菌（E. coli）菌株共同孵育，同时提供用于介导接合的载体（可位于同一E. coli菌株中，或分布于其他菌株中），即"动员"载体和"辅助"载体。接合转移的发生需要满足四个关键条件：1）参与DNA转移的细胞之间必须有直接接触；2）货物载体必须与接合系统兼容（即必须含有合适的转移起始位点（oriT），也称为移动性基础（bom）位点）；3）必须存在并在货物或辅助载体中表达一种DNA切口蛋白（例如由mob基因编码），该蛋白可在oriT位点切割DNA，以启动单链DNA向蓝细菌细胞内的转移；4）转移的DNA在受体蓝细菌中不能被降解（即必须能够抵抗例如限制性内切酶活性等导致的降解）^35,42。为了使货物载体能够在受体细胞中持续存在，其复制起始位点必须与受体蓝细菌相容，以支持其自我复制，并在细胞分裂后传递至子代细胞。为满足上述第3和第4个条件，目前可通过Addgene及其他商业渠道获得多种辅助载体，这些载体编码mob蛋白以及多种甲基化酶，可保护DNA免受宿主蓝细菌内源性核酸酶的降解⁴³。在本方案中，接合过程由携带动员载体pRK24（www.addgeneorg/51950）和辅助载体pRL528（www.addgene.org/58495）的MC1061 E. coli菌株介导。在选择用于接合转移的载体时需格外谨慎。例如，在CyanoGate试剂盒中，自我复制型货物载体pPMQAK1-T自身编码Mob蛋白¹²；而pSEVA421-T则不编码⁴⁴，因此必须由合适的辅助载体提供mob的表达。所选载体还应适用于目标生物体。例如，在鱼腥藻（Anabaena）sp. PCC 7120中实现高效接合转移，需要一种能够保护动员载体免受消化的辅助载体（例如pRL623，其编码三种甲基化酶AvaiM、Eco47iiM和Ecot22iM）^45,46。

在本方案中，我们进一步阐述如何利用酶标仪或流式细胞仪，通过荧光标记来表征元件（即启动子）的性能。流式细胞仪能够对大量细胞群体中的单个细胞进行荧光检测。此外，流式细胞仪允许用户 "门控" 获取的数据并去除背景噪声（例如来自培养物中的颗粒物质或污染的噪声）。相比之下，酶标仪对给定体积的培养物进行整体荧光强度测量，通常在多个重复孔中进行。酶标仪相较于流式细胞仪的主要优势包括成本较低、更易获得，且下游数据分析通常无需专用软件。酶标仪的主要缺点是相对于流式细胞仪的灵敏度较低，以及在测量高光学密度培养物时可能出现问题。对于比较分析，酶标仪的样品需对每个孔进行归一化处理（例如，以培养物密度的测量值为基准，通常采用750 nm处的光密度吸光值 [OD₇₅₀），这可能导致密度过高和/或混合不充分的样品（例如易于发生聚集或絮凝时）出现测量误差。

综上所述，本文详细演示了生成 Level 0 模块的基本原理，随后利用 CyanoGate 试剂盒进行分级组装，并将其克隆至适用于接合转移的载体中。接着，我们展示了接合转移过程、表达荧光标记的无菌转接合子菌株的筛选，以及后续使用流式细胞仪或酶标仪获取荧光数据的方法。

