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利用胎儿肠类器官在体外模拟哺乳到断奶的过渡过程

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DOI：

10.3791/60470

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2019年11月15日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Gastroenterology and Hepatology, Tytgat Institute for Intestinal and Liver Research, Amsterdam UMC, AG&M, University of Amsterdam, 2Department of Pediatrics, Amsterdam UMC, University of Amsterdam

本文内容

摘要

本方案描述了如何利用培养30天的小鼠晚期胎儿肠类器官在体外模拟哺乳到断奶的过渡过程。

摘要

哺乳期结束时，许多哺乳动物的肠上皮会发生显著变化，这些变化与消化固体食物的能力相关。该过程被称为哺乳期向断奶期的转变，其特征是新生上皮被成年上皮所取代，并伴随代谢和形态学上的调整。这些复杂的发育性变化源于肠上皮细胞内在的遗传程序，但在一定程度上可受到外源性因素的调控。对小鼠晚期胎儿来源的原代肠上皮细胞进行长期培养，可在体外重现哺乳期向断奶期的转变过程。本文介绍了一种适用于在体外模拟该过程的小鼠胎儿肠类器官培养的详细实验方案。我们描述了多种可用于随时间监测与哺乳期向断奶期转变相关的肠道功能变化的实用检测方法。此外，我们还提供了一个外源性因子在体内影响哺乳期向断奶期转变的示例，以代表在体外调控该转变时机的可能性。这种体外方法可用于研究哺乳期向断奶期转变的分子机制及其调控因子。重要的是，从动物实验伦理的角度出发，替代 i通过体外模型研究体内模型，有助于优化动物实验，甚至可能减少用于研究肠道成熟过程的动物使用数量。

引言

在包括小鼠和人类在内的多种哺乳动物中，新生个体的肠道具有若干与完全成熟的肠上皮不同的特征。这些特征有助于新生肠上皮细胞消化和吸收富含脂肪、碳水化合物含量较低的乳汁，其中乳糖是主要的碳水化合物。新生肠上皮细胞的刷状缘表达双糖酶乳糖酶-根皮苷水解酶（Lct）1，以消化乳汁中的双糖乳糖。在哺乳期结束后，肠上皮细胞适应于消化富含复杂碳水化合物而脂肪含量较低的固体食物。这一转变表现为刷状缘双糖酶的表达由乳糖酶转变为蔗糖酶-异麦芽糖酶（Sis）和海藻糖酶（Treh），这些酶能够消化固体食物中存在的更复杂的碳水化合物2。另一个代谢转变与乳汁中精氨酸浓度较低有关。为了满足对精氨酸的需求，新生肠上皮细胞表达精氨酸生物合成的限速酶——精氨琥珀酸合成酶-1（Ass1），以合成精氨酸3。相比之下，成年肠上皮细胞表达精氨酸酶2（Arg2），该酶可分解在固体食物中含量丰富的精氨酸。此外，新生肠上皮表达免疫球蛋白的新生Fc受体（FcRn），介导母源IgG从乳汁吸收进入血液循环4。FcRn的表达在哺乳期向断奶期过渡过程中显著下降5。在小鼠中，潘氏细胞的成熟发生在出生后，与隐窝的形成和成熟同步，并以表达溶菌酶（Lyz）和防御素等抗菌肽为特征6。

所有这些变化均属于哺乳到断奶的转变过程，该过程在小鼠出生后逐渐发生，持续至一个月龄左右，此时肠上皮达到成熟的成年状态。哺乳到断奶的转变由肠道内在调控机制决定，并随发育程序进行。转录因子B淋巴细胞诱导成熟蛋白-1（Blimp-1）在这一内在成熟过程中发挥关键作用7。Blimp-1在新生期上皮中高表达，而在哺乳到断奶的转变过程中其表达逐渐下降并最终消失，因此可作为新生期肠上皮的可靠标志物。尽管该过程主要由内在机制调控，但也可受到外界因素的影响。例如，皮质醇的合成类似物地塞米松已被证实可在体内加速肠道成熟8,9。

