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利用 Tg(Vtg1:mcherry) 斑马鱼胚胎检测内分泌干扰物的雌激素效应

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DOI：

10.3791/60462

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2020年8月8日

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1Department of Aquaculture, Institute of Aquaculture and Environmental Safety, Faculty of Agricultural and Environmental Sciences, Szent István University, 2Institute of Cancer and Genomic Sciences, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham

本文内容

摘要

本文提供了一种利用斑马鱼胚胎Tg(vtg1: mCherry)检测雌激素效应的详细实验方案。该方案涵盖了鱼类的繁育与胚胎处理，并重点介绍了由内分泌干扰物（EDC）诱导的荧光信号的检测、记录及评估方法。

摘要

环境中存在许多内分泌干扰物（EDC），尤其是具有雌激素活性的物质。由于这些物质化学结构多样，检测难度较大；因此，越来越多的研究采用基于效应的检测方法，例如对雌激素效应敏感的生物监测/指示生物。这些生物监测生物包括多种鱼类模型。本方案介绍了转基因斑马鱼 Tg(vtg1: mCherry) 品系作为生物监测工具的应用，涵盖鱼类的繁育及胚胎处理过程，重点在于由内分泌干扰物诱导的荧光信号的检测、记录与评估。本研究的目的是展示利用 Tg(vtg1: mCherry) 转基因品系胚胎检测雌激素效应的方法。本工作通过测试两种具有雌激素活性的物质——α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇，记录了转基因斑马鱼胚胎 Tg(vtg1: mCherry) 在检测雌激素效应中的应用。所述方案仅为实验设计的基础，测试方法可根据实验终点和样品性质进行调整。此外，该方法还可与其他检测技术联用，从而促进该转基因品系在未来研究中的广泛应用。

引言

环境中存在大量内分泌干扰物（EDC），这些物质属于危害最严重的环境污染物之一。其中主要是具有雌激素活性的化合物，会污染来自自然资源的水源。由于该类物质化学结构多样，检测其存在十分困难，需要采用不同的分析方法才能实现有效检出。仅根据化学结构很难判断某种物质是否真正具有雌激素样活性。此外，这些物质在环境中从不以纯态存在，其效应也可能受到其他化合物的影响1。这一问题可通过效应检测方法加以解决，例如利用能响应雌激素效应的生物监测/生物指示生物进行检测2,3,4,5。

近年来，已开发出多种基于细胞系6和酵母的检测系统2,3用于检测雌激素效应。然而，这些系统通常仅能检测物质与雌激素受体的结合2,3，且无法模拟生物体内复杂的生理过程，也无法检测对激素敏感的生命阶段；因此，常常导致假阳性或假阴性结果。

已知某些基因在生物体内对雌激素具有敏感反应7。通过分子生物学方法可在蛋白质或 mRNA 水平检测基因产物8,9，但通常需要牺牲实验动物。动物保护法规日益严格，人们对替代性实验体系的需求不断增长，旨在减少实验中使用动物的数量及其所受痛苦，或以其他模型系统替代动物模型10。随着荧光蛋白的发现及生物标志物品系的建立，转基因技术为此提供了良好的替代方案11。利用这些品系，可体内检测雌激素敏感基因的激活情况。

在脊椎动物中，鱼类在环境风险评估方面的潜力尤为突出。与哺乳动物模型相比，鱼类具有多种优势：作为水生生物，它们能够通过整个体表吸收污染物，繁殖后代数量多，且部分物种具有较短的世代周期。它们的内分泌系统和生理过程与其他脊椎动物甚至包括人类在内的哺乳动物具有高度相似性12。

目前已知多个可用于检测鱼类雌激素效应的基因，其中最重要的包括雌激素受体、芳香化酶b、卵膜原蛋白H以及卵黄原蛋白（vtg）7,13。近年来，研究人员还利用实验室常用的鱼类模型，如斑马鱼（Danio rerio），构建了多种可产生雌激素的生物传感器品系4,5,14,15,16,17。斑马鱼在构建生物传感器品系方面的主要优势在于其胚胎和幼体具有透明的身体，因此可以在不处死动物的情况下直接在活体中方便地观察荧光报告信号10。这一特性不仅符合动物保护原则，还具有重要研究价值，因为它允许对同一个体在不同处理时间点的反应进行连续观察18。

