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方法文章

利用温度控制基于微管的三维活性流体的流动速度

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DOI：

10.3791/60484

⸱

2019年11月26日

 ,  ,  , 
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Physics, Brandeis University

本文内容

摘要

本实验方案的目标是利用温度来控制三维活性流体的流动速度。该方法的优势不仅在于能够原位调节流动速度，还可实现动态控制，例如周期性地调高和调低流动速度。

摘要

我们介绍一种利用温度调节由驱动蛋白驱动的微管三维（3D）活性流体流动速度的方法。该方法可在不重新制备样品的情况下，原位调节流体速度，以达到不同的目标速度。此外，该方法实现了对速度的动态控制。通过循环改变温度，可使流体周期性地快速与慢速流动。这种可控性基于驱动蛋白-微管反应的阿伦尼乌斯特性，实现了4–8 µm/s范围内的可控平均流速。本方法将为微流控器件的设计开辟新途径，实现在无需阀门的情况下对通道内流速进行局部调节。

引言

活性物质因其能够将化学能转化为机械功，而区别于传统的被动物质。具有此类能力的材料可由生物或非生物实体构成，例如细菌、昆虫、胶体、颗粒以及细胞骨架丝状结构1,2,3,4,5,6,7,8,9,10。这些物质实体与其邻近个体相互作用，在更大尺度上可自组织形成类似湍流的涡旋（即活性湍流）或物质流动11,12,13,14,15,16,17,18,19,20。对活性物质自组织行为的理解已推动了其在分子穿梭系统、光学器件和并行计算等领域的多种应用21,22,23。要将这些应用提升至更高水平，需要实现对系统超越自组织的控制。例如，Palacci 等人开发了一种封装氧化铁的胶体，该胶体仅在手动控制的蓝光照射下实现自驱动，从而形成了“活晶体”24。Morin 等人则通过可调的外加电场实现了对Quincke胶体滚动行为的控制，使其在类似赛道的通道中产生胶体群集运动25。这些前期工作展示了局部控制在实际应用中的关键作用，并进一步拓展了活性物质领域的知识体系。

本文重点研究由驱动蛋白驱动的微管（MT）三维活性流体的可控性。该流体由三个主要组分构成：微管（MTs）、驱动蛋白分子马达和耗竭剂。耗竭剂诱导产生耗竭力，使微管发生束化，随后由马达蛋白簇将微管连接起来。这些马达蛋白沿微管向其正端移动。当一对被连接的微管呈反向平行排列时，相应的马达蛋白朝相反方向行走。然而，由于马达蛋白被束缚在同一簇内而无法彼此分离，因此它们协同作用，使微管对之间发生相对滑动（即纤维间滑动，图1A）。这种滑动动力学不断积累，导致微管束持续伸展，直至达到屈曲失稳点并断裂（形成伸展型微管束，图1B）26。断裂后的微管束又在耗竭力作用下重新退火并再次伸展，该动力学过程不断重复。在这一反复的动力学过程中，微管束的运动搅动周围液体，引发流动，可通过掺入微米级示踪粒子来可视化这些流动（图1C）。Sanchez 等人和 Henkin 等人已对示踪粒子的平均速度进行了表征，发现通过调节三磷酸腺苷（ATP）、耗竭剂、马达蛋白簇以及微管的浓度，可以调控其运动速度19,27。然而，这种可调性仅存在于活性流体合成之前。一旦合成完成，流体便失去外部调控能力，并自发地进行自组织。为了在合成后实现对活性流体活性的控制，Ross 等人报道了一种利用光激活马达蛋白二聚化的方法，可通过光照开启或关闭流体活性28。尽管光控方法在局部激活流体方面具有便利性，但该方法需要对马达蛋白结构进行重新设计，并对显微镜的光路系统进行改造。本文提出一种无需改造显微镜、同时保持马达蛋白结构完整的局部流体流动控制方法，操作简便，易于使用。