目前用于研究肠道上皮成熟过程（包括哺乳期向断奶期转变）的体外模型，多采用成年上皮细胞系和/或成年类器官，这些模型具有成年肠道上皮的特征。我们近期已证明，从晚期胎儿肠道分离的原代肠道上皮细胞在体外培养形成类器官时，能够成熟并重现哺乳期向断奶期的转变过程10我们进一步证明，该肠道体外成熟过程的速度与体内过程相同。最后，我们采用地塞米松以加速成熟过程，其方式与文献中所述的相同。 体内 研究。

本文概述了一种用于分离和培养小鼠晚期胎儿肠道类器官的精确方案。我们描述了为长期类器官培养而采集样本的最佳方法，以及在体外监测哺乳期向断奶期过渡的技术。该方案可用于研究肠道上皮成熟过程及其调控因子的体外实验，有助于提高数据的通量、质量及转化价值，并减少动物使用量。

方案

本研究严格遵循阿姆斯特丹大学动物实验伦理委员会制定的实验动物护理与使用机构指南，并完全符合欧盟关于为科学目的使用动物的指令2010/63/EU（ALC312）以及荷兰动物研究相关国家法规。

1. 胎儿小肠类器官的分离

  1. 根据批准的伦理规范，使用手术剪对 E18-E20 胚胎进行断头处死。
  2. 安乐死后立即使用肠剪小心切开胚胎的下腹部，并取出整个肠道。
    注意：为了在体外实现适当的吮吸到断奶的过渡及成熟，必须在妊娠 E18 至 E20 期间获取肠道进行分离。
  3. 使用两把小镊子拉伸肠道。以胃和阑尾为解剖标志，分离小肠的近端和远端部分。
    注意：若解剖操作仔细，也可同时分离结肠。以阑尾为指引将其分离（图1）。
  4. 将肠道纵向打开：用沿长轴放置的刀片固定肠道，然后用镊子（镊子的两臂分别置于刀片两侧）沿刀片滑动牵拉肠道，使其纵向展开。随后将打开的肠道切成 1 cm 长的小段。
  5. 准备两个 50 mL 离心管，每管加入 10 mL 冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）。将小肠的近端和远端部分（以及适用时的结肠）分别转移至不同离心管中。在继续解剖其他小鼠胚胎肠道时，将离心管置于冰上保存。将同一只窝产的所有肠道组织收集于同一管中。
    注意：通常一窝包含 6–10 个胚胎，所有胚胎的肠道需合并处理。此数量应足以在 48 孔板中每段肠道获得 4–8 个类器官培养孔。
  6. 按照先前描述的方法进行类器官分离11。简而言之，用冰上预冷的 PBS 清洗肠段，随后在 4 °C 条件下用 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）孵育 30 分钟，通过剧烈振荡清洗（使用含 10% 胎牛血清（FCS）的冰上预冷 PBS）使隐窝从组织中解离，经 70 µm 细胞筛过滤后，在 4 °C 条件下以 150 × g 离心 5 分钟收集隐窝。
  7. 根据沉淀物大小，在预热的 48 孔板中每孔接种 4 至 8 孔隐窝，每孔使用 20 µL 悬浮于细胞外基质凝胶中的隐窝。将细胞外基质凝胶置于 37 °C 培养箱中孵育 10 分钟，使其凝固。
    注意：考虑到仅有 40% 至 50% 的分离隐窝能够形成类器官，目标密度应为每孔 250 至 300 个类器官。初次铺板时可先加入少于所需量的细胞外基质凝胶，铺完第一孔后在显微镜下观察隐窝密度是否理想，必要时再补充更多凝胶。
  8. 同时配制 ENR 培养基：取 14 mL 高级 DMEM/F12 培养基（1:1 +++，添加 1× HEPES、0.01 M L-谷氨酰胺和 0.2 U/mL 青霉素/链霉素），加入 4 mL Noggin 条件培养基、2 mL Rspondin 条件培养基、400 µL 1× B27 添加剂、200 µL 1× N2 添加剂、50 µL 1.25 mM N-乙酰半胱氨酸以及 20 µL 0.05 µg/mL 表皮生长因子（EGF）。
    注意：培养结肠类器官时，需额外补充 50% Wnt 条件培养基。
  9. 每孔加入 250 µL ENR 培养基。

