使用CyanoGate模块化克隆工具包进行共生对蓝藻的遗传改造

Summary

在这里，我们提出一个协议，描述如何使用CyanoGate模块化克隆工具包组装自我复制载体，ii） 通过结合将载体引入蓝藻宿主，iii） 使用板读取器或流式细胞仪。

Abstract

蓝藻是一组不同的原核光合生物，可以进行基因改造，用于可再生生产有用的工业商品。合成生物学的最新进展导致开发若干克隆工具包，如CyanoGate，这是一个标准化的模块化克隆系统，用于建立质粒载体，以便随后转化或结合转移到蓝藻中。在这里，我们概述了组装自我复制载体（例如，携带荧光标记表达盒）和结合转移载体到蓝藻菌株Synechocystis sp. PCC 6803 或Synechococcus 的详细方法埃隆塔图斯UTEX 2973.此外，我们概述了如何使用板读器或流动细胞仪来描述遗传部件（例如启动器）的性能。

Introduction

蓝藻是自养菌，可用于各种天然和异物高价值代谢^{产物1、2、3、4、5}的生物^{合成。 6}.要扩大商业可行性，仍需要克服几个障碍，最显著的是，与异养生物平台（如大肠杆菌和酵母）相比，产量^{相对较低7。}最近现有基因工程工具的扩展和合成生物学范式在蓝藻研究中的采用，正在帮助克服这些挑战，并进一步将蓝藻发展为高效的生物^{工厂89，10}.

将DNA引入蓝藻的主要方法是转化、结合和电穿孔。通过转化或电穿孔转移到蓝藻的载体是"自杀"载体（即促进同源重组的综合载体），而自我复制的载体可以通过转化、联结或电穿孔。对于前者，一个协议可用于工程模型物种，适合自然^转化11。最近，一种名为CyanoGate的蓝藻模块化克隆（....

Protocol

1. 使用植物莫克洛和 CyanoGate 工具包的矢量组件

注:在继续矢量组装之前，强烈建议用户熟悉植物和CyanoGate MoClo系统的矢量级^{结构12、15。}

1. 0 级部件的构造
   注: 0 级部件可以合成为完整的矢量或线性序列，用于使用 0 级接受器（例如，gBlocks、IDT）进行装配。或者，序列可以从源模板（例如，载体或纯化基因组DNA）放大。这里，如何从放大的产品生成一个新的0级部件。金门装配过程从 0 级到 T 级的概述如所示图 1.
   1. 设计引体。
      1. 决定要组装的 0 级模块，并确定适当的 5° 和 3+ 悬伸 （表 1）^12，15。检查DNA序列以克隆是否存在BpiI或BsaI限制位点。
         注: 包含这些站点之一的序列必须通过修改限制站点序列中的一个或多个 NT 进行驯化。图2概述了使用金门装配来执行此操作的策略。
      2. 要扩增DNA序列，应设计适当的正向和反向引结对。对于正向引基，选择 18⁄30 b....

Results

为了演示金门装配工作流程，在 1 级位置（正向）接受器矢量 （pICH47732） 中组装了一个表达盒，其中包含以下 0 级部件:C-phycocyanin_operc560 （pC0.005） 的启动器，eYFP （pC0.008） 和双终止器 T_rrnB （pC0.082）¹²的编码顺序。在组件反应转化后，使用大肠杆菌菌落的标准蓝白筛选成功组装（图3）。1 级向量中的 eYFP 表达盒和端链接 1 矢量 （pICH50872） 然后组装成 T 级接受器载体 （pPMQAK1-T），以给出向量ccpcBA-eYFP （图 4A）。组装的CpcBA-eYFP向量通过限制消化验证（图4B）。

Discussion

与其他矢量装配方法相比，金门装配具有几个优点，特别是在可伸缩^性20，21方面。然而，在实验室中建立金门系统需要时间来熟悉各个部件和接受方矢量库以及整体装配流程。对于更复杂的程序集或并行执行大量复杂程序集（例如，制作一套包含多个基因表达盒的 T 级矢量），通常需要仔细规划。我们建议首先列出所需的所有基因表达盒组合，然后映射工作流从 0 级到 Silico 的 T 级。在此过程中，用户应考虑工厂 MoClo 套件中提供的 1 级"虚拟"部件，这些零件允许在 T 级组装非连续级别 1 矢量（例如，1 级位置 1 和位置 3 矢量可与"虚拟"零件一起组装级别 1 位置 2），它可以减少总数量的装配反应和克隆步骤所需的¹⁵。