我们对活性流体流动进行局部调控的方法基于阿伦尼乌斯定律，因为已有研究报道驱动蛋白-微管（kinesin-MT）反应随温度升高而增强29,30,31,32。我们之前的研究表明，活性流体流动的平均速度随温度的变化遵循阿伦尼乌斯方程：v = A exp(-Ea/RT)，其中A为指前因子，R为气体常数，Ea为活化能，T为系统温度33。因此，流体活性对温度环境敏感，需保持系统温度一致以稳定分子马达的性能，进而稳定流体流动速度34。本文中，我们展示了利用分子马达的温度依赖性，通过调节系统温度连续调控活性流体的流动速度。我们还演示了活性流体样品的制备过程，并将其装载到由计算机软件控制温度的显微镜载物台上。将温度从16 °C升高至36 °C，可使平均流动速度从4 µm/s提高到8 µm/s。此外，这种调控具有可逆性：反复升高和降低温度可依次加速和减速流动。所展示的方法适用于多种主要反应遵循阿伦尼乌斯定律的系统，例如微管滑动实验（MT gliding assay）29,30,31,32。

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方案

1. 微管的制备

警告：在此步骤中，我们从牛脑组织中纯化微管蛋白。牛脑可能引起变异型克雅氏病（vCJD）35。因此，脑组织废弃物及相关溶液、瓶子和移液器吸头应收集于生物废弃物袋中，并根据机构规定作为生物危害废弃物进行处理。