2. 胎儿类器官的培养

  1. 每周更换培养基三次。类器官在培养一个月后达到成熟。
  2. 每次传代后第3天，使用光学显微镜计数球状体和类器官的数量。每种条件下至少定量3个孔，并统计每个孔中所有类器官的数量。
    注意：随着时间推移，球状体数量减少，而类器官数量增加（图2）。
  3. 每周通过机械解离法传代一次类器官，具体步骤如下：
    1. 移除培养基，加入1 mL预冷的Advanced DMEM/F12 1:1 +++培养基。将含有类器官的细胞外基质凝胶全部收集至15 mL离心管中。在1000 µL滤芯吸头上方使用200 µL吸头，上下吹打20次以破碎类器官。
    2. 在4 °C下以150 × g 离心5分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于每孔20 µL细胞外基质凝胶中。通常情况下，胎儿类器官可按1:2比例进行扩增。
    3. 让细胞外基质凝胶在室温下凝固5–10分钟。每孔加入250 µL ENR培养基。

3. RNA和蛋白质水平的成熟度分析

  1. 每次传代后每3天分析一次培养物，持续1个月（即达到完全成熟所需的时间）（图3）。
    注意：胎儿类器官培养具有动态性（视频1），为避免机械破坏后类器官正常再生带来的差异，必须在每次传代后的相同时间点采集样本。
  2. RNA提取
    1. 使用200 µL RNA裂解缓冲液收集3孔类器官，每孔裂解缓冲液中添加2 µL β-巯基乙醇。将含β-巯基乙醇的RNA裂解缓冲液加入孔中后，确保所有含类器官的细胞外基质凝胶均转移至无RNase的1.5 mL离心管中。
    2. 剧烈涡旋振荡，并于-80 °C保存不超过1个月。使用市售的硅胶柱离心柱试剂盒提取RNA。
    3. 为提高RNA质量，在洗涤步骤后加入500 µL 80%乙醇，轻轻颠倒离心柱混匀。在11,000 × g 条件下离心2分钟，彻底干燥离心柱。
      注意：为彻底去除硫氰酸胍残留，应将离心管倒置并轻弹管壁3至5次，使80%乙醇清洗管盖内侧。
    4. 为提高RNA得率，在加入无RNase水后等待1-2分钟再进行离心。将首次洗脱液重新加回到离心柱中进行第二次洗脱，以实现RNA的再洗脱。
      注意：提取的RNA质量足以用于全基因组表达分析。请检查RNA完整性数值（RIN）是否高于8。
  3. 蛋白质提取
    1. 使用250 µL预冷的细胞回收溶液收集5孔类器官至一个15 mL离心管中。冰上孵育至少30分钟，以溶解细胞外基质凝胶（此举可减少细胞外基质凝胶对蛋白质的贡献）。
    2. 用预冷的PBS洗涤，加入250 µL细胞裂解缓冲液，于-80 °C保存。
      注意：超声处理后，样品可用于检测酶活性或进行Western印迹分析。
  4. 免疫染色
    1. 使用250 µL预冷的细胞回收溶液收集2孔类器官至一个15 mL离心管中。冰上孵育至少30分钟，以溶解细胞外基质凝胶（此举可降低染色背景）。用预冷的PBS洗涤。
    2. 使用500 µL 4%多聚甲醛（PFA）在4 °C固定类器官1小时。用预冷的PBS洗涤。随后根据已发表的方案12进行全类器官免疫荧光染色或石蜡包埋。
      注意：操作类器官时应使用塑料巴斯德吸管，以避免破坏其结构。