这些实验使用了一种载脂蛋白原报告基因转基因斑马鱼品系15. 用于开发的转基因载体构建体 Tg(vtg1:mCherry) 具有一个长（3.4 kbp）的天然卵黄原蛋白-1启动子。雌激素受体（ER）是一种由配体激活的增强子蛋白，属于类固醇/核受体超家族的代表性成员。ER可高亲和力地结合特定的DNA序列，即雌激素反应元件（EREs），并在雌二醇及其他雌激素类物质作用下转激活基因表达，因此启动子中EREs数量越多，响应越强19该Tg(vtg1:mCherry)转基因构建体的启动子区域含有17个ERE位点，预期可模拟内源性vtg基因的表达。15在性成熟的雌性个体中，荧光信号呈持续表达。然而，在雄性个体和胚胎中，肝脏中的表达仅在经雌激素类物质处理后才可见。图1).

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图 1：经 17-ß-雌二醇（E2）诱导后，vtg1:mCherry 转基因成年斑马鱼及 5 日龄胚胎肝脏中的红色荧光信号。  在雌性以及经 E2 处理的雄性（25 µg/L，暴露时间：48 小时）中，即使透过色素化的皮肤仍可观察到肝脏强烈的荧光信号。未经处理的雄性个体中无可见荧光信号（A）。经 E2 诱导（50 µg/L，暴露时间：0–120 hpf）后，5 日龄胚胎肝脏中亦可观察到红色荧光信号，而对照组胚胎中则无此信号（B）。尽管荧光信号在成年雌性中持续存在，但该品系中的雄性个体及胚胎更适用于雌激素效应的检测。（BF：明场，mCherry：红色荧光滤光观察，单层图像，标尺 A：5 mm，标尺 B：250 µm）请点击此处查看该图的高清版本。

与内源性卵黄原蛋白类似，mCherry 报告基因仅在肝脏中表达。由于卵黄原蛋白只有在雌激素存在时才会产生，因此对照组中没有荧光信号。由于表达仅局限于肝脏，结果的评估更为简便15。

已针对多种雌激素类化合物混合物以及环境样品对该品系胚胎的敏感性和可用性进行了研究15,20，大多数情况下均记录到了剂量-反应关系（图2）。然而，对于毒性较强、尤其是具有较强肝毒性的物质（例如，玉米赤霉烯酮），在处理后的胚胎肝脏中可能仅观察到非常微弱的荧光信号，且所能引起的最大荧光强度仅在极窄的浓度范围内即可达到，这使得建立剂量-效应关系变得困难20。

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图2：暴露于17-α-乙炔雌二醇（EE2）的5天龄vtg1:mCherry幼鱼肝脏的剂量-反应曲线图（A）和荧光图像（mCherry）（B）。 结果以受影响区域的信号强度与其面积乘积所得的积分密度表示（±SEM，n = 60）。100%表示观察到的最大值。荧光信号强度随浓度增加而逐渐增强。比例尺 = 250 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

环境中存在多种具有雌激素活性的物质，例如 17-β-雌二醇（环境浓度：0.1–5.1 ng/L）21、17-α-乙炔基雌二醇（环境浓度：0.16–0.2 µg/L）22、玉米赤霉烯酮（环境浓度：0.095–0.22 µg/L）23、双酚A（环境浓度：0.45–17.2 mg/L）24。利用 mCherry 转基因胚胎检测这些物质的纯活性形式时，荧光信号检测的最低可见效应浓度（LOEC）分别为：17-ß-雌二醇 100 ng/L、17-α-乙炔基雌二醇 1 ng/L、玉米赤霉烯酮 100 ng/L，以及双酚A 1 mg/L（96–120 hpf 处理），这些浓度非常接近或处于上述物质的环境浓度范围内15。Tg(vtg1:mCherry) 转基因品系可用于直接暴露后检测废水样品中的雌激素活性。该品系的灵敏度与常用的酵母雌激素检测法——生物发光酵母雌激素（BLYES）检测法相当15。借助该品系，已通过化学混合物验证了β-环糊精对玉米赤霉烯酮诱导毒性的保护作用20。