  1. 从牛脑中纯化微管蛋白（改编自 Castoldi 等人36）。
    1. 将约 1.5 kg 新鲜牛脑从当地屠宰场运送至大学冷藏室。运输过程中，将脑组织置于磷酸盐缓冲液（20 mM NaH2PO4，150 mM NaCl，pH 7.2）中并置于冰上保存。
      注意：为最大化最终微管蛋白的产量，新鲜脑组织中功能性微管蛋白的初始含量至关重要。越新鲜的脑组织含有越多的功能性微管蛋白。为获得最新鲜的脑组织，建议要求屠夫提供最近屠宰的牛的脑组织。实验开始时脑组织存放时间不应超过 3 小时，因为屠宰与实验开始之间的时间越短，产量越高。
    2. 匀浆并澄清脑组织。
      1. 使用手术刀将血管和结缔组织切成小块，并手动从脑组织中去除。
        注意：清理后的脑组织应呈粉红色。
      2. 每公斤脑组织用 1 L 去聚合缓冲液（DB：50 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸，1 mM CaCl2，pH 6.6）浸泡清理后的脑组织。
      3. 使用厨房搅拌机匀浆脑组织。
      4. 将匀浆后的脑组织溶液在 10,000 × g、4 °C 条件下离心 150 分钟。
    3. 聚合微管（第一次聚合）。
      1. 在 37 °C 下，将上清液与等体积的以下溶液混合：甘油、高摩尔浓度 PIPES 缓冲液（HMPB：1 M PIPES，10 mM MgCl2，20 mM 乙二醇双(β-氨基乙醚)-N,N,N',N'-四乙酸 [EGTA]，pH 6.9）。
      2. 向混合液中加入 1.5 mM ATP 和 0.5 mM 鸟苷三磷酸（GTP）。
      3. 在 37 °C 下孵育 1 小时。
    4. 去聚合微管（第一次微管去聚合）。
      1. 在 151,000 × g、37 °C 条件下离心 30 分钟，沉淀微管。
      2. 弃去上清液，将每个微管沉淀用 10 mL 4 °C 的 DB 重悬。
      3. 在冰上孵育 30 分钟。
      4. 每隔 5 分钟用移液器吸头轻轻搅动混合液，以防止微管沉降。
        注意：30 分钟内混合液应变得澄清，表明微管去聚合已完成。
    5. 聚合微管（第二次微管聚合）。
      1. 在 70,000 × g、4 °C 条件下离心 30 分钟，澄清溶液。
      2. 收集上清液，并与等体积的 37 °C 甘油和 HMPB 混合。
      3. 向混合液中加入 1.5 mM ATP 和 0.5 mM GTP。
      4. 在 37 °C 下孵育 30 分钟。
    6. 重复步骤 1.1.4，将 HMPB 替换为 Brinkley 重聚合缓冲液（BRB）80（80 mM PIPES，1 mM MgCl2，1 mM EGTA，pH 6.8），然后将澄清后的混合液在 79,000 × g、4 °C 条件下离心 30 分钟以进一步澄清。
    7. 收集上清液。使用分光光度计测定 280 nm 处的吸光度。利用比尔-朗伯定律（微管蛋白的消光系数：1.15 (mg/mL)-1cm-1）37,38 确定微管蛋白浓度。
    8. 将蛋白在 -80 °C 下保存。
  2. 回收微管蛋白（改编自 Castoldi 等人36）。
    注意：为提高微管蛋白纯度，将已纯化的微管蛋白再次进行聚合和去聚合。
    1. 将纯化的微管蛋白（步骤 1.1.7）与 500 µM 二硫苏糖醇（DTT）和 20 µM GTP 混合，在 37 °C 下孵育 30 分钟，以聚合微管。
    2. 沉淀微管。