4. 外源性因素（以地塞米松为例）对类器官成熟过程的影响

  1. 培养的第一天，在类器官中加入 0.01 M 地塞米松。在整个一个月的培养期间，每次更换培养基时均添加新的地塞米松，使类器官持续与地塞米松共同孵育。
  2. 基因表达分析
    1. 按照上述方法提取 RNA。同时对所有待比较的样本（处理组与未处理组）进行 cDNA 合成。随后采用偏好的 qRT-PCR 方法进行检测。
    2. 每次对胎儿类器官使用新的处理方式时，均应使用 GeNorm 方法鉴定出两个最稳定的参考基因。相对表达量计算时采用所选两个参考基因的几何平均值。
      注：可用于小鼠胎儿类器官测试的参考基因建议包括：Cyclophilin、Gapdh、βactin、36b4、Hprt、Rpl4、Rpl32、Ppib 和 Tbp。
    3. 为研究某一特定外源性因子如何影响小鼠胎儿类器官的出生后成熟过程，应评估以下所有基因。
      1. 检测胎儿期标志物乳糖酶（Lct）、精氨酰琥珀酸合成酶 1（Ass1）、B 淋巴细胞诱导成熟蛋白 1（Blimp-1）和新生儿 Fc 受体（FcRn）在培养前两周内表达是否下降，并在后续培养期间完全消失（图 4C）。分析该表达模式是否发生改变。
      2. 检测成体标志物蔗糖-异麦芽糖酶（Sis）、精氨酸酶 2（Arg2）、海藻糖酶（Treh）和溶菌酶（Lyz）在培养两周后表达是否上升（图 4D）。分析该表达模式是否受外源性因子影响。
        注：地塞米松是一种可加速胎儿类器官成熟的外源性因子，可在所有旨在测试其他外源性因子的实验中作为阳性对照使用。
  3. 酶活性分析
    1. 按照上述方法提取蛋白。根据 Dahlqvist 和 Messer 发表的方案检测肠道双糖酶活性13,14。
    2. 配制 0.625 M 马来酸缓冲液（pH 6.0），4 °C 保存可稳定 3 个月。使用该缓冲液配制以下溶液：0.05 M 乳糖（加入对羟基汞苯甲酸钠作为稳定剂以抑制溶酶体 β-半乳糖苷酶活性）、0.05 M 麦芽糖、0.05 M 蔗糖和 0.05 M 海藻糖。
      注：上述溶液可在 4 °C 保存 5 天。进行检测前应置于冰上。
    3. 通过将 5.56 M 葡萄糖溶液用超纯水稀释，配制检测用标准品，获得以下浓度的溶液：0.125 M、0.1 M、0.075 M、0.05 M 和 0.025 M。
      注：该溶液在 4 °C 下至少可稳定保存 3 个月。
    4. 在 96 孔板中于 37 °C 孵育 60 分钟：
      - 30 µL 类器官裂解液 + 30 µL 乳糖
      - 30 µL 类器官裂解液 + 30 µL 蔗糖
      - 30 µL 十倍稀释的类器官裂解液 + 30 µL 麦芽糖
      - 30 µL 五倍稀释的类器官裂解液 + 30 µL 海藻糖
      - 30 µL 未稀释的类器官裂解液 + 30 µL 马来酸，作为空白对照（样本背景）
      - 30 µL 每种葡萄糖标准品
      - 30 µL 超纯水，作为空白对照
      - 30 µL 阳性对照（需优化稀释比例；裂解的胎儿肠组织可用于乳糖酶活性对照，裂解的成体肠组织可用于蔗糖酶、麦芽糖酶和海藻糖酶活性对照）
      注：样品稀释应使用细胞裂解缓冲液。检测前保持样品和 96 孔板置于冰上。
    5. 为测定类器官裂解液中酶与其相应底物孵育后产生的葡萄糖量，迅速加入 200 µL PGO 显色液，并在 37 °C 下每隔 5 分钟测量一次 450 nm 处的吸光度，持续 30 分钟。
      注：PGO 显色液需新鲜配制。使用含 10 U/mL 葡萄糖氧化酶、2 U/mL 过氧化物酶和 7.88 mmol/L 邻联茴香胺的 0.5 mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH 7.0）。加入 96 孔板前，溶液应恢复至室温。
    6. 根据葡萄糖标准曲线计算酶活性，并校正总蛋白含量（通过二辛可宁酸法（BCA）测定）。酶活性应以 µM 葡萄糖/µg 蛋白·min-1 表示（图 5B）。
      注：可使用市售的精氨酸酶活性检测试剂盒测定精氨酸酶活性。

结果

胎儿肠上皮细胞的长期培养
体外模拟哺乳期向断奶期过渡的实验方案依赖于在长期培养过程中对胎儿类器官的正确操作。从小鼠 E18-E20 胚胎中分离出的近端和远端肠道组织按（图1）所示进行分离。分离后，将上皮细胞接种于细胞外基质凝胶滴中（图2）。胎儿类器官通常需要经过四次传代、约 28–30 天的培养，才能成熟至成体状态。在此期间，可收集处于不同成熟阶段的细胞（图3）。

