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利用 Tg(Vtg1:mcherry) 斑马鱼胚胎检测内分泌干扰物的雌激素效应

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DOI：

10.3791/60462

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2020年8月8日

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1Department of Aquaculture, Institute of Aquaculture and Environmental Safety, Faculty of Agricultural and Environmental Sciences, Szent István University, 2Institute of Cancer and Genomic Sciences, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham

本文内容

摘要

本文提供了一种利用斑马鱼胚胎Tg(vtg1: mCherry)检测雌激素效应的详细实验方案。该方案涵盖了鱼类的繁育与胚胎处理，并重点介绍了由内分泌干扰物（EDC）诱导的荧光信号的检测、记录及评估方法。

摘要

环境中存在许多内分泌干扰物（EDC），尤其是具有雌激素活性的物质。由于这些物质化学结构多样，检测难度较大；因此，越来越多的研究采用基于效应的检测方法，例如对雌激素效应敏感的生物监测/指示生物。这些生物监测生物包括多种鱼类模型。本方案介绍了转基因斑马鱼 Tg(vtg1: mCherry) 品系作为生物监测工具的应用，涵盖鱼类的繁育及胚胎处理过程，重点在于由内分泌干扰物诱导的荧光信号的检测、记录与评估。本研究的目的是展示利用 Tg(vtg1: mCherry) 转基因品系胚胎检测雌激素效应的方法。本工作通过测试两种具有雌激素活性的物质——α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇，记录了转基因斑马鱼胚胎 Tg(vtg1: mCherry) 在检测雌激素效应中的应用。所述方案仅为实验设计的基础，测试方法可根据实验终点和样品性质进行调整。此外，该方法还可与其他检测技术联用，从而促进该转基因品系在未来研究中的广泛应用。

引言

环境中存在大量内分泌干扰物（EDC），它们是危害最严重的物质之一。这些物质主要是来自天然资源水体中的雌激素类化合物。由于该类物质化学结构多样性，检测其存在十分困难，因为需要采用不同的分析方法才能实现有效检出。仅根据化学结构很难判断某种物质是否真正具有雌激素活性。此外，这些物质在环境中从不以纯态存在，其效应也可能受到其他化合物的影响1。这一问题可通过效应检测方法加以解决，例如利用能显示雌激素效应的生物监测/生物指示生物进行检测2,3,4,5。

近年来，已开发出多种基于细胞系6和酵母的检测系统2,3用于检测雌激素效应。然而，这些系统通常仅能检测物质与雌激素受体的结合2,3。此外，它们无法模拟生物体内复杂的生理过程，也无法检测对激素敏感的生命阶段；因此，常常导致假阳性或假阴性结果。

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方案

动物实验方案已根据匈牙利动物福利法获得批准，所有研究均在处理个体达到自由摄食阶段前完成。

1. 胚胎采集与处理

  1. 将 Tg(vtg1:mCherry) 斑马鱼维持在 25.5 ± 0.5 °C，pH = 7 ± 0.2，电导率 525 ± 50 μS/m，溶氧水平 ≥ 饱和度的 80%，光照周期为 14 小时光照和 10 小时黑暗。
  2. 在收获卵子的前一天下午，用系统水填充交配缸，并设置好用于交配的鱼。
  3. 将雄鱼和雌鱼放入缸中，并使用隔板将其分隔开。
  4. 次日早晨光照开启时移除隔板。每 15–20 分钟检查一次交配缸中是否有卵。
  5. 使用茶筛或细密网筛收集所有胚胎，并将其转移至一个大培养皿中，加入 E3 缓冲液（5 mM 氯化钠、0.17 mM 氯化钾、0.33 mM 氯化钙、0.33 mM 硫酸镁）或清澈的系统水。
  6. 将胚胎置于设定为 25.5 ± 0.5 °C 的培养箱中。
  7. 受精后 1–1.5 小时，在体视显微镜下用塑料移液管移除并丢弃未受精或分裂异常的卵。
    注意：未受精的卵呈不透明状；受精的卵呈透明状。若需在发育的较晚阶段开始处理，应注意观察被处理个体的正常发育情况。
  8. 将筛选后的胚胎放入已标记并装有不同浓度测试物质的处理容器中（例如培养皿或组织培养板）。
  9. 将胚胎在 25.5 ± ....