      1. 在离心管底部加入 1 mL 甘油垫层（80 mM PIPES，1 mM MgCl2，1 mM EGTA，60% v/v 甘油，pH 6.8）。
      2. 将聚合后的微管铺在垫层上方。
      3. 在 172,000 × g、37 °C 条件下离心 90 分钟。
    3. 去聚合微管。
      1. 移除上清液和垫层。
      2. 将每个微管沉淀用 150 µL 4 °C 的微管缓冲液（M2B：80 mM PIPES，2 mM MgCl2，1 mM EGTA，pH 6.8）重悬。
      3. 在冰上孵育 30 分钟。
      4. 每隔 5 分钟用移液器吸头轻轻搅动混合液。混合液应变得澄清。
    4. 在 172,000 × g、4 °C 条件下离心 30 分钟，澄清混合液。
    5. 收集上清液。测定蛋白浓度，并在 -80 °C 下保存。
  3. 用荧光染料标记微管蛋白39。
    1. 聚合微管。将纯化的微管蛋白（步骤 1.1.7）与 500 µM DTT 和 16.7 µM GTP 混合，在 37 °C 下孵育 30 分钟。
    2. 沉淀微管。
      1. 在离心管中加入 1 mL 37 °C 的高 pH 垫层（0.1 M NaHEPES，1 mM MgCl2，1 mM EGTA，60% v/v 甘油，pH 8.6）。
      2. 将聚合后的微管铺在垫层上。
      3. 在 327,000 × g、37 °C 条件下离心 50 分钟。
    3. 标记微管蛋白。
      1. 将每个微管沉淀用 700 µL 37 °C 的标记缓冲液（0.1 M NaHEPES，1 mM MgCl2，1 mM EGTA，40% v/v 甘油，pH 8.6）重悬。
      2. 将悬浮液与 10–20 倍摩尔过量的带有琥珀酰亚胺酯的远红外荧光染料混合。
      3. 在 37 °C 黑暗条件下孵育 30 分钟，使微管与荧光染料的酯基发生反应。
      4. 通过加入 50 mM K-谷氨酸盐饱和染料中的酯基，在 37 °C 孵育 5 分钟，终止标记反应。
    4. 沉淀标记后的微管：重复步骤 1.3.2，将高 pH 垫层替换为低 pH 垫层（80 mM PIPES，2 mM MgCl2，1 mM EGTA，60% v/v 甘油，pH 6.8）。
    5. 去聚合微管。
      1. 弃去上清液和垫层。
      2. 将沉淀用 700 µL 4 °C 的 M2B 重悬。
      3. 将悬浮液置于冰上孵育。
      4. 每隔 5 分钟用移液器吸头轻轻搅动，直至溶液澄清。
    6. 在 184,000 × g、4 °C 条件下离心 35 分钟，澄清去聚合后的溶液。
    7. 通过重复步骤 1.2.1–1.2.4，进一步提高标记微管蛋白溶液的纯度。
    8. 测定蛋白和荧光染料的浓度。利用这些测量值确定微管蛋白浓度以及标记微管蛋白的比例，即荧光染料浓度与微管蛋白浓度的比值。
    9. 将标记后的微管蛋白溶液在 -80 °C 下保存。
  4. 聚合微管（采用自 Sanchez 等人19）：
    1. 将回收的微管蛋白（步骤 1.2.5）与标记的微管蛋白（步骤 1.3.9）按比例混合，使标记微管蛋白的比例为 3%。
    2. 将 8 mg/mL 的微管蛋白混合液与 1 mM DTT 和 0.6 mM 鸟苷-5'[(α,β)-亚甲基]三磷酸（GMPCPP）混合，在 37 °C 下孵育 30 分钟。
    3. 孵育结束后，在室温黑暗条件下退火 6 小时。
    4. 分装并在 -80 °C 下保存。

