大鼠胡萝卜动脉压力控制段气球损伤与腹腔ventit 治疗应用

心血管疾病（CVD）仍然是全球的主要死因^。动脉粥样硬化是大多数 CVD 相关发病率和死亡率的根本原因。动脉粥样硬化是动脉内斑块的积累，导致流明变窄，妨碍器官和脱血组织²的适当血液注入。治疗严重动脉粥样硬化的临床干预措施包括带支架或不放置的气球血管成形术。这种干预包括将气球导管推进到斑块的部位，并充气气球将斑块压缩到动脉壁上，扩大发光区域。然而，这一程序损害了动脉，导致动脉损伤反应^3。这种损伤反应的长时间激活导致动脉恢复，或重新缩小，辅之以新皮质增生和血管重塑。在血管成形术中，刺激层被内皮细胞破坏，导致立即血小板吸收和局部炎症。局部信号诱导血管平滑肌肉细胞（VSMC）和冒险成纤维细胞的表型变化。这导致VSMC和成纤维细胞向内迁移和扩散到流明，导致新金体增生^4，5。循环的祖细胞和免疫细胞也有助于恢复体积^6。在适用的情况下，药物疏松支架（DES）是目前抑制重生⁷的标准。然而，DES抑制动脉再内皮化，从而创造一个亲血栓形成的环境，可能导致后期支架血栓形成^8。因此，动物模型对于了解再造病的病理生理学，以及开发更好的治疗策略以延长再血管化程序的疗效都是不可或缺的。

几个大小动物模型⁹被用于研究这种病理学。其中包括动脉发光侧的气球损伤^3、10或线伤^11，以及动脉周围的部分粘合¹²或袖口放置^13。气球和电线损伤都使动脉内皮层凹陷，模仿血管成形术后的临床情况。特别是，气球损伤模型使用与临床环境类似的工具（即气球导管）。气球损伤最好在大鼠模型中执行，因为大鼠动脉适合市售气球导管。在这里，我们描述了一个压力控制的段动脉损伤，一个成熟的，修改版本的老鼠胡萝卜动脉气球损伤。这种压力控制的方法密切模仿临床血管成形术，并允许可重复的新生儿增生形成两周后受伤^14，15。此外，这种压力控制的动脉损伤导致完全内皮层恢复2周后手术^16。这直接对比了最初的气球损伤模型，由Clowes描述，其中内皮层永远不会回到全覆盖^3。

手术后，可以通过多种方法对受伤的动脉进行治疗或针对受伤动脉。此处描述的方法使用嵌入在多音压凝胶溶液中的小分子的间接应用。具体来说，我们应用100μM肉碱醛溶液在25%的普鲁罗尼-F127凝胶到动脉受伤后立即抑制新皮质增生形成^15。多音速-F127是一种无毒、可热可逆的凝胶，能够以受控的方式在当地输送药物^。同时，动脉损伤是局部的，因此地方管理允许测试一个积极的原则，同时尽量减少偏离目标的影响。然而，使用这种方法进行治疗的有效交付将取决于所使用的小分子或生物的化学成分。

这里描述的所有方法都得到了北卡罗来纳大学教堂山分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 术前程序

1. 消毒手术器械。手术前自动切除所有手术器械。如果在同一天进行多次手术，则使用干珠消毒器在手术之间对仪器进行消毒。
2. 在25%的普鲁罗尼-127凝胶（在无菌蒸馏水中稀释）中准备治疗。
3. 设置一个2F Fogarty气球导管到充气器，并将导管的气球端放在一个充满盐水溶液的1mL注射器中。
4. 通过将老鼠放在一个室中，用5%的异氟兰来诱导麻醉。
   1. 把老鼠从房间里移开，记录老鼠的体重。使用剪发器在腹颈区域剃毛皮。
   2. 将大鼠用5%的异氟化液放回腔室，以确保麻醉的感应。
5. 将大鼠苏平放在手术平台上，将脸部插入鼻锥，使大鼠脸朝向外科医生。
   1. 将吸入麻醉降低到1.5%异氟化。通过四只脚的脚趾捏反射来验证麻醉的深度。
   2. 把四条腿都贴到手术台上。
6. 打开热灯。
7. 在皮下注射阿托平（0.01毫克/千克），以减少气道分泌物。
8. 在皮下注射卡普罗芬（5毫克/千克），用于预防性疼痛管理。如果抗炎药物在实验中不能接受，请参阅步骤 3.2.2 和 3.2.3。
9. 使用无菌棉签将润滑剂眼药膏涂抹在双眼上，以防止角膜在手术过程中干燥。
10. 在 70% 乙醇之间交替的圆形运动中将颈部拭子三次，然后从剃光区域中心向外挥动贝塔丁，对切口部位进行消毒。
11. 渗透切口线 s.c. 与 0.25% 布皮瓦卡因。
12. 在处理无菌手术器械和用品之前戴上无菌手术手套。
13. 将所有自动切除的手术器械放在无菌手术纸上。
14. 切三个独立的 1 英寸链无菌 7 - 0 丙烯缝合。
15. 将棉签和纱布放在手术纸上。
16. 用无菌手术单将大鼠拖曳，只暴露未消毒的颈部区域。
17. 在表中再切一个小开口，露出部分鼻锥。这将是在受伤时录下气球导管的地点。