脱氧核糖核酸合成通常是构建新的0级部件的最简单方法。然而，当需要克隆时（例如，来自质粒或基因组DNA），优化用于扩增的引体设计对于最大限度地提高后续0级载体组装的效率非常重要。引体设计中最关键的两个步骤是:.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-溴-4-氯-3-吲哚基-β;-D-吡喃半乳糖苷 （X-Gal）	Thermo Fisher Scientific	R0404	用于 2.1.3。
腺苷 5′-三磷酸 （ATP） 二钠盐	Sigma-Aldrich	A2383	在表 2 中使用。
琼脂（微生物学测试）	Sigma-Aldrich	A1296-500g	用于 8.3。
琼脂糖	Bioline	BIO-41026	用于 6.
Attune NxT 流式细胞仪Thermo	Fisher Scientific		用于 4.3.1。
血清白蛋白 （BSA）	Sigma-Aldrich	A2153	用于表 2。
BpiI （BbsI）	Thermo Fisher Scientific	ER1011	在表 2 中使用。
BsaI （Eco31I）	Thermo Fisher Scientific	ER0291	在表 2 中使用。
羧青霉素二钠	VWR International	A1491.0005	用于 2.1.3。
康宁 Costar TC 处理的平底 24 孔板	Sigma-Aldrich	CLS3527	用于 4.1.3。
二甲基亚砜 （DMSO）	Thermo Fisher Scientific	BP231-100	用于 3.6.2。
DNeasy Plant Mini Kit	Qiagen	69104	DNA 提取试剂盒。用于 5.
FLUOstar Omega 微孔板检测仪	BMG Labtech	-	用于 4.2.2.
GeneJET 质粒小量制备试剂盒	Fisher Scientific	K0503	质粒纯化试剂盒。在步骤 2.3.2 中使用。
玻璃珠（直径 0.5 mm）	BioSpec 产品	11079105	用于 5.2.
甘油	Thermo Fisher Scientific	10021083	用于 2.3.1、3.6.2。
异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG）	Thermo Fisher Scientific	10356553	用于 2.1.3。
硫酸卡那霉素 （Gibco）	Thermo Fisher Scientific	11815-024	用于 2.1.3。
膜过滤器 （0.45 &μ;m）	MF-Millipore	HAWP02500	用于 3.3.7
微孔板、96 孔、平底（烟囱孔）和微量微孔板;CLEAR	Greiner Bio-One	655096	4.2.1 中使用。
Monarch DNA 凝胶提取试剂盒	New England Biolabs	T1020S	用于 1.1.2.2。
Monarch PCR DNA 纯化试剂盒	New England Biolabs	T1030	DNA 纯化试剂盒。在 1.1.2.3 中使用。
带 LED 指示灯的 Multitron Pro 培养箱	的 Infors HT-Shaking		培养箱。在 4.1.4 中使用。
MyTaq DNA 聚合酶	Bioline	BIO-21108	用于 7.1.
NanoDrop One	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	用于 2.3.3。
One Shot TOP10 化学感受态 E. coli	Thermo Fisher Scientific	C404010	用于 2.1.1。
磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 溶液（10X 浓缩液）	VWR International	K813	用于 4.3.2。
Q5高保真 DNA 聚合酶	New England Biolabs	M0491S	用于 1.1.2.1。
快速加载 1 kb DNA 分子量标准	New England Biolabs	N0468S	用于图 4。
螺帽管 （1.5 ml）	Starstedt	72.692.210	用于 3.6.3
大观霉素二盐酸盐五水合	VWR International	J61820.06	用于 2.1.3。
Sterilin Clear 微量滴定圆底 96 孔板	Thermo Fisher Scientific	612U96	用于 4.3.1。
T4 DNA 连接酶	Thermo Fisher Scientific	EL0011	用于表 2.
TissueLyser II	Qiagen	85300	珠磨机。在 5.2 中使用。