方案

1. 利用植物 MoClo 和 CyanoGate 工具包进行载体构建

注意：在进行载体构建之前，强烈建议用户先熟悉植物和蓝细菌Gate MoClo系统的载体层级结构^12,15。

1. 0级元件的构建
   注意：0级元件可合成为完整的载体，或作为线性序列用于与0级受体（例如gBlocks，IDT）进行组装。此外，也可从模板（如载体或纯化的基因组DNA）中扩增获得序列。本文描述如何从扩增产物生成一个新的0级元件。从0级到T级的Golden Gate组装过程概览见图1。
   1. 设计引物。
      1. 确定要组装的0级模块，并识别相应的5′和3′突出末端（表1）^12,15。检查待克隆的DNA序列中是否存在BpiI或BsaI限制性酶切位点。
         注意：若序列中含有这些位点之一，则必须通过修改限制性位点序列中的一个或多个核苷酸（NT）进行“驯化”。使用Golden Gate组装实现此目的的策略见图2。
      2. 为扩增DNA序列，设计合适的正向和反向引物对。对于正向引物，选择与DNA模板序列5′端互补的18−30 bp序列；对于反向引物，选择与DNA模板序列3′端反向互补的18−30 bp序列。
         注意：退火温度（T_m）在58−62 °C之间的引物通常可获得最稳定的扩增结果（图1A）。
      3. 在正向引物的5′端依次添加以下序列：1）位于BpiI位点5′端的4−6个核苷酸的随机序列，2）BpiI限制性酶切位点（GAAGAC），3）两个随机核苷酸，以及4）步骤1.1.1.1中选定的5′突出末端。在反向引物的5′端依次添加以下序列：1）位于BpiI位点5′端的4−6个核苷酸的随机序列，2）BpiI限制性酶切位点（GAAGAC），3）两个随机核苷酸，以及4）步骤1.1.1.1中选定的3′突出末端。最终确定后订购引物对。
         注意：参见图1A中正向和反向引物对的示例。
   2. 从基因组DNA中扩增DNA序列。
      1. 按照第5节所述方法提取基因组DNA。使用高保真DNA聚合酶（材料表）通过PCR扩增产物。
         注意：例如，根据制造商说明设置PCR反应体系（20−50 µL）。每反应使用约100 ng基因组DNA。热循环程序包括：98 °C预变性30 s，随后进行不超过25个循环的以下步骤：98 °C变性10 s，58 °C引物退火15 s，72 °C产物延伸30 s（根据产物大小或所用DNA聚合酶类型调整延伸时间），最后72 °C终延伸2 min。
      2. 若需对PCR产物进行凝胶纯化，则按第6节所述将整个PCR反应产物在琼脂糖凝胶上电泳。切下目标条带，并使用凝胶回收试剂盒（材料表）进行纯化。
      3. 作为步骤1.1.2.2的替代方案，若PCR产物无需凝胶纯化而直接使用，可通过将PCR反应样品的一部分（约5 µL）在琼脂糖凝胶上电泳验证条带大小。若凝胶结果显示仅有目标条带且无引物二聚体迹象，则使用DNA纯化试剂盒（材料表）纯化PCR产物。
      4. 用少量去离子水（例如10 µL）洗脱纯化的DNA，以获得较高DNA浓度（>20 ng/µL通常足够）。
   3. 将扩增的DNA产物（或多个产物，见图2）在0级中组装。使用BpiI（图1B）配制20 µL反应体系，并按照表2所述设置热循环程序。使用5 µL组装完成的0级反应混合物进行大肠杆菌（E. coli）转化（如第2节所述）。
2. 1级组装体的构建
   1. 确定要组装的0级元件（图1C和表1），并选择合适的1级受体载体¹⁵。
      注意：在此阶段，明确最终T级载体的设计至关重要，因为这将影响1级受体载体的选择。如果目标是在T级中仅包含一个1级组装体（例如基因表达盒），可默认使用1级位置1（正向）受体载体（pICH47732）。然而，若要在T级中组装两个或更多1级组装体，则必须考虑每个1级组装体的位置和方向。通过使用具有适当位置的1级受体载体，最多可在T级受体载体中组装七个1级组装体¹²。
   2. 在1级中组装0级元件。使用BsaI配制20 µL反应体系，并按照表2所述设置热循环程序。使用5 µL组装完成的1级反应混合物进行大肠杆菌（E. coli）转化（如第2节所述）。
3. T级组装体的构建
   1. 确定要组装的1级组装体（图1D），并选择合适的T级受体载体。
      注意：pUC19A-T（氨苄青霉素抗性）和pUC19S-T（链霉素抗性）是高拷贝数的整合型载体，不能在蓝细菌中复制，主要通过同源重组用于基因组整合（即基因敲入或敲除）¹²。整合型载体可通过自然转化递送至适宜的蓝细菌物种¹¹。pPMQAK1-T是一种广宿主范围的复制型载体，通过接合转移递送（第3节）。
   2. 选择合适的末端连接子（End-Link），将最后一个1级组装体的3′端连接至T级骨架¹⁵。
      注意：所需末端连接子的编号与最后一个元件的位置编号相同。例如，仅包含一个1级位置1（正向或反向）元件的T级载体，在连接至T级骨架时需要使用末端连接子1（pICH50872）。
   3. 在T级中组装一个或多个1级组装体。使用BpiI和所需的末端连接子载体配制反应体系，并按照表2所述设置热循环程序。使用5 µL组装完成的T级反应混合物进行大肠杆菌（E. coli）转化（如第2节所述）。

