制备用于培养人脂肪源性干细胞的活化富血小板血浆

摘要

本报告中，我们介绍了一种制备活化富血小板血浆（PRP）的双次离心法。采用自体凝血酶激活后，培养人脂肪源性间充质干细胞（hASCs）。结果表明，活化的PRP可促进hASCs的增殖。

摘要

通过离心全血制备的活化富血小板血浆（PRP）在多种培养细胞中表现出促进增殖的作用，提示其在再生医学中具有潜在应用价值。本文采用双次离心法从全血中制备PRP，并使用自体凝血酶进一步活化PRP。检测了活化PRP中的血小板计数，并评估其对人脂肪来源间充质干细胞（hASCs）的促增殖作用。结果显示，PRP中的血小板计数较全血血浆高出11.5倍。与1% PRP共孵育后，hASCs的增殖显著增强。该方法可重复地制备高浓度血小板的PRP，且由此法所得PRP可显著促进hASCs的增殖。

引言

通过离心全血可制备活化的富血小板血浆（PRP），其血小板浓度显著高于基础水平¹。自体PRP已广泛应用于外科治疗，包括伤口愈合²、骨损伤修复³以及整形手术^4,5。PRP中血小板活化后，其内部的α颗粒会释放多种生长因子，如血小板源性生长因子（PDGF）、表皮生长因子（EGF）、类胰岛素生长因子（IGFs）、转化生长因子β（TGF-β）、血管内皮生长因子（VEGF）等^1,6,7。这些生长因子在细胞增殖⁸、迁移⁹和分化⁹过程中发挥重要作用。

迄今为止，已有若干研究报道了富血小板血浆（PRP）对多种细胞的促增殖作用^{10,11,12,13,14,15,16}。其中一类细胞为人源脂肪间充质干细胞（hASCs）；hASCs存在于人体脂肪组织中，可大量获取。hASCs所具有的再生潜能进一步提示其在临床应用中的潜在价值⁸。我们先前的研究表明，与非激活PRP相比，激活PRP对hASCs和人源真皮成纤维细胞（hDFs）具有显著的促增殖作用⁸。此外，我们报道过PRP通过ERK1/2信号通路促进hDFs的增殖¹⁷。最近，我们还报道了PRP通过ERK1/2、JNK和Akt信号通路促进hASCs的增殖¹⁸。在hASCs中，PRP作为促进增殖的补充剂发挥着重要作用。深入了解PRP对hASCs的作用将有助于建立大规模培养方法，并推动hASCs增殖机制的进一步研究。

在本报告中，我们介绍并描述了一种通过离心法从全血中制备富血小板血浆（PRP）的方法。该方法采用二次离心法，可简便地制备出稳定的PRP样本。为评估PRP的生物学功能，我们测定了浓缩血小板的数量以及多种增殖因子的浓度。此外，通过将制备的PRP用于培养人脂肪源性间充质干细胞（hASCs），验证了其促进生长的作用。

方案

本研究经关西医科大学伦理审查委员会批准，符合1975年《赫尔辛基宣言》的伦理准则。所有样本均在获得捐献者知情同意后采集和使用。

1. 准备

1. 在获得知情同意后，从健康成年献血者中采集血液。本实验中，血液来自四名年龄在28至38岁之间的男性献血者。
   1. 建议献血者在采血前6小时饮用500 mL水。
      注：健康成人血红蛋白（Hb）、红细胞（RBC）计数和血小板（PL）浓度的参考范围由Vajpayee¹⁹描述。为符合献血条件，献血者的血液检测结果需处于这些参考范围内。