2. 合成驱动蛋白簇

注意：细菌普遍存在，可在培养基中生长并污染制备过程。为防止污染，所有涉及接触细胞培养物的操作（例如移液）必须在火焰附近进行。烧瓶、移液器、移液枪头、培养基和培养皿等工具在使用前必须经过高压灭菌。

  1. 表达驱动蛋白马达 大肠杆菌40.
    1. 转化细胞。
      1. 将1 µL K401-BCCP-H6质粒加入10 µL感受态细胞中。
      2. 冰上孵育5分钟。
      3. 42.5 °C 热激 45 秒
      4. 将细胞置于冰上孵育2分钟，以促进恢复。
      5. 将细胞与300 µL无抗生素的2XYT培养基（5 g/L NaCl，10 g/L酵母提取物，16 g/L胰蛋白胨）混合。
      6. 在37 °C下孵育细胞1小时。
        注意：除非另有说明，孵育期间无需监测细胞生长。
    2. 接种平板培养基。
      1. 将细胞培养物涂布于2XYT平板（10 g/L NaCl，5 g/L酵母提取物，10 g/L胰蛋白胨，15 g/L琼脂，100 µg/mL氨苄青霉素，25 µg/mL氯霉素）上。
      2. 将培养板倒置，于37 °C过夜培养。
    3. 接种液体培养基。
      1. 从过夜培养的平板上，用移液器吸头挑取一个单菌落。
      2. 将枪头弃入含有50 mL 2XYT的烧瓶中。
      3. 在37 °C、200 rpm条件下振荡培养培养基12–16小时。
    4. 扩增细胞。
      1. 将2.5 mL细胞培养物与500 mL 2XYT混合。
      2. 在37 °C、250 rpm条件下孵育并振荡500 mL培养物，持续3–6 h。
    5. 诱导蛋白表达。
      1. 孵育期间，使用2XYT作为空白对照，每60分钟测量一次600 nm处的吸光度，监测细胞生长，直至吸光度达到OD600 = 0.3。然后每30分钟测定一次吸光度，直至达到0.5–0.6。
      2. 让细胞生长至吸光度达到OD600 = 0.5–0.6
      3. 向细胞培养物中加入 24 µg/mL 生物素和 1 mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）。
        注意：IPTG 用于诱导带有生物素羧基载体蛋白（BCCP）和六个组氨酸（H6）标签的驱动蛋白马达的表达。H6 标签用于纯化过程（步骤 2.2），而 BCCP 可与添加的生物素分子结合，从而使表达的驱动蛋白马达生物素化。
      4. 在20 °C、250 rpm条件下孵育并振荡细胞培养物12–20小时。
    6. 通过在 5,000 x g 条件下离心收集细胞 g 4 °C 下离心 10 分钟。弃去上清液。将细胞沉淀保存于 -80 °C。
  2. 纯化驱动蛋白马达蛋白（改编自 Spriestersbach 等人）41):
    1. 将细胞沉淀（步骤 2.1.6）用等体积的裂解缓冲液（50 mM PIPES，4 mM MgCl₂）重悬2，50 µM ATP，10 mM 2-巯基乙醇（βME），20 mM 咪唑，pH 7.2），随后加入一片蛋白酶抑制剂、2 mg 苯甲基磺酰氟（PMSF）和 2 mg 溶菌酶。
    2. 通过液氮（LN）快速冷冻细胞3次，并解冻细胞混合物以裂解细胞。
      注意：裂解后，混合物应变得黏稠。
    3. 通过在 230,000 x g 条件下离心澄清裂解的细胞混合物 g 4 °C 下 30 分钟
    4. 收集上清液，使其流经重力柱，随后用10 mL裂解缓冲液洗涤柱子。
      注意：带有 H6 标签的蛋白质（如驱动蛋白 K401-BCCP-H6）应保留在柱中。
    5. 用 5 mL 洗脱缓冲液（50 mM PIPES，4 mM MgCl₂）洗脱带标签的蛋白2，50 µM ATP，500 mM 咪唑，pH 7.2）。依次收集流出液，每份1 mL。为确定含蛋白的组分，取每份3 µL与100 µL三苯基甲烷染料混合，含蛋白的组分应变为蓝色。合并这些组分，并用裂解缓冲液稀释5倍。
    6. 浓缩蛋白质溶液。
      1. 将溶液加入离心过滤管中。
      2. 3,000 x g 离心 g 4 °C 下离心 10 分钟。
      3. 轻轻振荡试管，再次离心，直至溶液体积达到指定量 <3 mL
    7. 使用分光光度计测定蛋白质浓度（消光系数：0.549 (mg/mL)）-1cm-1)42,43将蛋白稀释至1 mg/mL，同时加入35% w/v蔗糖。
    8. -80 °C 保存。
  3. 使用电泳凝胶测定驱动蛋白浓度（改编自 Taylor 等人）44).
    注意：由于微管蛋白纯度高，且可通过分光光度计测定其浓度，因此在电泳凝胶中测量驱动蛋白浓度时，微管蛋白是理想的浓度梯度参照图2A)36.
    1. 制备浓度分别为 0.25、0.5、0.75、1.00 和 1.25 mg/mL 的微管蛋白样品。分别取 15 µL 每种微管蛋白样品与驱动蛋白样品（步骤 2.2.8），各自与 5 µL 上样缓冲液（200 mM Tris-HCl，8% 十二烷基硫酸钠（SDS），400 mM DTT，0.2% 溴酚蓝，40% 甘油，pH 6.8）混合，于 90 °C 孵育 3 分钟。
    2. 制备电泳。
      1. 将电泳凝胶固定在凝胶槽中。
      2. 加入电泳缓冲液（50 mM MOPS，50 mM Tris 碱，0.1% SDS，1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA），pH 7.7）至槽内。
        注意：确保缓冲液液面高于凝胶的顶部开口。
    3. 将10 µL蛋白标准品、微管蛋白样品和驱动蛋白样品分别加入不同加样孔中，以200 V电压电泳45分钟。
    4. 凝胶染色
      1. 将凝胶与煮沸的（约 95 °C）染色液 A（0.5 g/L 三苯基甲烷染料，10% v/v 乙酸，25% 异丙醇）孵育并振荡 5 分钟，然后用去离子水（DI 水）冲洗凝胶。
      2. 依次使用染色液B（0.05 g/L三苯甲烷染料，10% v/v乙酸，10%异丙醇）、染色液C（0.02 g/L三苯甲烷染料，10% v/v乙酸）和染色液D（10% v/v乙酸）重复上述步骤。将凝胶置于去离子水中孵育并振荡过夜。
    5. 扫描凝胶。将凝胶图像转换为灰度图像，随后进行黑白反转和对比度增强，以在黑色背景上显示出明亮的蛋白质条带。
    6. 通过累加像素值来测量每条带的亮度。应用线性拟合 C = aB + b，其中 B 是微管蛋白条带的亮度， C 是相应的浓度，且 a 和 b 为拟合参数。确定驱动蛋白的浓度 Ck 通过使用驱动蛋白条带的亮度 Bk 计算线性方程： Ck = aBk + b.
  4. 将驱动蛋白马达进行聚类。
    1. 将1.5 µM驱动蛋白（步骤2.2.8）与120 µM DTT和120 nM链霉亲和素混合，冰上孵育30分钟。
    2. -80 °C 保存。