2. 操作程序

1. 在整个外科手术过程中，通过监测呼吸速率（速度应一致且视为正常）以及每 15 分钟用脚趾捏一次来评估麻醉深度。如果呼吸率增加或对脚趾捏有反应，则暂停手术操作，增加的异体高达2.5%。
2. 暴露常见的胡萝卜动脉（CCA）。
   1. 在老鼠的下颚骨骼之间做一个肤浅的，直的，纵向的领口切口。切口长度约为1.5-2厘米。
   2. 通过皮肤下的结缔组织切口，直到肌肉层暴露。将唾液腺置换到皮肤下方，以进入肌肉组织。
   3. 通过在肌肉层和结缔组织之间插入封闭的剪刀，轻轻打开剪刀，同时向上拉皮，将结缔组织与肌肉分开。
3. 沿着气管的左侧纵向解剖两种可见的肌肉（骨质激素和胸肌类），直到观察到与两种表面肌肉垂直的第三块肌肉（omohyoid）。
4. 使用钳子创建一个窗口，将这种垂直肌肉（omohyoid）与在气管上运行的纵向肌肉（斯特诺希奥德）分开。轻轻进行这种分离，以防止气管的钝性创伤。
5. 到达垂直肌肉下方的钳子，切开两个纵向肌肉并暴露CCA。
6. 剖析CCA。
   1. 在内部胡萝卜动脉 （ICA） 和外部胡萝卜动脉 （ECA） 暴露之前，在分叉附近剖析 CCA。
   2. 解剖优越的甲状腺动脉（STA），它从ECA分支。
   3. 使用预切割的丙烯缝合线，在各自的分叉附近对 STA 和 ECA 进行诉讼。将大部分缝合线留在结的一侧，然后用弯曲的血吸管抓住每个缝合线。
   4. 完成对ICA的解剖，到达ICA下面和周围的钳子，并使用非粉碎血管夹来实现分离控制。与ICA一起夹住腹膜动脉。
   5. 解剖CCA的近似分叉，确保将迷走神经与CCA分离。
   6. 到达CCA下面和周围的钳子，并使用非粉碎血管夹来实现近似控制。将夹子从分叉中放置至少 5 毫米。
7. 执行气球伤害。
   1. 操纵每个被勒住的动脉分支的弯曲的血站，以暴露 ECA 和上级分支之间的分裂。
   2. 在分叉处轻轻解剖组织，然后使用微切除剪刀在 ECA 和上级分支之间进行动脉切除术切口。
   3. 使用棉签将所有血液从CCA中挤出并清理动脉切除位点。
   4. 将未起浮的气球导管插入动脉切除术，并推进到CCA，直到气球的近端经过分叉。
   5. 将导管粘在鼻锥上，这样气球就不会在通货膨胀时从动脉中滑出。
   6. 慢慢地将气球膨胀到5个压力气氛，并在CCA中离开5分钟，以诱发动脉损伤。确保整个 5 分钟的压力保持不变。
   7. 5分钟后，放气气球，并通过动脉切除术轻轻地从CCA中取出。
   8. 轻轻挤压CCA的夹子，冲洗CCA。不要取下夹子。
   9. 将 ECA 近体与动脉切除术分离，然后从 CCA 和 ICA 中取出夹子，以恢复通过 CCA 到 ICA 的血液流动。确保动脉切除术周围没有明显的出血，并且 CCA 正在脉动。
8. 沿受伤的CCA单独应用100μL的治疗性或多面性凝胶车辆。这样做，将 50 μL 涂在 CCA 的左侧，然后在 CCA 的右侧应用 50 μL，以确保受伤的动脉均匀涂层。
9. 关闭伤口部位。
   1. 切割多余的丙烯缝合线。
   2. 沿结缔组织使用中断的 4-0 或 6-0 vicryl 层关闭伤口。
   3. 完成关闭伤口使用运行4-0尼龙缝合沿皮肤。

