大鼠颈动脉球囊损伤模型模拟了临床上为恢复动脉粥样硬化血管血流而实施的血管成形术。该模型通过扩张动脉壁并剥脱内膜层的内皮细胞，诱发动脉损伤反应，最终导致血管重塑和内膜增生性反应。
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摘要
摘要
心血管疾病仍然是全球范围内导致死亡和残疾的首要原因，部分归因于动脉粥样硬化。动脉粥样硬化斑块会缩小动脉的管腔表面积，从而减少向器官和远端组织输送的充足血流。临床上，血管重建手术（如球囊血管成形术，可联合或不联合支架植入）旨在恢复血流。尽管这些手术可通过减轻斑块负荷来恢复血流，但它们会对血管壁造成损伤，进而引发动脉修复反应。这种持续较久的修复反应会导致动脉再狭窄，即管腔再次变窄，最终限制了这些血管重建手术的长期疗效。因此，临床前动物模型对于分析驱动再狭窄的病理生理机制至关重要，并为测试新型治疗策略提供了机会。与大型动物模型相比，小鼠模型成本更低且操作更简便。在小鼠模型中，常用的两种损伤方式为球囊损伤和导丝损伤。其中，球囊损伤模型尤其能模拟临床血管成形术过程，并对动脉造成足够损伤以诱导再狭窄的发生。本文详细描述了改良的压力控制型大鼠颈动脉球囊损伤模型的手术操作及其组织学分析方法。此外，本方案还强调了如何通过局部外膜周围给药的方式应用治疗剂以抑制新生内膜增生。最后，我们介绍了光片荧光显微镜作为一种新型三维成像技术，用于观察和可视化动脉损伤区域。
引言
心血管疾病（CVD）仍是全球最主要的死亡原因1。动脉粥样硬化是大多数心血管疾病相关发病率和死亡率的根本原因。动脉粥样硬化是指动脉内斑块积聚，导致管腔狭窄，阻碍血液向器官和远端组织正常灌注2。治疗严重动脉粥样硬化的临床干预措施包括球囊血管成形术，可选择是否联合支架置入。该操作需将球囊导管送至斑块部位，通过扩张球囊将斑块压向动脉壁，从而扩大管腔面积。然而，该过程会损伤动脉，引发动脉损伤反应3。这种损伤反应的持续激活会导致动脉再狭窄，即继发于新生内膜增生和血管重塑的再次狭窄。在血管成形术过程中，内膜层的内皮细胞被剥脱，导致血小板迅速募集并引发局部炎症。局部信号传导诱导血管平滑肌细胞（VSMC）和外膜成纤维细胞发生表型改变，进而促使这些细胞向管腔内迁移和增殖，导致新生内膜增生4,5。循环中的祖细胞和免疫细胞也参与构成再狭窄的总体体积6。在适用情况下，药物洗脱支架（DES）目前是抑制再狭窄的标准手段7。然而，DES会抑制动脉再内皮化，从而形成促血栓环境，可能导致晚期支架内血栓形成8。因此，动物模型对于理解再狭窄的病理生理机制以及开发更有效的治....
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方案
本文所述所有方法均已获得北卡罗来纳大学教堂山分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 术前操作
- 对手术器械进行灭菌。手术前将所有手术器械进行高压灭菌。若同一天进行多台手术，每次手术之间使用干珠灭菌器对器械进行灭菌。
- 将治疗药物配制于25% Pluronic-127凝胶中（用无菌蒸馏水稀释）。
- 将2F Fogarty球囊导管连接至注气装置，并将导管的球囊端置于装有生理盐水的1 mL注射器内。
- 将大鼠放入含5%异氟烷的麻醉诱导舱中以诱导麻醉。
- 从诱导舱中取出大鼠并记录其体重。使用毛发剪剃除腹侧颈部区域的毛发。
- 将大鼠重新放回含5%异氟烷的诱导舱中，以确保麻醉成功诱导。
- 将大鼠仰卧位固定于手术平台，将其面部插入鼻罩，使大鼠面部朝向术者。
- 将吸入麻醉维持在1.5%异氟烷。通过四只脚趾的夹趾反射验证麻醉深度。
- 用胶带将四肢固定于手术平台。
- 打开保温灯。
- 皮下注射阿托品（0.01 mg/kg）以减少呼吸道分泌物。
- 皮下注射卡洛芬（5 mg/kg）以进行预防性镇痛管理。若实验不允许使用抗炎药物，请参考步骤3.2.2和3.2.3。
- 使用无菌棉签将润滑....