在最近的一份报告中，借助两种雌激素类玉米赤霉烯酮（ZEA）代谢物，证明了该转基因品系在体内的应用。 α- 和 β-zearalenol (α- ZOL 和 β-ZOL25该方案基线适用于研究多种化合物或环境样品对雌激素效应的影响 Tg(vtg1:mCherry) 胚胎

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方案

动物实验方案已获匈牙利动物福利法批准，所有研究均在处理个体达到自由摄食阶段之前完成。

1. 胚胎采集与处理

  1. 将 Tg(vtg1:mCherry) 斑马鱼维持在 25.5 ± 0.5 °C，pH = 7 ± 0.2，电导率 525 ± 50 μS/m，溶氧水平 ≥ 饱和度的 80%，光照周期为 14 小时光照和 10 小时黑暗。
  2. 在收获卵子的前一天下午，用系统水填充交配缸，并设置好用于交配的鱼。
  3. 将雄鱼和雌鱼放入缸中，并使用隔板将其分隔开。
  4. 次日早晨光照开启时移除隔板。每 15–20 分钟检查一次交配缸中是否有卵。
  5. 使用茶筛或细密网筛收集所有胚胎，并将其转移至一个大培养皿中，加入 E3 缓冲液（5 mM 氯化钠、0.17 mM 氯化钾、0.33 mM 氯化钙、0.33 mM 硫酸镁）或澄清的系统水。
  6. 将胚胎置于设定为 25.5 ± 0.5 °C 的培养箱中。
  7. 受精后 1–1.5 小时，在体视显微镜下用塑料移液管移除并丢弃未受精或分裂异常的卵。
    注意：未受精的卵呈不透明状；受精卵则透明。若需在发育的较晚阶段开始处理，应注意观察被处理个体的正常发育情况。
  8. 将筛选后的胚胎放入已标记并装有不同浓度测试物质的处理容器中（例如培养皿或组织培养板）。
  9. 将胚胎在 25.5 ± 0.5 °C 下继续培养至实验结束。
    注意：胚胎对各种雌激素类化合物可能表现出显著的个体敏感性差异，因此建议每组至少使用 15 个胚胎，并至少进行三次重复处理，以确保实验结果的可靠性。选择容器时需注意，每个胚胎的发育至少需要 200 µL 的水环境26。本实验中，胚胎在 25.5 ± 0.5 °C 下培养至 120 小时后（hpf）。
  10. 如有必要，更换测试溶液以维持处理浓度。更换溶液时应小心操作，避免损伤胚胎。
    注意：实验过程中也可同时观察胚胎的死亡率或亚致死效应。为获得可靠结果，测试物质的浓度应尽可能保持稳定。通过定期更换测试溶液可轻松实现这一目标。更换频率可能因测试物质而异，因此建议通过分析测定来检测测试物质的浓度变化，从而确定溶液更换的合适频率。

2. 拍照用幼虫的制备

  1. 提前配制含MS-222（三卡因甲烷磺酸盐）的4%甲基纤维素溶液。
    1. 具体操作：将4 mg/mL的MS-222加入100 mL双蒸水中，使其终浓度为0.168 mg/mL，并将溶液置于4 ˚C环境中。然后加入4 g甲基纤维素，使用磁力搅拌器搅拌，随后在4 ˚C下静置过夜。
    2. 次日再次搅拌，溶液即可使用。若甲基纤维素未完全溶解，可重新置于4 ˚C环境中，继续静置数小时。
  2. 使用巴斯德移液管将5日龄的幼虫按处理组分别转移至直径5 cm的培养皿中。
  3. 用塑料移液管吸除幼虫的处理液，然后向培养皿中加入2 mL 0.02% MS-222麻醉溶液。
    注意：麻醉通常在1分钟内起效。若幼虫受到触碰时不游动，则表明已处于麻醉状态。MS-222过量可能导致幼虫死亡。
  4. 将特制的直径10 cm培养皿的每个方格中加入含MS-222的4%甲基纤维素溶液（图3）。
    注意：使用塑料片（高1 mm，宽5 mm）在培养皿底部粘贴两个1.5 × 1.5 cm的方格区域。每个方格内可并列放置20条幼虫。除特制培养皿外，也可使用其他低边缘容器固定胚胎位置。