3. 制备聚丙烯酰胺包被的玻片和盖玻片（修改自 Lau 等人45）

  1. 将新的载玻片和盖玻片分别放入相应的容器中。用去离子水配制的1%（v/v）洗涤剂浸泡载玻片和盖玻片，然后在微波炉中煮沸去离子水。
  2. 将载玻片和盖玻片超声处理5分钟，然后用去离子水冲洗以去除洗涤剂。
  3. 将载玻片和盖玻片浸入乙醇中并超声处理5分钟，再用去离子水冲洗。
  4. 将载玻片和盖玻片浸入100 mM氢氧化钾（KOH）溶液中并超声处理5分钟，然后用去离子水冲洗。
  5. 将载玻片和盖玻片在硅烷溶液（含1%乙酸和0.5% 3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯的乙醇溶液）中孵育15分钟，然后用去离子水冲洗。
  6. 将载玻片和盖玻片在丙烯酰胺溶液（含2%（w/w）丙烯酰胺、0.7 mg/mL过硫酸铵和0.0035%（v/v）四甲基乙二胺的去离子水溶液）中孵育不少于3小时。
  7. 将载玻片和盖玻片保存在丙烯酰胺溶液中。

4. 制备由驱动蛋白驱动、微管为基础的活性流体

  1. 制备活性流体（改编自 Sanchez 等人19）。
    注意：以下步骤演示了使用示例储备液制备 100 µL 活性流体的过程。最终体积可按比例缩放，只要保持各组分的终浓度不变，示例储备液的浓度可相应调整。
    1. 在高盐 M2B 缓冲液（M2B + 3.9 mM MgCl2）中，将 16.7 µL 的 8 mg/mL 微管（步骤 1.4.4）与 6.7 µL 的 1.8 µM 驱动蛋白马达簇（步骤 2.4.2）以及 1.1 µL 的 500 mM DTT 混合。
    2. 通过加入 11.4 µL 的 7% w/w 聚乙二醇（PEG）使微管成束。
    3. 通过加入 2.8 µL 的 50 mM ATP 激活驱动蛋白马达。
    4. 通过加入 2.8 µL 的丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶（PK/LDH）储备液和 13.3 µL 的 200 mM 磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）维持 ATP 浓度。
    5. 通过加入 10 µL 的 20 mM Trolox、1.1 µL 的 3.5 mg/mL 过氧化氢酶、1.1 µL 的 20 mg/mL 葡萄糖氧化酶和 1.1 µL 的 300 mg/mL 葡萄糖，以减少光漂白效应。
    6. 通过加入 1.6 µL 的 0.025% v/v 示踪颗粒来追踪流体运动。
    7. 加入高盐 M2B 缓冲液，使总体积达到 100 µL。
      注意：步骤 4.1.1–4.1.6 中的添加顺序可互换。然而，一旦 ATP、微管和马达混合，马达即开始沿微管运动并消耗 ATP。由于燃料（ATP 和 PEP）有限，样品具有有限的激活寿命，因此实验应尽快开始。最终活性流体应包含 1.3 mg/mL 微管、120 nM 驱动蛋白马达簇、5.5 mM DTT、0.8% w/w PEG、1.4 mM ATP、2.8% v/v PK/LDH、27 mM PEP、2 mM Trolox、0.038 mg/mL 过氧化氢酶、0.22 mg/mL 葡萄糖氧化酶、3.3 mg/mL 葡萄糖和 0.0004% v/v 胶体，溶于高盐 M2B 缓冲液中。
  2. 在流动通道中制备样品（改编自 Chandrakar 等人46）：
    1. 用去离子水冲洗聚丙烯酰胺包被的载玻片和盖玻片（步骤 3.7），用加压空气吹干，置于洁净、平整的表面上。
    2. 裁剪两条宽度为 3 mm、长度与盖玻片（20 mm）相同的蜡膜条，将其插入载玻片与盖玻片之间作为通道间隔物。
    3. 将载玻片-蜡膜复合物置于 80 °C 的加热板上，使蜡熔化，从而将玻璃与蜡膜粘合。在熔化过程中，用移液器吸头轻轻按压盖玻片，使蜡膜均匀粘附于玻璃表面。粘合完成后，将玻璃复合物冷却至室温。
    4. 将活性流体（步骤 4.1）注入流动通道，并用紫外胶密封通道。