2. 血液采集

1. 采血过程中，让献血者保持坐姿。
2. 佩戴手套。在献血者握紧拳头的同时，于其上臂绑扎止血带。
3. 确定合适静脉后，用70%酒精对皮肤消毒两次，然后插入针头。
4. 使用21 G注射器采集血液。采血过程中不得松开止血带。
   1. 使用8.5 mL采血管收集血液。观察管内血液流动情况，一旦血流减慢，立即更换新采血管。
   2. 采集足量血液以制备PRP。共采集4管抗凝血液，总体积为34 mL。采集后将采血管轻轻颠倒10次，使血液与抗凝剂充分混匀。
   3. 使用10 mL无抗凝剂的血清采血管（见材料表）采集用于制备激活剂的血液（见第4步）。采集10 mL未加抗凝剂的血液。

3. 制备PRP的双次离心法

1. 取40 μL抗凝全血用于血小板计数。使用带滤芯的吸头以防止血液污染移液器。
2. 将抗凝全血在室温下以450 × g 离心7分钟。此为第一次离心，以获得分层的血液样本。上层为血浆组分，中间层为薄薄的白细胞层（buffy coat），最底层为红细胞。
3. 使用记号笔在白细胞层下方2 mm处划一条线。
4. 使用带有长套管的20 mL注射器，吸取血浆至白细胞层下方2 mm标记处。含有白细胞层的黄色血浆包含血小板、白细胞及少量红细胞。将两管中的血浆收集至一支血清采血管中。将4管样本合并为2管，共收集16 mL血浆。
5. 将含有白细胞层的血浆在室温下以1,600 × g 离心5分钟。此为第二次离心。分层血液样本的上清液为血小板贫乏血浆（PPP）。
6. 使用带有长套管的20 mL注射器将PPP转移至含有1 mL液体作为基准的50 mL血清采血管中。残余1 mL血浆中聚集在血小板沉淀物中的血小板即为富血小板血浆（PRP）。收集的PRP总体积为2 mL。
7. 将每管PRP涡旋混匀，然后合并至同一管中（总体积2 mL）。
8. 取400 µL PRP用于血小板计数。
9. 将PRP分装至若干1.5 mL离心管中，每管约含400 µL，共四管。建议每管分装约500 µL PRP。

4. 准备激活剂

1. 将不含抗凝剂的10 mL血液置于血清采血管中（步骤2.3.3），室温静置30分钟。
2. 将不含抗凝剂的血液样本在实验室离心机中以2,015 × g 的离心力于室温下离心8分钟。
3. 收集上清液作为自体凝血酶。
4. 按1:1（v/v）比例混合0.5 M CaCl₂与自体凝血酶，作为激活剂。例如，将500 µL CaCl₂与500 µL自体凝血酶混合，配制成总体积为1 mL的激活剂。

5. PRP 激活

1. 按10:1（v/v）的比例将PRP与激活剂混合。在每个1.5 mL离心管中加入400 µL PRP和40 µL激活剂，室温孵育10分钟。此即为呈凝固状态的激活后PRP。

6. PRP 的储存

1. 将激活的PRP在4 °C下以9,000 × g离心10分钟。
2. 用移液器将上清液收集至适当体积的注射器中。
3. 通过0.22 µm滤膜过滤上清液。
4. 将最终的PRP储存于−80 °C，直至使用。

7. 血小板浓度和生长因子水平的测定

1. 使用自动化血液学系统（参见材料表）对全血浆和富血小板血浆（PRP）中的血小板数量进行计数。
2. 使用市售的ELISA试剂盒（参见材料表）分析全血浆和活化PRP中PDGF-BB、IGF和EGF的浓度。

8. 细胞增殖实验

1. 采用先前描述的方法分离hASCs¹⁸。
   1. 将hASCs以1.0 × 10⁴ 个细胞/孔的密度接种于24孔培养板中，在含10%胎牛血清（FBS）和抗生素的DMEM培养基中，于37 °C培养过夜。实验中使用第7至第9代的hASCs。
2. 更换为无血清DMEM培养基。培养6小时后，加入指定浓度的PRP，并继续在37 °C孵育48小时。
3. 加入WST-8溶液（见材料表），在37 °C孵育1小时。使用多孔板读数仪在450 nm处测定吸光度。
4. 构建标准曲线：在24孔板中，将hASCs以0、6,250、12,500、25,000、50,000和100,000个细胞/孔的密度接种于含10% FBS的DMEM培养基中，培养3小时。在37 °C下与WST-8溶液孵育1小时后，测定450 nm处的吸光度。
   1. 通过绘制细胞数量与A_{450 nm}的关系图，绘制标准曲线。
5. 根据标准曲线，由吸光度值估算hASCs的数量。

