利用CyanoGate模块化克隆工具包通过接合进行蓝细菌的遗传改造

摘要

本文介绍了一种实验方案，用于：i）利用CyanoGate模块化克隆工具包构建一种可自我复制的载体；ii）通过接合转移将该载体导入蓝细菌宿主；以及iii）使用酶标仪或流式细胞术对转基因蓝细菌菌株进行表征分析。

摘要

蓝细菌是一类多样化的原核光合生物，可通过遗传改造用于可再生地生产有价值的工业产品。近年来，合成生物学的进步推动了多种克隆工具包的开发，例如CyanoGate，这是一种标准化的模块化克隆系统，用于构建质粒载体，以便后续转化或接合转移至蓝细菌中。本文详细阐述了一种组装自复制载体（例如携带荧光标记表达盒）并将其通过接合转移导入蓝细菌菌株Synechocystis sp. PCC 6803或Synechococcus elongatus UTEX 2973的方法。此外，我们还介绍了如何利用酶标仪或流式细胞术对接合元件（例如启动子）的功能进行表征。

引言

蓝细菌是一类自养细菌，可用于生物合成多种天然及异源高价值代谢产物^1,2,3,4,5,6。尽管如此，要提升其商业应用潜力仍需克服若干障碍，其中最显著的是与异养生物平台（如 Escherichia coli 和酵母）相比，其产物产量相对较低⁷。近年来，随着可用于蓝细菌的基因工程工具不断增多，以及合成生物学理念在蓝细菌研究中的广泛应用，这些挑战正逐步得到解决，蓝细菌作为高效生物制造平台的开发也得以进一步推进^8,9,10。

将DNA导入蓝细菌的主要方法包括转化、接合和电穿孔。通过转化或电穿孔转移至蓝细菌的载体为"自杀型"载体（即能够介导同源重组的整合型载体），而自复制型载体则可通过转化、接合或电穿孔的方式转移至蓝细菌。对于前者，....

方案

1. 利用植物 MoClo 和 CyanoGate 工具包进行载体构建

注意：在进行载体构建之前，强烈建议用户先熟悉植物和蓝细菌Gate MoClo系统的载体层级结构^12,15。

1. 0级元件的构建
   注意：0级元件可合成为完整的载体，或作为线性序列用于与0级受体（例如gBlocks，IDT）进行组装。此外，也可从模板（如载体或纯化的基因组DNA）中扩增获得序列。本文描述如何从扩增产物生成一个新的0级元件。从0级到T级的Golden Gate组装过程概览见图1。
   1. 设计引物。
      1. 确定要组装的0级模块，并识别相应的5′和3′突出末端（表1）^12,15。检查待克隆的DNA序列中是否存在BpiI或BsaI限制性酶切位点。
         注意：若序列中含有这些位点之一，则必须通过修改限制性位点序列中的一个或多个核苷酸（NT）进行“驯化”。使用Golden Gate组装实现此目的的策略见图2。
      2. 为....

结果

为演示 Golden Gate 组装流程，将一个表达盒组装到 1 级位置 1（正向）受体载体（pICH47732）中，该载体包含以下 0 级元件：C-藻蓝蛋白操纵子启动子 P_cpc560 (pC0.005)，eYFP 的编码序列 (pC0.008) 以及双重终止子 T_rrnB (pC0.082)¹²转化连接反应产物后，通过标准的蓝白斑筛选鉴定阳性克隆 E. coli 菌落（图3）。随后将Level 1载体和End-Link 1载体（pICH50872）中的eYFP表达盒组装至Level T接受载体（pPMQAK1-T）中，从而获得该载体 cpcBA-eYFP (图4A）。组装的 cpcBA-eYFP 载体通过限制性酶切进行验证（