2. E. coli 转化与载体纯化

1. E. coli 转化（第1天）
   1. 解冻一份化学感受态 E. coli 细胞（约25 µL）（材料表），轻柔地用移液器将其转移至一个置于冰上的1.5 mL离心管中。加入5 µL连接产物（0级、1级或T级），将离心管继续在冰上孵育30−60分钟。
   2. 将离心管置于42 °C水浴中热激30秒，随后立即放回冰上静置2分钟。向管中加入250 µL室温（RT）的含分解代谢阻遏的超级优化肉汤（S.O.C.）培养基。将离心管置于摇床培养箱中，在37 °C、225 rpm条件下孵育1小时。
   3. 取40 µL菌液涂布于含有适当终浓度抗生素（100 µg/mL的链霉素二盐酸盐五水合物[0级]、100 µg/mL的羧苄青霉素二钠[1级]或50 µg/mL的硫酸卡那霉素[T级]）、1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和40 µg/mL的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷（X-Gal）的LB琼脂平板上，用于蓝白斑筛选。将平板在37 °C下过夜孵育。
      注：根据 E. coli 感受态细胞的转化效率及连接反应的效果，涂板量可适当调整。若过夜培养后观察到的菌落数<10个，可增加涂板体积。
2. 白色菌落的筛选与液体培养物的制备（第2天）
   注：根据组装反应及后续转化效率的不同，LB琼脂平板上可能无菌落、仅有蓝色菌落或出现白色菌落（图3）。蓝色菌落表明载体未发生限制性酶切（即功能性的lacZ基因仍存在）。白色菌落则表明lacZ表达盒已被移除，并被目标片段或组装产物所取代。
   1. 可选：通过第7节所述的PCR方法验证白色菌落是否含有预期的载体。
   2. 用10 µL枪头挑取单个白色菌落（或经PCR验证的菌落），转移至含有5 mL LB培养基及适当抗生素浓度（见步骤2.1.3）的15 mL离心管中。将离心管置于摇床培养箱中，在37 °C、225 rpm条件下过夜孵育。
3. 质粒载体纯化（第3天）
   1. 可选：为长期低温保存载体，可制备过夜培养的 E. coli 菌液甘油保存液。将500 µL菌液加入含500 µL 50%（v/v）甘油的适当1.5−2.0 mL离心管中，用于-80 °C低温保存。通过轻轻颠倒混匀5−10次。将样品在液氮中速冻后，置于-80 °C冰箱中保存。
   2. 将菌液在15 mL离心管中以3,000 x g离心5−10分钟。弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。使用质粒提取试剂盒（材料表）纯化载体。用35 µL去离子水洗脱纯化的载体。
      注：可使用更小的洗脱体积以进一步提高载体浓度。同一洗脱液可重复通过纯化柱一次，以提高回收率。
   3. 使用分光光度计（材料表）测定洗脱液中载体的浓度。
      注：E. coli 中的高拷贝数载体（如pUC19）通常可获得50−300 ng/µL的产量；低拷贝数载体（如pPMQAK1-T）通常产量为15−60 ng/µL。
4. 载体验证
   注：可通过限制性酶切（步骤2.4.1）和/或测序（步骤2.4.2）对载体进行验证。
   1. 使用适当的限制性内切酶对0.5−1 µg载体进行酶切，并按照第6节所述方法验证预期的条带大小（图4）。
      注：若条带大小异常，通常表明组装错误，此时可筛选更多白色菌落或重新进行组装。BsaI和BpiI可分别用于验证0级和1级组装产物中插入片段的正确大小。BsaI或BpiI可与另一种兼容的、在插入片段和/或载体骨架内有切割位点的限制性内切酶联合使用，使酶切后产生一组清晰且分离良好的条带。
   2. 使用位于组装区域上游的适当引物，通过Sanger测序法对载体进行测序（商业测序服务，表3）。
      注：所有新构建的0级元件均应进行测序，以确认其序列正确性。若1级和T级载体由已测序的0级元件组装而成，则通常无需再次测序验证。

3. 通过接合产生突变体

注意：此处描述了一种将可自主复制的载体通过接合转移导入集胞藻 Synechocystis PCC 6803 或 S. elongatus UTEX 2973^11,47 的实验方案。该方案也适用于其他模式物种（例如 S. elongatus PCC 7942 和 Synechococcus sp. PCC 7002）。所有涉及蓝细菌的操作（及相关缓冲液的配制）均须在无菌条件下于超净工作台内进行。