体外模拟哺乳期到断奶期转变的代表性下游分析
为确认分离得到的胎儿类器官具有明确的近端或远端特征，需比较近端标志物如一剪切结构域家族成员2（Onecut2）和GATA结合蛋白4（Gata4）以及远端标志物如脂肪酸结合蛋白6（Fabp6）和鸟苷酸环化酶激活因子2A（Guca2a）在近端与远端类器官培养物中的表达水平（图4A,B）。体外哺乳期到断奶期的转变可通过两组基因进行监测：胎儿期标志物（图4C）和成体标志物（图4D）。在培养过程中，胎儿期标志物的表达应逐渐下降，而成体标志物的表达则应逐渐上升（图4C,D）。

利用外源性因子作为体外吮吸到断奶转变的调节剂
在本实验方案中，地塞米松（一种合成的糖皮质激素）被用作能够调节体外吮吸到断奶转变过程的外源性因子的示例。图5中的代表性数据表明，外源性因子的作用最好通过多种检测方法来确定，因为这些作用不一定是基因组层面的。例如，对于蔗糖-异麦芽糖酶，其RNA和蛋白质表达均在地塞米松处理后被诱导（图5A），而海藻糖酶的表达仅在蛋白质水平上发生变化（图5B）。

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图1：小鼠胎儿小肠的分离。 （A）解剖并拉伸后的胎儿肠道照片，包括胃、近端和远端小肠、阑尾和结肠。黑线指示切割位置，以分离近端和远端小肠。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：胎儿类器官培养第3天、第17天和第28天近端与远端的代表性显微图像。 所有图像均在传代后第3天获取，显示随着时间推移类球体数量减少。比例尺：500 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

视频 1：代表性视频，展示胎儿类器官培养从第 4 天到第 6 天的动态过程。 请点击此处观看视频。（右键可下载。）

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图3：随时间分析肠道成熟过程的类器官采集示意图。 近端和远端胎儿类器官培养物应培养一个月，每周传代一次。成熟度分析样本应在分离后第3天以及每次传代后的每3天采集。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：胎儿类器官近端与远端肠道成熟标志物的代表性qRT-PCR结果。 (A近端标记物 Onecut2 和 Gata4 主要在近端类器官培养物中表达，而（B远端标记物 Fabp6 和 Guca2a 主要在远端类器官培养物中表达。C胎儿标志物 Lct, Ass1, Blimp-1 和 FcRn 减少和（D成体标志物 Sis, Arg2，Treh 和 Lyz 在近端和远端类器官培养物中随时间增加。误差线代表标准误（SEM）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图5：外源性因子地塞米松可调节胎儿类器官的成熟。 （A）与对照类器官相比，经地塞米松处理的类器官在培养第12天时，胎儿标志物Blimp-1的基因表达降低；而成人标志物蔗糖-异麦芽糖酶（Sis）的基因表达（B）和酶活性（C）均升高。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本方案描述了晚期胎儿肠道类器官的长期培养方法，以在体外模拟哺乳到断奶的转变过程。该培养过程中的成熟速度与体内相当，并在培养一个月后完成。文中详细介绍了利用定量RNA和蛋白质技术对此类培养物进行的下游分析。

本方案使用 E18-E20 小鼠胚胎的原代肠细胞。用于生成类器官的原代小鼠细胞的发育阶段在此方案中尤为关键。若使用更早期的发育阶段细胞，将形成肠类球体，这些类球体可在较长时间内维持其特异的胎儿基因表达，向成年类器官的转化极为有限15,16。只有晚期胎儿阶段的类球体才具备在体外转化为成年类器官的能力10。为了最大程度地利用外界因素对肠道成熟影响的时间窗口，建议采用晚期胎儿阶段的肠组织，而非已出生并暴露于微生物和母乳的幼鼠肠组织。已有报道指出，某些细菌代谢产物和乳汁成分可作为肠道成熟过程的调节因子17。

为了获得足够数量的细胞，以维持培养一个月，从而研究从出生到成年的整个成熟过程，同时收集用于下游分析的样本，应使用6-8个胚胎的肠道作为起始材料。建议使用相同发育阶段的胚胎进行培养。我们不建议将不同窝的胚胎混合使用，因为发育阶段的微小差异可能会影响成熟相关基因的表达。