3. 术后程序

1. 将大鼠单独放在一个干净的笼子里，将一半的笼子放在加热灯下，并进行监测，直到老鼠恢复足够的意识以维持体面休养。将老鼠关在单独的笼子里，直到动物完全警觉和移动，然后再转移到原来的笼子里。
2. 在接下来的三天里每天监测老鼠，然后每周监测三次，直到安乐死。安乐死使用异氟过量，然后双边胸切除术如下所述。
   1. 利用国家动物替代精炼和减少研究中心 （NC3R） 鬼脸量表来识别术后疼痛水平。如果任何动物似乎正在经历疼痛或出现任何神经折衷，立即牺牲。
   2. 对于未接受卡洛芬的动物，在手术前24小时通过手术后48小时在饮用水中施用对乙酰氨基酚6毫克/mL。对乙酰氨基酚提供镇痛药，抗炎效果最小。
   3. 或者，其他镇痛策略，具有最小的抗炎效果，可以使用，如丁丙诺啡或丁丙诺啡延长释放。咨询贵机构的兽医团队。

4. 组织收获和成像

1. 手术两周后，通过过量麻醉（5%是异体）对大鼠实施安乐死。或者，在更早的时间点对大鼠实施安乐死，以分析动脉损伤反应的各个方面。
   1. 一旦呼吸停止，作为安乐死的次要方法进行双边胸切除术。
2. 通过腹部进行横向切口，然后向上切开，穿过隔膜和肋骨，露出胸腔。
3. 渗透和修复动脉。
   1. 通过左心室插入附着在引力注水固定系统的 18 G 管子。通过标记注水系统相对于台面的高度（120 厘米高程，相当于 91 ± 3 mmHg），保持大鼠之间的等效压力。
   2. 使用弯曲的止血剂将管子与心室夹在一起。
   3. 在右中庭切开，打开血管回路，然后用PBS开始灌注，然后是2-4%的甲醛（每个约250毫脱）。
   4. 准备在牺牲当天或最多在牺牲前一天晚上稀释在PBS中的甲醛。如果在牺牲当天准备，请确保准甲醛在开始输液前冷却到室温。将甲醛储存在4°C。
4. 固定后，提取左和右胡萝卜素动脉，并在4°C下储存2小时，在2-4%的甲醛。
5. 将动脉转移到30%的蔗糖，并在4°C过夜。
6. 16-24小时后，将动脉嵌入最佳切割温度（OCT）化合物中，并冻结OCT嵌入动脉块。
   1. 条件动脉在OCT在室温下10分钟。将动脉平行放置在充满 OCT 的低温的平面上，标记动脉分叉所面对的低温的一侧。液氮中快速冻结。
   2. 长期存放冷冻块-80°C。
7. 使用冷冻统计器的部分冻结块。
   1. 每张幻灯片收集 6 个 5μm 厚的动脉横截面，幻灯片 1 从分叉开始。
   2. 部分冻结块，直到增生不再可见（约100张幻灯片）。
8. 血红素 + 欧辛 （H&E） 污渍幻灯片¹⁸
   1. 从分叉开始，每十张幻灯片中就有一张被弄脏，从而找到受伤区域（例如，滑梯 1、10、20、30、40、50、60、70、80、90 和 100）。
   2. 在受伤部位周围染色额外的幻灯片，以找到具有峰值遮挡的幻灯片（例如，幻灯片 20、30 和 40 具有可见的增生，因此染色幻灯片 15、25、35 和 45）。
   3. 在峰值遮挡幻灯片前后（例如，在幻灯片 35 处发现峰值遮挡，然后对幻灯片 25、45 等）进行污渍和量化幻灯片，每个大鼠总共有 3-10 张幻灯片。
9. 对于光片荧光显微镜成像，在固定步骤4.4后，将动脉在4°C下过夜。
   1. 探针动脉与1:500稀释兔子抗CD31原发抗体在稀释（pH 7.4）3天。然后用1:500稀释抗兔亚历克萨氟647次次抗体对抗动脉2天^19。
   2. 使用 iDISCO+²⁰清除动脉。
   3. 使用光片荧光显微镜²¹对动脉进行成像。使用软件渲染图像（例如，伊马里斯^）19.
10. 量化新金质增生。如果可能，以盲目的方式执行量化。
    1. 使用 ImageJ 软件在上面确定的 3-10 张幻灯片（步骤 4.8.3）上跟踪动脉的内脏、内部弹性拉米纳 （IEL） 和外部弹性拉米纳 （EEL） 的周长。
    2. 量化 ImageJ 中每个跟踪区域的区域并导出这些值。起义痕迹产生流明区域，IEL微量产生IEL区域，鳗鱼痕迹产生鳗鱼区域。
    3. 平均从3-10张幻灯片获得的值，以获得每只大鼠胡萝卜动脉的平均伤害（百分比遮挡，刺激:介质（I:M）比，新皮质增生）。
       新金质增生 = IEL 区域 - 卢门区域
       
       