1. 蓝细菌培养物的生长（第1天）
   1. 根据 Lea-Smith 等人的方法制备 BG11 培养基。¹¹，以及含有 LB-BG11 和 BG11+Kan50 的琼脂平板（第 8 节）。
   2. 建立一个新鲜的培养物 集胞藻属 PCC 6803 或 S. elongatus 从无菌的BG11琼脂平板上获取细胞，接种于装有50 mL新鲜BG11培养基的100 mL锥形瓶中，培养UTEX 2973。 集胞藻属 PCC 6803 培养物在 30 °C、100 µmol 光子 m⁻² s⁻¹ 光照条件下培养^-2s^-1 在 100 rpm 条件下培养 S. elongatus UTEX 2973 在 40 °C、300 µmol 光子 m⁻² s⁻¹ 条件下的生长与采收^-2s^-1 在100 rpm条件下培养，直至菌液OD₇₅₀ = 0.5−1.5（通常为1−2天）。
      注意： S. elongatus UTEX 2973 培养物可在 40 °C 及高光强（例如 2000 µmol 光子 m⁻² s⁻¹）条件下培养，关键词：UTEX 2973，高温培养，高光强，微藻培养，光生物反应器^-2s^-1)⁴⁸.
2. 辅助病毒与载体的增殖 E. coli 菌株（第2天）
   1. 在含有氨苄青霉素（终浓度 100 µg/mL）和氯霉素（终浓度 25 µg/mL）的 LB 培养基中接种 MC1061 E. coli 含有质粒pRK24和pRL528（即辅助菌株）的菌株在摇床培养箱中37 °C、225 rpm条件下过夜培养。根据每接合反应需要1 mL培养物的用量，培养足够体积的辅助菌株培养液。
   2. 在含有适当抗生素的5 mL LB培养基中接种 E. coli 培养携带载体（即 T 级载体）的菌液。将菌液置于摇床培养箱中，37 °C、225 rpm 振荡过夜培养。
3. 接合转移（三亲交配）（第3天）
   1. 制备 E. coli 辅助病毒株和载体病毒株。离心辅助病毒株和载体病毒株 E. coli 3,000 x 条件下培养过夜的菌液 g 室温孵育10分钟。弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。
   2. 将新鲜的不含抗生素的LB培养基加入沉淀中进行洗涤，加入体积与初始培养物相同。通过轻柔吹打重悬沉淀，切勿涡旋震荡培养物。重复此步骤3次，以彻底去除过夜培养物中残留的抗生素。
   3. 将重悬的菌液（如步骤3.3.1所述）离心，弃上清，加入初始培养液体积一半的LB培养基重悬（例如，若过夜培养液体积为5 mL，则重悬于2.5 mL LB培养基中）。取450 µL辅助菌株与450 µL运载菌株加入2 mL离心管中，混匀后置于室温备用，直至步骤3.3.6。
   4. 制备蓝细菌培养物。每次接合反应使用1 mL蓝细菌培养物（OD₇₅₀ = 0.5−1.5).
   5. 将所需总体积的蓝细菌培养物在 1,500 x g 条件下离心 g 室温孵育10分钟，然后小心弃去上清液，勿扰动细胞沉淀。用与初始体积相同的 fresh BG11 培养基洗涤沉淀。通过轻柔吹打重悬沉淀，切勿涡旋震荡培养物。重复此步骤3次，将洗涤后的培养物置于一旁备用。
   6. 加入900 µL洗涤后的蓝细菌培养物至混合液中 E. coli 菌株（辅助菌和载体菌）（900 µL）置于2 mL离心管中，轻轻吹打混匀。切勿涡旋振荡。室温孵育混合物30分钟 集胞藻属 PCC 6803 或 2 小时 S. elongatus UTEX 2973