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结果
图1 展示了进行该手术所使用的所有材料和外科器械。苏木精 & 伊红（H&E) 染色两周损伤的动脉横切面可清晰显示新生内膜增生。 图2 显示 H 的代表性图像&健康、受损及经治疗动脉的#38;E染色横截面。 图2 还概述了如何使用广泛采用的图像处理软件 ImageJ 对受损动脉中新生内膜增生的程度进行定量分析。采用该方法，通过追踪新生内膜、内弹性膜和外弹性膜的周长，以量化各自的面积。我们所描述的压力控制节段性损伤方法可导致内膜与中膜比值为 0.80，标准差为 0.29（由两位不同外科医生操作，n=11 只大鼠）。如我们先前所示，使用 Pluronic 载体进行外膜周围应用 CA 治疗可抑制新生内膜增生（管腔狭窄百分比减少 61%）15.
图3展示了在颈外动脉（E.......
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讨论
大鼠颈动脉球囊损伤是目前应用最广泛且研究最深入的再狭窄动物模型之一。原始的球囊损伤模型3以及改良的压力控制节段性损伤变体10均揭示了动脉损伤反应的多个方面，这些反应在人类中同样存在；该模型的局限性主要在于极少形成富含纤维蛋白的血栓，且局部炎症反应较轻，相较于高胆固醇血症兔或猪等其他损伤模型更为轻微9,22。此外，可在不同时间点处死大鼠，以定量和分析动脉损伤反应的不同特征。例如，较早的时间点可用于研究损伤早期反应，如细胞增殖、血管平滑肌细胞的表型转换以及早期免疫反应。我们先前的研究表明，白细胞浸润和细胞增殖在损伤后3天至1周达到峰值16。中期时间点可用于评估再内皮化的速率。术后两周是测量新生内膜增生的最早推荐时间点，因为此时动脉已基本完成再内皮化16。该模型在转化应用中的一个主要局限在于，损伤操作是在健康的动脉上进行的，而临床上该过程.......
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披露
作者声明，本稿件的发表不存在任何利益冲突。
致谢
N.E.B. 获得了美国国家环境卫生科学研究所培训项目资助（5T32ES007126-35，2018年）以及美国心脏协会博士前奖学金（20PRE35120321）的支持。E.S.M.B. 是UNC临床与转化科学研究奖-K12学者项目（KL2TR002490，2018年）的KL2学者，部分由该项目及美国国家心肺血液研究所（K01HL145354）资助。作者感谢UNC显微技术服务中心的Pablo Ariel博士在LSFM方面的协助。光片荧光显微镜实验在显微技术服务中心完成。该显微技术服务中心隶属于病理学与实验室医学系，其部分经费来自UNC Lineberger综合癌症中心获得的P30 CA016086癌症中心核心支持拨款。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 注射器 | Fisher | 14955450 | |
| 带针头的 1 mL 注射器 | BD | 309626 | |
| 2 法式 Fogarty 球囊取栓导管 | Edwards LifeSciences | 120602F | |
| 4-0 Ethilon（尼龙）缝线 | Ethicon Inc | 662H | |
| 4-0 Vicryl 缝线 | Ethicon Inc | J214H | |
| 7-0 Prolene 缝线 | Ethicon Inc | 8800H | |
| 70% 乙醇 | |||
| 抗兔 Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A21245 | |
| 硫酸阿托品 | Vedco Inc | 兽用 | |
| 棉签 | Puritan | 806-WC | |
| 弯止血钳 | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| 精细弯镊 | Fine Science Tools | 11203-25 | |
| 精细剪刀 | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| 纱布 | Covidien | 2252 | |
| IHC-Tek 稀释液（pH 7.4） | IHC World | IW-1000 | |
| 充气装置 | Merit Medical | IN4130 | |
| 碘溶液 | |||
| 润滑性眼膏 | Dechra | 兽用 | |
| 梅奥剪刀 | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| 微型血管夹 | Fine Science Tools | 18055-05 | |
| 显微解剖剪刀 | Fine Science Tools | 15004-08 | |
| 微型血管夹施加钳 | Fine Science Tools | 18057-14 | |
| 持针器 | Fine Science Tools | 12003-15 | |
| Pluronic-127（溶于无菌水） | Sigma-Aldrich | P2443 | 配制成 25% |
| 兔抗 CD31 抗体 | Abcam | ab28364 | |
| 牵开器 | 弯曲的回形针效果良好 | ||
| Rimadyl（卡洛芬） | Zoetis Inc | 兽用 | |
| 生理盐水溶液 | |||
| 标准镊子 | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| 无菌铺巾 | Dynarex | 4410 | |
| T 形针 |
参考文献
- American Heart Association. Cardiovascular Disease: A Costly Burden for America, Projections Through 2035. American Heart Association CVD Burden Report. , (2017).
- Singh, R. B., Mengi, S. A., Xu, Y. J., Arneja, A. S., Dhalla, N. S. Pathoge....
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重印与许可