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图3：用于幼虫拍照前准备的10 cm培养皿，内含粘附的1.5 × 1.5 cm宽、1 mm厚的塑料片方块。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 将麻醉后的幼虫连同少量水一起转移至两个方格之一的甲基纤维素中。随后将幼虫从第一个方格转移至第二个方格。
    注意：通过此转移操作，用于拍照的4%甲基纤维素不会被稀释，且幼虫在成像过程中不会发生旋转。
  2. 在第二个方格中，使用剪去顶端至2 cm的微量移液器吸头将幼虫旋转并调整至左侧位置，并轻轻将其压至纤维素底部。
    注意：请勿使用其他类型的移液器吸头，以免对幼虫造成损伤。

3. 显微镜检查

注意：摄影过程不会导致动物死亡。通过将动物从甲基纤维素中取出并置于新鲜系统水或处理溶液中，可使其恢复清醒，因此在处理过程中可对同一动物个体进行多次观察。

  1. 为评估表达报告基因的信号，需使用相同的视角和设置对胚胎进行成像。
    注意：有关胚胎最佳定位方法，请参见步骤 2.6。文稿中的照片是在上述条件下拍摄的。明场成像条件：60 倍放大，曝光时间 6 ms，光圈 100%，增益 1.1；荧光成像条件：60 倍放大，曝光时间 300 ms，光圈 100%，增益 1，使用 mCherry 滤光片，光源为汞金属卤化物灯。拍照时使用了荧光体视显微镜、专用相机及显微镜配套软件。
  2. 将培养皿放置在显微镜载物台上。
  3. 聚焦于胚胎肝脏部位，并使用配套软件采集明场图像。
  4. 切换显微镜至 mCherry 滤光片，使用配套软件在荧光光源下采集肝脏的荧光图像。
    注意：所有荧光操作步骤均应在黑暗环境中进行。在采集明场图像与荧光图像之间，不得更改放大倍数、焦距或胚胎位置，以利于后续图像分析。
  5. 重复步骤 3.3 和 3.4，直至完成实验中所有胚胎的成像。

4. 确定积分密度

注意：比较荧光信号强度的最佳指标之一是积分密度值（即面积与平均灰度值的乘积）。测定积分密度最简便的方法之一是使用 ImageJ 软件27。该程序可通过互联网获取，并可安装在计算机上。

  1. 打开 ImageJ，然后通过拖放图像或点击 文件|打开 来上传待分析的荧光图像。
  2. 点击 图像|颜色|拆分通道，根据 RGB 颜色图将荧光滤光片生成的图像进行通道分离。
  3. 使用红色通道的图像光谱，关闭其他通道。
  4. 在图像中设定一个大小相近的椭圆形区域，以避免伪信号干扰评估。使用 椭圆 工具，尽可能准确地在高亮显示的肝脏区域上绘制椭圆。
  5. 如果信号较弱，可使用明场显微图像（即荧光图像对应的明场图像）来确定肝脏的位置。
  6. 点击 分析|测量，以确定信号强度和受影响区域的大小。软件将自动计算积分密度值（结果表中的 IntDen 列）。
  7. 重复步骤 4.1–4.6，继续分析，直至处理组中所有胚胎的荧光图像均被分析完毕。
  8. 保存数据，然后分析积分密度值。
    注意：分析过程中应始终选择相同大小的区域。待分析区域的大小取决于放大倍数、图像分辨率、拍摄设置等。可通过使用自定义宏来加快分析速度或提高准确性。例如，宏可用于确保在被检图像中选定的区域始终保持一致。有关创建适用于特定拍摄设置的最佳图像分析宏的详细说明，请参见 ImageJ 官方网站。