5. 控制样品温度

  1. 搭建温度控制装置（修改自 Lowensohn 等人和 Wu 等人的设计47,48,49）。
    1. 准备一个铝制冷却块。
      1. 铣削一块尺寸约为 30 mm × 30 mm × 5 mm 的铝板。
      2. 在铝板内部钻出一条通道（图 3A），并在通道两端安装水管接头。
      3. 将每个接头连接到一根水管上。
      4. 将其中一根水管连接至水箱中的鱼缸泵，另一根水管则延伸回水箱。
        注：泵将使水箱中的水在铝块内部通道中循环，以维持铝块温度接近室温。
    2. 将热电制冷器（TEC）和温度传感器连接至温度控制器。使用 USB 接口将控制器连接至计算机（图 3B）。
    3. 将温度控制器连接至直流（DC）电源。通过将电源插入电源插座来开启控制器。
    4. 根据控制器制造商的指南完成 TEC 的初始设置。测试 TEC 输出。建议使用制造商提供的软件控制温度控制器，以便记录温度传感器数据并更方便地调节温度控制器。
    5. 确定 TEC 的加热侧和冷却侧。
    6. 使用导热硅脂将 TEC 的冷却侧固定在冷却块上（步骤 5.1.1）。
    7. 使用导热硅脂将蓝宝石圆盘固定在 TEC 的加热侧。
    8. 装置组装完成。蓝宝石表面和温度传感器可接触样品，根据样品当前温度与目标温度对其进行加热或冷却。
      注：建议 TEC 和冷却块中央对齐开孔，以便使用明场显微镜对样品进行成像（图 3C）。
  2. 使用温度控制装置调控样品温度33。
    1. 将样品安装到装置上。
      1. 将活性流体样品（步骤 4.2.4）放置在蓝宝石表面，使载玻片一侧接触该表面。
      2. 用纸胶带固定玻璃载玻片。
      3. 使用铜箔胶带将温度传感器固定在盖玻片表面。
    2. 将装置安装在显微镜载物台上，使盖玻片一侧朝向物镜。例如，在倒置显微镜上，盖玻片一侧应朝下。如适用，使用纸胶带和显微镜载物台针形夹具固定装置。
      注：本温度控制装置适用于常见的倒置或正置显微镜。为确保实验过程中温度装置不发生移动，最好使用胶带将其牢固固定在显微镜载物台上。
    3. 控制样品温度。
      1. 开启温度控制器和鱼缸泵。
      2. 根据制造商指南设定目标温度并启动温度控制。控制器将根据目标温度和温度传感器测得的样品温度，自动调节加热或制冷功率。
    4. 记录样品温度。
      1. 根据制造商指南，在实验过程中记录温度传感器的温度数据。
        注：此时样品温度应由控制器进行调控，并由计算机记录（图 3D）。

6. 表征活性流体的活性（改编自 Henkin 等人和 Wu 等人的方法20,27）

注意：前面的步骤用于制备活性流体样品（第1–4节）并控制其温度（第5节）。为了演示如何利用温度控制活性流体的活性，请观察流体行为，分析其活性，并表征其对温度的响应。

  1. 监测示踪剂。
    1. 使用绿色荧光蛋白（GFP）荧光以恒定时间间隔 Δt 对样品成像，以捕获示踪颗粒的运动。
      注意：应选择合适的 Δt 以确保能够追踪示踪剂的运动。过大的 Δt 值（例如 100 s）会导致丢失示踪轨迹，而过短的 Δt 值（例如 0.1 s）会使追踪算法无法检测帧间的示踪剂移动。合适的 Δt 应使帧间示踪剂位移约为 9 像素左右。当使用 4 倍物镜观察以 10 µm/s 移动的示踪剂时，建议 Δt 设置为 1–5 s。
    2. 将图像保存为 TIFF 文件，按帧编号命名文件，并存储在独立的文件夹中。这些步骤对于确保后续能正确使用提供的 MATLAB 脚本进行分析（步骤 6.2.2）至关重要。
  2. 使用 Ouellette 等人开发的追踪软件进行示踪剂追踪50,51：
    1. 从斯坦福大学环境复杂性实验室下载追踪软件（https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml）。确保所有 MATLAB 文件位于同一文件夹中。
    2. 使用自定义 MATLAB 脚本 particle_tracking.m 进行示踪剂追踪。该脚本读取示踪剂图像（步骤 6.1），并利用 Ouellette 等人50,51 的软件追踪示踪剂运动，输出两个文件：1) background.tif，表示图像背景；2) Tracking.mat，包含每帧中示踪颗粒的轨迹和速度（图 4A）。
  3. 使用自定义 MATLAB 脚本 analysis.m 分析示踪剂的平均速度。该脚本读取追踪文件（Tracking.mat），输出示踪剂平均速度随时间的变化曲线，以及在指定时间窗口内的时均平均速度（图 4B）33。
  4. 记录时均平均速度。
  5. 在 10–40 °C 范围内重复实验（步骤 4、5.2 和 6.1–6.4），测量不同温度下的时均平均速度。利用记录的平均速度绘制平均速度随温度变化的关系图（图 4C）33。