结果

PRP 中血小板和 PDGF-BB 的富集浓度
PRP 中血小板和 PDGF-BB 的浓度分别增加了 11.5 倍和 25.9 倍，与全血浆中的浓度相当。然而，PRP 中 EGF 的浓度未发生变化，IGF 仅为全血浆的 70%（表 1）。实验采用双离心法重复进行了四次。

PRP 刺激促进 hASCs 增殖
经 0.2% PRP 处理后，细胞增殖增加（P < 0.05，与对照组相比），而 1% PRP 处理的促进作用更显著（P < 0.05，与对照组相比；且 P < 0.05，与 0.2% PRP 组相比）。图 1A 显示，PRP 以剂量依赖的方式刺激 hASCs 的增殖。PRP 刺激增强 hASCs 增殖的效果通过相差显微镜得到证实（图 1B）。数据以均值 ± 标准差（SD）表示。采用 Mann–Whitney U 检验评估各组间...

讨论

PRP 激活后，会释放多种生长因子，如 PDGF、EGF、IGF、TGF-β 和 VEGF^1,6,7 "激活"伤口中的细胞和组织，促进伤口愈合^20,21。在整形重建手术中，已证实被激活的细胞可促进愈合并改善外观效果^22,23。此外，在美容与重建领域也可直接使用人脂肪来源的干细胞，而无需 PRP 刺激^24,25,26。PRP 还可在三维胶原支架培养体系中与胰岛素联合使用，促进人脂肪来源干细胞的软骨向和成骨向分化

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
20 mL 注射器，Terumo 锁扣式注射器	Terumo，日本东京	SS-20LZP
50 mL 离心管，聚丙烯锥形管	Corning，美国纽约	352070
全自动血液分析系统	Sysmex Corp.，日本东京	XE-2100
采血针，SafeTouch PSV 带鲁尔接头采血针，21 G × 3/4”	Nipro，日本大阪	32-384
采血管，ACD 溶液 A 采血管，8.5 mL	BD Vacutainer，美国新泽西	364606
采血管，血清采血管/单支采血管，10 mL	BD Vacutainer，美国新泽西	366430
氯化钙，1 mEq/mL	大冢制药工厂，日本德岛	3215400A1061
套管针，BS 无斜面针，18 G (1.2 mm) × 75 mm	BS Medical，日本东京	BS-81007	非卖品
细胞计数试剂盒-8	Dojindo 分子技术公司，日本熊本	CK04
离心机	Kokusan，日本东京	H-19F
离心机	Eppendorf，德国汉堡	5415R
EnSpire 2300 多功能酶标仪	PerkinElmer, Inc.，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆
滤器单元	Merck Millipore，爱尔兰科克郡	SLGP033RS
人 EGF Quantikine ELISA 试剂盒	R&D Systems，美国明尼苏达州明尼阿波利斯	DEG00
人 IGF-I Quantikine ELISA 试剂盒	R&D Systems，美国明尼苏达州明尼阿波利斯	DG100
人 PDGF-BB Quantikine ELISA 试剂盒	R&D Systems，美国明尼苏达州明尼阿波利斯	DBB00
移液器吸头，ART 1000 加长屏障吸头	Thermo Scientific，美国马萨诸塞州	2079-05-HR
移液器，Nichipet EXII 100–1000 μL	Nichiryo，日本埼玉	00-NPX2-1000
无粉腈类检查手套（Sterling Nitrile Power-Free Exam Gloves）	Kimberly-Clark	50707
山善消毒用酒精	山善制药，日本大阪	A7L07