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结果

在本论文所述实验中，测试了两种雌激素类物质在受精后连续5天对Tg(vtg1:mCherry)转基因斑马鱼胚胎的作用，共设五个浓度梯度。我们探究了在暴露期结束时，由于这两种物质的影响，鱼类肝脏中是否出现荧光信号，以及两种物质的雌激素活性是否存在差异。结果评估基于荧光图像及积分密度值。总体而言，在能够存活至实验结束的个体所对应的测试浓度下，两种物质均诱导了外源基因在暴露期结束时的表达。而在未经处理的对照组鱼类中，未观察到任何荧光信号。

对于α-ZOL，在最高测试浓度（8 µM）下，所有个体均死亡，因此无法检测其荧光信号。在较低浓度（0.5 µM–4 µM）下，胚胎肝脏中观察到强烈的荧光信号（图4A）。荧光强度和荧光区域大小之间未观察到显著差异（p < 0.05）。α-ZOL的积分密度值（图4C）表明该物质可诱导荧光信号的出现。各处理组之间的积分密度值无显著差异（p < 0.05）。平均积分密度在31.26 ± 13.95（0.5 µM...

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讨论

利用生物监测器/生物指示剂来检测雌激素效应已在毒理学研究中广泛应用。体内模型具有突出作用，因为与体外试验不同，它们不仅能提供细胞或受体水平的反应信息，还可用于研究生物体内的复杂过程。已有多种用于研究雌激素效应的转基因斑马鱼品系被构建出来，其中本研究采用的是Tg(vtg1:mCherry)品系。本文所述方法展示了一种针对该品系胚胎的实验方案，用于在体内检测纯活性成分中的雌激素活性。

该品系的雄性个体和胚胎均适用于检测雌激素效应，但胚胎具有多项优势，使其更易于使用。特别是其身体透明，因此可轻松观察肝脏中的荧光信号。斑马鱼肝脏在受精后6小时（6 hpf）开始发育，并在50小时后（50 hpf）开始发挥功能。首先形成肝脏的左叶，在96小时（96 hpf）时肝脏右叶也出现。肝脏的最终形态大约在第5天（120 hpf）形成28,29。胚胎在2–3日龄时，其肝脏已能够产生内源性卵黄蛋白原14，这与Tg(vt...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由匈牙利国家研究、开发与创新办公室（NKFIH）从国家研究、开发与创新基金（NKFIA）获得资助；资助协议编号：NVKP_16-1-2016-0003，EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 项目由欧洲联盟共同资助，以及由创新与技术部授予的圣伊什特万大学主题卓越计划 NKFIH-831-10/2019。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
24孔组织培养板Jet BiofilTCP011024
氯化钙（CaCl2）Reanal Laborvegyszer Ltd.16383-0-27-39
GraphPad Prism 6.01 软件GraphPad Software Inc.
ImageJ 软件美国国立卫生研究院（National Institutes of Health, USA）公共访问软件，可从以下网址下载：http://imagej.nih.gov/
Leica Application Suite X 校准软件Leica Microsystems GmbH.我们使用了实验中描述的软件，但任何符合测试要求的摄影软件均可使用
Leica M205 FA 体视显微镜，Leica DFC 7000T 相机Leica Microsystems GmbH.我们使用了实验中描述的设备，但任何荧光体视显微镜均适用于本实验
硫酸镁（MgSO4）Reanal Laborvegyszer Ltd.20342-0-27-38
mCherry 滤光片Leica Microsystems GmbH.
甲基纤维素Sigma Aldrich Ltd.274429
微量移液器吸头（Microloader）Eppendorf GmbH.5242956003
巴斯德吸管VWR International LLC.612-1684
培养皿Jet BiofilTCD000060
氯化钾（KCl）Reanal Laborvegyszer Ltd.18050-0-01-33
氯化钠（NaCl）Reanal Laborvegyszer Ltd.24640-0-01-38
三卡因甲磺酸盐（MS-222）Sigma Aldrich Ltd.E10521

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