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结果

在本论文所描述的实验中，测试了两种雌激素类物质在受精开始后五个浓度梯度下对Tg(vtg1:mCherry)转基因斑马鱼胚胎持续作用5天的影响。我们研究了在暴露结束时，由于这两种物质的作用，鱼类肝脏中是否出现荧光信号，以及这两种物质的雌激素活性是否存在差异。结果根据荧光图像和积分密度值进行评估。总体而言，在能够存活至实验结束的个体所对应的测试浓度下，两种物质均诱导了外源基因在暴露结束时的表达。而在未经处理的对照组鱼类中，未观察到任何荧光信号。

对于α-ZOL，在最高测试浓度（8 µM）下，所有个体均死亡，因此无法检测其荧光信号。在较低浓度（0.5 µM–4 µM）下，胚胎肝脏中观察到强烈的荧光信号（图4A）。荧光强度和荧光区域大小之间未观察到显著差异（p < 0.05）。α-ZOL的积分密度值（图4C）表明该物质可诱导荧光信号的出现。各处理组之间的积分密度值无显著差异（p < 0.05）。平均积分密度在31.26 ± 13.95（0.5.......

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讨论

利用生物监测器/生物指示剂来检测雌激素效应已在毒理学研究中广泛应用。体内模型具有突出作用，因为与体外试验不同，它们不仅能提供细胞或受体水平的反应信息，还可用于研究生物体内的复杂过程。已有多种用于研究雌激素效应的转基因斑马鱼品系被构建出来，其中本研究采用的是Tg(vtg1:mCherry)品系。本文所述方法展示了一种针对该品系胚胎的实验方案，用于在体内检测纯活性成分中的雌激素活性。

该品系的雄性个体和胚胎均适用于检测雌激素效应，但胚胎具有多项优势，使其更易于使用。特别是其身体透明，因此可轻松观察肝脏中的荧光信号。斑马鱼肝脏在受精后6小时（6 hpf）开始发育，并在50小时后（50 hpf）开始发挥功能。首先形成肝脏的左叶，在96小时（96 hpf）时肝脏右叶也出现。肝脏的最终形态大约在第5天（120 hpf）形成28,29。胚胎在2–3日龄时，其肝脏已能够产生内源性卵黄蛋白原14，这与Tg(vt.......

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由匈牙利国家研究、开发与创新办公室（NKFIH）从国家研究、开发与创新基金（NKFIA）获得资助；资助协议编号：NVKP_16-1-2016-0003，EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 项目由欧洲联盟共同资助，以及由创新与技术部授予的圣伊什特万大学主题卓越计划 NKFIH-831-10/2019。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
24孔组织培养板Jet BiofilTCP011024
氯化钙（CaCl2）Reanal Laborvegyszer Ltd.16383-0-27-39
GraphPad Prism 6.01 软件GraphPad Software Inc.
ImageJ 软件美国国立卫生研究院（National Institutes of Health, USA）公共访问软件，可从以下网址下载：http://imagej.nih.gov/
Leica Application Suite X 校准软件Leica Microsystems GmbH.我们使用了实验中描述的软件，但任何符合测试要求的摄影软件均可使用
Leica M205 FA 体视显微镜，Leica DFC 7000T 相机Leica Microsystems GmbH.我们使用了实验中描述的设备，但任何荧光体视显微镜均适用于本实验
硫酸镁（MgSO4）Reanal Laborvegyszer Ltd.20342-0-27-38
mCherry 滤光片Leica Microsystems GmbH.
甲基纤维素Sigma Aldrich Ltd.274429
微量移液器吸头（Microloader）Eppendorf GmbH.5242956003
巴斯德吸管VWR International LLC.612-1684
培养皿Jet BiofilTCD000060
氯化钾（KCl）Reanal Laborvegyszer Ltd.18050-0-01-33
氯化钠（NaCl）Reanal Laborvegyszer Ltd.24640-0-01-38
三卡因甲磺酸盐（MS-222）Sigma Aldrich Ltd.E10521

参考文献

  1. Sumpter, J. P. Endocrine Disrupters in the Aquatic Environment : An Overview. Acta Hydrochimica et Hydrobiologica. 33 (1), 9-16 (2005).
  2. Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity o....

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重印与许可

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