   7. 将混合物在1,500 x g 室温孵育10分钟。移除1.6 mL上清液。将沉淀物重悬于剩余的约200 µL上清液中。在不含抗生素的LB-BG11琼脂平板（第8节）上放置一个0.45 µm膜滤器。小心铺加200 µL的悬液 E. coli用无菌涂布棒或无菌弯头吸头将蓝细菌培养液均匀涂布于膜上，然后用石蜡膜密封培养皿。
   8. 将LB-BG11平板与膜共同孵育24小时。孵育期间保持膜的完整性。 集胞藻属 PCC 6803 培养物在 30 °C、100 µmol 光子 m⁻² s⁻¹ 光照条件下培养^-2s^-1. 用以下溶液维持膜的完整性 S. elongatus UTEX 2973 在 40 °C 下以 150 µmol 光子 m⁻² s⁻¹ 的光照强度培养^-2s^-1.
4. 膜转移
   1. 24小时后，使用经火焰灭菌的镊子将膜小心转移至含有适当抗生素（第8节）的新鲜BG11琼脂平板上，以筛选载体。用封口膜密封平板。
   2. 在上述描述的适宜生长条件下，孵育BG11琼脂平板， 集胞藻属 PCC 6803 或 S. elongatus UTEX 2973，直至菌落出现。
      注意：菌落通常在7−14天后出现 集胞藻属 PCC 6803 和 3−7 天 S. elongatus UTEX 2973
5. 接合子筛选
   注意：只有携带载体的蓝细菌菌落才能在膜上生长（图5).
   1. 使用无菌的加热接种环，从膜上挑选至少两个单菌落，并在含有适当抗生素的新BG11琼脂平板上划线接种图5C).
      注意：新划线培养的菌落可能仍被污染 E. coli 从接合培养中带入的（即，如果平板上明显存在小型白色菌落），通常需要在新鲜的BG11琼脂平板上再进行两到三轮重新划线，以获得无菌的蓝细菌培养物。
   2. 确认不存在 E. coli 通过将蓝细菌培养物划线接种至含有5 mL LB培养基的15 mL离心管中，于37 °C、225 rpm摇床培养过夜，以检测污染情况。在充分培养约7天后，挑取单个无菌落建立液体培养物，用于长期冷冻保存或后续实验。
6. 蓝细菌菌株的冷冻保存
   1. 在BG11培养基中培养蓝细菌液体培养物（如第3.1节所述），直至OD₇₅₀ = 1.5−3.0。将10 mL培养物在1,500 x g下离心10分钟 g，去除上清液，并将细胞重悬于5 mL新鲜BG11培养基中。
   2. 加入 3.5 mL 经高压灭菌的 50% (v/v) 甘油，使终浓度约为 20% (v/v) 甘油⁴⁹。该方法适用于 集胞藻属 PCC 6803。或者，加入5 mL经滤膜灭菌的BG11培养基，其中含有16%（v/v）二甲基亚砜（DMSO），使终浓度约为8%（v/v）DMSO⁵⁰该方法适用于大多数菌株，包括 S. elongatus UTEX 2973
      注意：DMSO 具有毒性，操作时应采取适当的防护措施。
   3. 轻轻颠倒混匀5−10次。将约1 mL培养物分装至独立的、适用于冷冻保存的1.5 mL螺口管中（材料表将试管置于 -80 °C 超低温冰箱中进行冷冻保存。禁止在液氮中速冻。
      注意：每种菌株建议至少准备三个菌种保存管。
   4. 复苏时，从-80 °C冰箱中取出一支冻存管，在35 °C水浴中轻轻混匀并解冻菌液。将解冻后的菌液加入50 mL新鲜BG11培养基中，按3.1节所述进行液体培养。
      注意：也可以将培养物划线接种并在新的BG11琼脂平板上培养。携带筛选标记的转基因培养物必须首先在不含抗生素的BG11琼脂平板上复苏，随后重新划线接种至含相应抗生素的BG11琼脂平板上。