本方案描述了从小肠近端和远端生成类器官的方法，以维持肠道不同节段的发育特征。作为替代方案，可使用全长小肠来研究整体成熟过程，通过特定标志物表达的上调或下调进行评估。在后一种情况下，可使用较少的胚胎来分离肠细胞以启动培养。

本实验方案采用三维类器官培养技术。由于类器官在培养过程中经历动态生长，因此在传代后相同时间点采集样本进行后续分析至关重要。在本方案中，我们选择传代后第3天进行采样，因为此时处于两次传代之间的中期阶段，类器官具有明显的芽状结构，且细胞死亡极少或几乎没有。也可选用传代后的其他时间点，但在整个实验过程中应保持一致。我们不建议在传代后培养超过7天，因为类器官腔内死亡细胞的增加可能影响实验结果。

在我们的实验中，我们以地塞米松作为外源性因子的示例，文献中已明确表明并深入研究其在体内加速肠道成熟的作用9,18。地塞米松通过基因组和非基因组两种途径发挥其作用。例如，在基因组调控层面，可观察到Sis mRNA 水平出现过早升高；在非基因组层面，我们观察到消化酶（如海藻糖酶）活性发生改变。这些现象均与文献所述的地塞米松对蔗糖酶基因激活的特异性作用以及对肠道刷状缘酶的非基因组激活效应一致19。外源性因子（如合成性糖皮质激素）能够在类器官培养中以类似于体内的方式调节哺乳期向断奶期转变的某些方面，这一事实进一步确立了小鼠胎儿肠道类器官作为研究各类肠道成熟调节剂的模型价值。

尽管人类肠道上皮的形态成熟在子宫内妊娠22周时已完成，但肠道屏障功能的成熟持续至儿童期，且与喂养方式、菌群发育及免疫应答密切相关。由于在这些发育阶段获取人类组织样本极为有限，体外小鼠模型的转化价值在于能够高通量筛选可调控肠道成熟过程的因素，该过程在哺乳期哺乳动物中具有保守性。

重要的是，就研究中的动物伦理而言，该模型有助于优化动物实验，因为它不涉及对动物实施的干预措施。通过重新设计研究问题，将其限定为一个或两个培养时间点，可以在一次培养中测试多个组分，从而进一步减少动物使用数量。

披露

作者声明无任何利益冲突。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
高级DMEM/F12 1:1Invitrogen12634-028
精氨酸酶活性检测试剂盒Sigma-AldrichMAK112-1KT
B27添加剂Invitrogen17504-044100倍浓缩
BCA蛋白定量试剂盒Fisher10741395
细胞裂解缓冲液Cell Signaling Technology9803S
细胞回收溶液Corning B.V.354253
70µM细胞筛BD/VWR734-0003
地塞米松Sigma-AldrichD4902
EDTAMerck10,84,18,250EDTA Titriplex III
表皮生长因子（EGF）InvitrogenPMG8045
乙醇Merck1,00,98,31,000
葡萄糖溶液Sigma-AldrichG6918
GlutamaxInvitrogen35050-038100倍浓缩
HEPES缓冲液Invitrogen15630-0561M
Isolate II RNA Mini KitBiolineBIO-52073
乳糖Sigma-AldrichL3625α-乳糖一水合物
马来酸缓冲液Sigma-AldrichM0375马来酸
麦芽糖Sigma-AldrichM5885D-(+)-麦芽糖一水合物 >99%
MatrigelCorning B.V.356231生长因子减少型基底膜基质
Millipore水N.A.
N2添加剂Invitrogen17502-048100倍浓缩
N-乙酰半胱氨酸Sigma-AldrichA9165
Noggin条件培养基自制
邻二茴香胺（o-dianisidine）Sigma-Aldrich191248
PBS缓冲液自制
青霉素/链霉素Invitrogen15140-1220.2 U/mL
PGO酶制剂Sigma-AldrichP-7119-10CAP含过氧化物酶/葡萄糖氧化酶的胶囊
对羟基汞苯甲酸钠Sigma-Aldrich55540
Rspondin条件培养基自制
蔗糖Sigma-Aldrich84097
海藻糖Sigma-AldrichT5251D-海藻糖二水合物
Tris-HCl缓冲液自制
β-巯基乙醇Sigma-AldrichM3148

参考文献

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