讨论

与其他载体组装方法相比，Golden Gate 组装在可扩展性方面具有多项优势^20,21。然而，在实验室中建立 Golden Gate 系统需要一定时间来熟悉各种元件、受体载体文库以及整体的组装流程。对于更复杂的组装任务，或在并行进行大量复杂组装时（例如，构建包含多个基因表达盒的 Level T 载体系列），通常需要进行周密的规划。我们建议首先列出所需的所有基因表达盒组合，然后在计算机上模拟从 Level 0 到 Level T 的工作流程。在此过程中，用户应考虑 Plant MoClo 试剂盒中提供的 Level 1 "Dummy" 元件，这些元件可用于在 Level T 中组装非连续的 Level 1 载体（例如，Level 1 第1位和第3位的载体可与 "Dummy" 元件第2位一起组装），从而减少所需的总体组装反应次数和克隆步骤¹⁵。

DNA合成通常是构建新的0级元件最简单的方法.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷（X-Gal）	Thermo Fisher Scientific	R0404	用于 2.1.3。
腺苷-5′-三磷酸二钠盐（ATP）	Sigma-Aldrich	A2383	用于表 2。
琼脂（微生物学检测用）	Sigma-Aldrich	A1296-500g	用于 8.3。
琼脂糖	Bioline	BIO-41026	用于 6。
Attune NxT 流式细胞仪	Thermo Fisher Scientific	-	用于 4.3.1。
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A2153	用于表 2。
BpiI (BbsI)	Thermo Fisher Scientific	ER1011	用于表 2。
BsaI (Eco31I)	Thermo Fisher Scientific	ER0291	用于表 2。
羧苄青霉素二钠	VWR International	A1491.0005	用于 2.1.3。
Corning Costar TC 处理平底 24 孔板	Sigma-Aldrich	CLS3527	用于 4.1.3。
二甲基亚砜（DMSO）	Thermo Fisher Scientific	BP231-100	用于 3.6.2。
DNeasy 植物小量提取试剂盒	Qiagen	69104	DNA 提取试剂盒。用于 5。
FLUOstar Omega 微孔板读数仪	BMG Labtech	-	用于 4.2.2。
GeneJET 质粒小量提取试剂盒	Thermo Fisher Scientific	K0503	质粒纯化试剂盒。用于步骤 2.3.2。
玻璃珠（直径 0.5 mm）	BioSpec Products	11079105	用于 5.2。
甘油	Thermo Fisher Scientific	10021083	用于 2.3.1、3.6.2。
异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）	Thermo Fisher Scientific	10356553	用于 2.1.3。
卡那霉素硫酸盐（Gibco）	Thermo Fisher Scientific	11815-024	用于 2.1.3。
膜滤器（0.45 μm）	MF-Millipore	HAWP02500	用于 3.3.7
96 孔平底微孔板（烟囱孔）µCLEAR	Greiner Bio-One	655096	用于 4.2.1。
Monarch DNA 凝胶回收试剂盒	New England Biolabs	T1020S	用于 1.1.2.2。
Monarch PCR DNA 纯化试剂盒	New England Biolabs	T1030	DNA 纯化试剂盒。用于 1.1.2.3。
带 LED 灯的 Multitron Pro 摇床培养箱	Infors HT	-	带白色 LED 灯的振荡培养箱。用于 4.1.4。
MyTaq DNA 聚合酶	Bioline	BIO-21108	用于 7.1。
NanoDrop One	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	用于 2.3.3。
One Shot TOP10 化学感受态 E. coli	Thermo Fisher Scientific	C404010	用于 2.1.1。
磷酸盐缓冲液（PBS）溶液（10X 浓缩液）	VWR International	K813	用于 4.3.2。
Q5 高保真 DNA 聚合酶	New England Biolabs	M0491S	用于 1.1.2.1。
Quick-Load 1 kb DNA Marker	New England Biolabs	N0468S	用于图 4。
螺口管（1.5 ml）	Starstedt	72.692.210	用于 3.6.3
壮观霉素二盐酸盐五水合物	VWR International	J61820.06	用于 2.1.3。
Sterilin Clear Microtiter 圆底 96 孔板	Thermo Fisher Scientific	612U96	用于 4.3.1。
T4 DNA 连接酶	Thermo Fisher Scientific	EL0011	用于表 2。
TissueLyser II	Qiagen	85300	珠磨仪。用于 5.2。