4. 启动子表征

注意：此处描述了一种标准方法，通过使用酶标仪或流式细胞仪检测经过72小时生长后荧光标记蛋白（eYFP）的表达水平，以分析启动子元件的强度¹²。

1. 培养物生长
   1. 通过将转基因蓝细菌菌株（携带荧光标记表达盒）的单菌落接种至含有适当抗生素的10 mL BG11培养基中，制备种子培养物。同时为适当的阴性对照菌株制备种子培养物（例如野生型菌株和/或携带相同载体骨架但缺乏荧光标记表达盒的转基因菌株）。
      注意：建议至少设置四个生物学重复。
   2. 在适合该蓝细菌菌株的生长条件下培养种子培养物48小时，或直至OD₇₅₀ = 1−1.5。
   3. 为追踪启动子随时间的表达情况，首先测定每份种子培养物的OD₇₅₀值。计算稀释需求，使各培养物起始OD₇₅₀ = 0.2。在平底24孔板（材料表）中设置稀释后的实验培养样品（总体积2 mL）。
   4. 将培养板置于带有白色LED光源的摇床培养箱（材料表）中，在适宜生长条件下培养。使用酶标仪（第4.2节）或流式细胞仪（第4.3节）测定培养物的生长密度（OD₇₅₀）和增强型黄色荧光蛋白（eYFP）荧光强度。
      注意：Synechocystis PCC 6803 和 S. elongatus UTEX 2973 菌株的培养方法同步骤3.1.2。强烈建议将培养板保持在高湿度（95%）环境中，以避免培养样品蒸发。
2. 酶标仪检测
   1. 轻轻吹打混匀24孔板中的培养物（步骤4.1.4），取各培养物部分样品转移至黑色平底96孔板（材料表），必要时进行稀释（终体积100 µL）。避免产生气泡，以免影响测量准确性。
      注意：建议所有测量均在OD₇₅₀值介于0.2−1.0范围内的样品中进行。由于24孔板中培养物密度会随时间增加，根据标准生长条件下的预期增长，建议采用以下稀释比例：0小时不稀释，24小时1:4稀释，48小时1:10稀释，72小时1:10稀释。例如，在24小时取25 µL培养物与75 µL BG11培养基混合。
   2. 在96孔板中设置两个空白孔（即每孔加入100 µL BG11培养基）。将96孔板放入酶标仪（材料表）中，使用仪器内置的轨道振荡器以500 rpm速度振荡60秒，充分混匀各孔。
      注意：蓝细菌培养物可能发生聚集和/或絮凝，因此在读数前充分混匀对获得准确测量结果至关重要。
   3. 使用激发/发射波长485 nm/520 nm测定OD₇₅₀和eYFP荧光强度。
   4. 从每个含蓝细菌培养物的样品孔OD₇₅₀测量值中减去两个空白孔OD₇₅₀测量值的平均值。
   5. 通过将每个培养样品的eYFP荧光测量值（步骤4.2.3）除以校正后的培养物OD₇₅₀值（步骤4.2.4），对荧光值进行归一化处理。然后，从携带eYFP表达盒的转基因菌株中减去适当阴性对照菌株生物学重复的归一化eYFP荧光值（eYFP荧光/OD₇₅₀）的平均值。
      注意：由于含有叶绿素和藻胆蛋白等色素，蓝细菌本身具有天然荧光。
   6. 绘制培养物生长随时间变化曲线（图6A），以及各实验培养物在目标时间点（如72小时；图6B）的平均归一化eYFP荧光值。
3. 流式细胞仪检测
   1. 选择适用于流式细胞仪液体处理系统的适配板。例如，本实验方案中使用的流式细胞仪（材料表）应搭配圆底96孔板（材料表）使用。
   2. 轻轻吹打混匀24孔板中的培养物（步骤4.1.4），将培养物稀释至OD₇₅₀ = 0.1−0.2，以避免液体处理系统喷嘴堵塞。取适量培养样品加入96孔板中，并用滤膜过滤除菌的1×磷酸盐缓冲液（PBS）补足至终体积250 µL。在板上设置一个空白孔，其中加入60 µL BG11培养基和190 µL 1× PBS。
      注意：推荐此体积以备可能需要重新检测样品。不建议使用超过250 µL的体积，因每孔最大容量为300 µL。
   3. 待流式细胞仪准备就绪后，将含有培养样品的96孔板放入液体处理工作站。设置流式细胞仪软件程序，采集10,000个独立事件（如细胞）的数据。使用488 nm激发光和515−545 nm发射光检测eYFP荧光。首先测量并检查空白孔的读数（图7A），然后运行样品检测。
   4. 在前向散射和侧向散射数据集中圈选蓝细菌细胞群体，排除与空白孔信号重叠的区域（图7B）。从携带eYFP表达盒的转基因菌株中减去适当阴性对照菌株生物学重复的平均eYFP荧光值（图7C,D）。绘制各实验培养物在目标时间点（如72小时；图7E）每细胞中位荧光值的平均值。

5. 从蓝细菌中提取基因组DNA

注意：以下方案使用商业化的DNA提取试剂盒（材料表）。

1. 在BG11培养基中培养蓝细菌液体培养物（如第3.1节所述），直至OD₇₅₀达到1.5−3.0。取10 mL培养液在3,000 × g条件下离心10分钟，弃去上清液。将沉淀在-20 °C下孵育30分钟，进行冷冻。
2. 加入400 µL裂解缓冲液（缓冲液AP1）、400 µL核糖核酸酶溶液（RNase A）以及50%（w/v）的玻璃珠（直径0.5 mm）。使用珠磨仪（材料表）在30 Hz（相当于1,800次振荡/分钟）条件下处理样品6分钟，以破碎细胞。
3. 将样品在17,000 × g条件下离心5分钟，小心地将上清液转移至新离心管中，并弃去沉淀。随后按照生产商说明书操作（材料表）。