图 1显示了用于执行此手术的所有材料和手术工具。两周受伤的动脉横截面的血氧素和欧辛 （H&E） 染色允许新脑增生的清晰可视化。图 2显示了健康、受伤和经过治疗的动脉的 H&E 染色动脉横截面的代表性图像。图2还概述了如何使用广泛使用的图像处理软件ImageJ来量化受伤动脉的新生儿增生水平。使用此方法，可追踪到新膜的周长以及内部和外部弹性拉米纳，以量化各自的区域。我们描述的压力控制段损伤方法导致起义与介质比为 0.80，标准偏差为 0.29（2 个不同的外科医生和 n=11 大鼠）。治疗与心电图应用CA在多音速导致抑制新皮质增生，正如我们以前所示（61%减少百分比闭塞）15。

图3 为在ECA和STA的分叉中创建最佳动脉切除术提供了一个例证。最后， 图4 显示了光片荧光显微镜如何用于可视化动脉长度的整个损伤区域。CD31染色可在固定动脉上执行，以可视化内皮细胞衬里。然后，动脉可以嵌入1%的藻类中，并使用iDISCO®方法将样品20的折射指数同质化。然后，动脉可以在光片荧光显微镜中成像，图像可以使用软件来量化 I:M 比度。使用此方法，我们获得了 0.86 的 I:M 比率，这与 H&E 结果一致。

表 1.用于增生分析的动脉横截面的常用数。

图 1.手术器械和工具。 按顺时针顺序从图像左上角开始:（A）棉签:（（B） 贝塔丁溶液:（C） 高泽:（D） 70%乙醇溶液:（E） 带针头的 1cc 注射器:（F） 阿托平:（G） 缩还器:此处使用的弯曲回形针:（H） 里马迪尔:（一） 微丝夹应用钳子:（J） 针架:（K） 4-0 尼龙缝合:（L） 4-0 维里尔缝合:（M） 无菌窗帘:（N） 梅奥剪刀:（O） 标准钳子:（P） 精细弯曲的钳子:（Q） 微分剪刀:（R） 微型农奴制夹子:（S） 精美的剪刀:（T） T 型针:（U） 弯曲的止血剂:（V） 三个7-0丙烯缝合线切成约1英寸:（W） 100μL 的 25% 复数-127 凝胶:（X） 润滑眼药膏:（Y） 2 法国气球在无菌盐水溶液中的切除导管:（Z） 窒息者。 请点击这里查看此数字的较大版本。

图2。血红素 + Eosin （H & E） 染色和分析大鼠胡萝卜动脉横截面。 （A） 健康、未受伤的右胡萝卜动脉的横截面。IEL = 内部弹性拉米纳，EEL = 外部弹性拉米纳。（B） 两周受伤的左胡萝卜动脉的横截面用多音速-F127车辆治疗。（C） 两周受伤的左胡萝卜动脉的横截面用100μM肉碱醛治疗。比例尺条 = 100μm.（D） 冷冻动脉的分区示意图，用于量化损伤。幻灯片 1 从分叉开始，每个幻灯片拍摄 6 个宽度为 5μm 的动脉部分。分区通常继续滑动 70，因为伤害通常发生在此幻灯片之前。（E） 受伤的左胡萝卜动脉横截面用多路车（B） 治疗。最内层的黑线跟踪新星，并划明发光区域。中间的黄线划出内部弹性拉米纳的区域，或图尼卡起义。外部蓝线划出外部弹性拉米纳的区域，或图尼卡冒险。比例尺条 = 100 μm.（F） 计算用于测量容器遮挡和刺激的百分比:介质 （I:M） 比率基于从（E）获得的测量结果。 请点击这里查看此数字的较大版本。

图3。动脉切除术的创造。 说明创建正确动脉切除术的步骤，并避免假道。CCA = 普通胡萝卜动脉， ECA = 外部胡萝卜动脉， ICA = 内胡萝卜动脉， OA = 腹股动脉， STA = 高级甲状腺动脉。隔离中非经委会和STA分支机构之间的分化。剖析此分叉，直到区域更改为更亮的颜色，指示动脉壁变薄，然后使用微切除剪刀创建动脉切除术。使用精细钳子提升动脉切除术，以帮助气球插入。 请点击这里查看此数字的较大版本。

图4。光片荧光显微镜可视化动脉损伤。 纵向横截面沿普通胡萝卜动脉的长度从14周大的斯普拉格道利大鼠与下面的代表性横截面。动脉沾有CD31，与AF647相反。（A） 健康、未受伤的右胡萝卜动脉的横截面。白色 = CD31， 绿色 = 弹性拉米纳， L = 流明， 比例杆 = 200-500μm.（B）受伤的交叉部分， 左胡萝卜动脉治疗与普鲁罗尼克 - F127 车辆。箭头表示新金体增生区域。（C） 因蒂玛与媒体 （I:M） 未受伤和受伤的胡萝卜动脉的比例，每个组注明的确切值 （n=1）。 请点击这里查看此数字的较大版本。

作者声明，本手稿的出版不存在利益冲突。