6. 琼脂糖凝胶电泳

1. 制备含有0.02%（v/v）溴化乙锭的1%（w/v）琼脂糖凝胶。加入样品及合适的DNA分子量标记物。
2. 在125 V电压下电泳50分钟。使用紫外（UV）透射仪检查条带分离情况。
   注意：可根据预期条带大小调整电泳时间与琼脂糖凝胶浓度。例如，较高浓度的琼脂糖凝胶和更长的电泳时间可提高DNA产物条带的分辨率和分离效果，尤其适用于<500 bp的片段。

7. 菌落PCR

1. 使用标准试剂盒（材料表）和适当的引物组合（例如，扩增区域两侧的引物或针对扩增区域内特定序列的引物（表3））配制PCR反应体系。用移液器将10 µL反应液加入PCR管中。
2. 用无菌牙签或10 µL移液器吸头轻轻触碰单个白色菌落顶部，然后接种至含有PCR反应体系的PCR管中。注意标记菌落，并与对应的PCR管一一对应。轻轻搅动反应液，确保大肠杆菌（E. coli）细胞脱落进入溶液中。
3. 通过PCR扩增产物。采用以下程序：95 °C预变性60 s，随后进行30个循环（95 °C变性15 s，58 °C退火15 s（比引物T_m值低几度），72 °C延伸30 s（每kb插入片段延伸30 s）），最后在72 °C下终延伸5 min。

8. BG11 培养基及平板的制备

1. 根据 Lea-Smith 等人的方法¹¹，配制 100 倍浓缩的 BG11 培养基、铁（柠檬酸铁铵）、微量元素、磷酸盐（K₂HPO₄）、Na₂CO₃ 和 TES 缓冲液的储备液。对磷酸盐和 Na₂CO₃ 储备液进行高压灭菌。使用 0.2 µm 滤膜过滤 TES 缓冲液（pH 8.2）和 NaHCO₃ 储备液以实现除菌。
2. 配制 1 L 的 BG11 培养基。将 10 mL 100 倍浓缩 BG11、1 mL 微量元素溶液和 1 mL 铁储备液与 976 mL 水混合后进行高压灭菌。待溶液冷却至室温后，加入 1 mL 磷酸盐储备液、1 mL Na₂CO₃ 储备液和 10 mL NaHCO₃ 溶液，并用 1 M HCl 调节 pH 至 7.6–7.8。
3. LB-BG11 琼脂平板（1.5% [w/v]）
   1. 在玻璃烧瓶中加入 700 mL 去离子水和 15 g 琼脂。在第二个烧瓶中加入 186 mL 水、10 mL 100 倍浓缩 BG11、1 mL 微量元素溶液和 1 mL 铁储备液。将两种溶液分别进行高压灭菌。
   2. 待溶液冷却至约 60 °C 时，将其混合，并加入 1 mL 磷酸盐储备液、1 mL Na₂CO₃ 储备液、10 mL NaHCO₃ 储备液和 50 mL 无菌 LB 培养基，最终体积为 1 L。每皿倒入 25 mL LB-BG11 琼脂培养基制备平板。
4. BG11+Kan50 琼脂平板（1.5% [w/v]）
   1. 在玻璃烧瓶中加入 700 mL 去离子水和 15 g 琼脂。在第二个烧瓶中加入 3 g 硫代硫酸钠（Na₂S₂O₃）、226 mL 水、10 mL 100 倍浓缩 BG11 储备液、1 mL 微量元素溶液和 1 mL 铁储备液。将两种溶液分别进行高压灭菌。
   2. 待溶液冷却至约 60 °C 时，将其混合，并加入 1 mL 磷酸盐储备液、1 mL Na₂CO₃ 储备液、10 mL TES 缓冲液储备液和 10 mL NaHCO₃ 储备液，最终体积为 1 L。加入硫酸卡那霉素至终浓度为 50 µg/mL，每皿倒入 35 mL 培养基制备平板。

结果

为演示Golden Gate组装流程，将以下Level 0元件组装至Level 1位置1（正向）受体载体（pICH47732）中，构建一个表达盒：C-藻蓝蛋白操纵子启动子P_cpc560（pC0.005）、eYFP编码序列（pC0.008）以及双重终止子T_rrnB（pC0.082）¹²。将组装反应产物转化后，通过大肠杆菌（E. coli）菌落的标准蓝白斑筛选鉴定成功组装的克隆（图3）。随后，将Level 1载体中的eYFP表达盒与End-Link 1载体（pICH50872）共同组装至Level T受体载体（pPMQAK1-T）中，获得cpcBA-eYFP载体（图4A）。通过限制性酶切验证组装得到的cpcBA-eYFP载体（

讨论

与其他载体组装方法相比，Golden Gate 组装在可扩展性方面具有多项优势^20,21。然而，在实验室中建立 Golden Gate 系统需要一定时间来熟悉各种元件、受体载体文库以及整体的组装流程。对于更复杂的组装任务，或在并行进行大量复杂组装时（例如，构建包含多个基因表达盒的 Level T 载体系列），通常需要进行周密的规划。我们建议首先列出所需的所有基因表达盒组合，然后在计算机上模拟从 Level 0 到 Level T 的工作流程。在此过程中，用户应考虑 Plant MoClo 试剂盒中提供的 Level 1 "Dummy" 元件，这些元件可用于在 Level T 中组装非连续的 Level 1 载体（例如，Level 1 第1位和第3位的载体可与 "Dummy" 元件第2位一起组装），从而减少所需的总体组装反应次数和克隆步骤¹⁵。

DNA合成通常是构建新的0级元件最简单的方法...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷（X-Gal）	Thermo Fisher Scientific	R0404	用于 2.1.3。
腺苷-5′-三磷酸二钠盐（ATP）	Sigma-Aldrich	A2383	用于表 2。
琼脂（微生物学检测用）	Sigma-Aldrich	A1296-500g	用于 8.3。
琼脂糖	Bioline	BIO-41026	用于 6。
Attune NxT 流式细胞仪	Thermo Fisher Scientific	-	用于 4.3.1。
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A2153	用于表 2。
BpiI (BbsI)	Thermo Fisher Scientific	ER1011	用于表 2。
BsaI (Eco31I)	Thermo Fisher Scientific	ER0291	用于表 2。
羧苄青霉素二钠	VWR International	A1491.0005	用于 2.1.3。
Corning Costar TC 处理平底 24 孔板	Sigma-Aldrich	CLS3527	用于 4.1.3。
二甲基亚砜（DMSO）	Thermo Fisher Scientific	BP231-100	用于 3.6.2。
DNeasy 植物小量提取试剂盒	Qiagen	69104	DNA 提取试剂盒。用于 5。
FLUOstar Omega 微孔板读数仪	BMG Labtech	-	用于 4.2.2。
GeneJET 质粒小量提取试剂盒	Thermo Fisher Scientific	K0503	质粒纯化试剂盒。用于步骤 2.3.2。
玻璃珠（直径 0.5 mm）	BioSpec Products	11079105	用于 5.2。
甘油	Thermo Fisher Scientific	10021083	用于 2.3.1、3.6.2。
异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）	Thermo Fisher Scientific	10356553	用于 2.1.3。
卡那霉素硫酸盐（Gibco）	Thermo Fisher Scientific	11815-024	用于 2.1.3。
膜滤器（0.45 μm）	MF-Millipore	HAWP02500	用于 3.3.7
96 孔平底微孔板（烟囱孔）µCLEAR	Greiner Bio-One	655096	用于 4.2.1。
Monarch DNA 凝胶回收试剂盒	New England Biolabs	T1020S	用于 1.1.2.2。
Monarch PCR DNA 纯化试剂盒	New England Biolabs	T1030	DNA 纯化试剂盒。用于 1.1.2.3。
带 LED 灯的 Multitron Pro 摇床培养箱	Infors HT	-	带白色 LED 灯的振荡培养箱。用于 4.1.4。
MyTaq DNA 聚合酶	Bioline	BIO-21108	用于 7.1。
NanoDrop One	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	用于 2.3.3。
One Shot TOP10 化学感受态 E. coli	Thermo Fisher Scientific	C404010	用于 2.1.1。
磷酸盐缓冲液（PBS）溶液（10X 浓缩液）	VWR International	K813	用于 4.3.2。
Q5 高保真 DNA 聚合酶	New England Biolabs	M0491S	用于 1.1.2.1。
Quick-Load 1 kb DNA Marker	New England Biolabs	N0468S	用于图 4。
螺口管（1.5 ml）	Starstedt	72.692.210	用于 3.6.3
壮观霉素二盐酸盐五水合物	VWR International	J61820.06	用于 2.1.3。
Sterilin Clear Microtiter 圆底 96 孔板	Thermo Fisher Scientific	612U96	用于 4.3.1。
T4 DNA 连接酶	Thermo Fisher Scientific	EL0011	用于表 2。
TissueLyser II	Qiagen	85300	珠磨仪。用于 5.2。