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结果

制备由驱动蛋白驱动、微管（MT）为基础的活性流体需要同时使用驱动蛋白和微管。微管由标记的微管蛋白聚合而成（步骤1.3和1.4），这些微管蛋白从牛脑中纯化获得（步骤1.1，图2A），随后通过回收步骤提高纯度（步骤1.2，图2B）。驱动蛋白马达蛋白在大肠杆菌（E. coli）中表达并纯化（步骤2.1和2.2，图2B）41,52。通过SDS凝胶测定所制备的驱动蛋白储备液浓度，方法是将主条带的亮度与已知浓度的回收微管蛋白条带亮度进行比较（步骤2.3，图2B 插图）。微管蛋白条带的亮度值（B）...

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讨论

原位控制活性物质为活性物质的定向自组织开辟了途径4,5,24,28,54。本文介绍了一种基于系统阿伦尼乌斯特性的原位温度控制方法，用于调控驱动蛋白驱动的微管（MT）活性流体29,30,31。由于该系统基于蛋白质，因此在整个实验过程中维持蛋白质功能是成功应用该方案的关键。系统中的主要蛋白质为微管（MTs）和驱动蛋白聚集体。前者在低于16 °C时发生去聚合，而后者在高于36 °C时功能失常33。因此，将系统温度维持在16–36 °C之间，对于活性流体形成稳定的动力学行为以及实现可逆的温度...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

质粒K401-BCCP-H6由Zvonimir Dogic博士惠赠。本研究得到了伍斯特理工学院Kun-Ta Wu博士启动资金的支持。我们感谢Zvonimir Dogic博士提供微管蛋白纯化与标记以及活性流体合成的实验方案。我们感谢Marc Ridilla博士在蛋白质表达与纯化方面的专业指导。我们感谢William Benjamin Roger博士在搭建温控载物台过程中提供的帮助。我们感谢布兰迪斯大学材料研究科学与工程中心（Brandeis MRSEC，NSF-MRSEC-1420382）提供的生物材料设施（BMF）使用权限。我们感谢英国皇家化学会允许改编自Bate等人研究中的图示。 软物质33.

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
(±)-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸Sigma-Aldrich238813Trolox
2-巯基乙醇Sigma-AldrichM6250
3-(三甲氧基硅基)丙基甲基丙烯酸酯，98%，ACROS OrganicsFisher ScientificAC216550050
内径3.2 mm Tygon R-3603管HACH2074038水管
直径31.75 mm未镀膜蓝宝石窗口Edmund Optics43-637蓝宝石圆片
3M 1181铜箔胶带 - 宽度1/2英寸 × 长度18码 - 总厚度2.6密耳 - 27551R.S. HUGHES054007-27551铜箔胶带
乙酸Sigma-AldrichA6283
丙烯酰胺溶液（40%/电泳级），Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1402-1
腺苷-5'-三磷酸二钾盐水合物Sigma-AldrichA8937ATP
Alexa Fluor 647 NHS酯（琥珀酰亚胺酯）Thermo Fisher ScientificA20006远红荧光染料。Alexa 647可在与微管混合前溶于二甲基亚砜（DMSO）中（1.3.3.2.）
Amicon Ultra-4离心过滤单元Sigma-AldrichUFC801024离心过滤管。截留分子量：10 kDa
过硫酸铵，100 g，MP BiomedicalsFisher ScientificICN802829APS
氨苄青霉素钠盐（结晶粉末），Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1760氨苄青霉素
防振台Nikon63-7590S
Avanti J-E离心机Beckman Coulter369001
Bacto琼脂凝固剂，BD诊断VWR90000-760琼脂
生物素Alfa AesarA14207
塑料白色桶 - 2加仑Bon84-715水桶
氯化钙Sigma-Aldrich746495CaCl2
牛肝过氧化氢酶Sigma-AldrichC40
CFI Plan Apo Lambda 4x物镜NikonMRD000454x空气物镜
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero ShiftNikon96372GFP滤光立方体
CH-109-1.4-1.5TE TechnologyCH-109-1.4-1.5热电冷却器（TEC）
氯霉素，98%，ACROS OrganicsFisher ScientificC0378
冷却块N/AN/A定制铣削铝块
考马斯亮蓝R-250 #1610400Bio-Rad1610400三苯甲烷染料
D-(+)-葡萄糖Sigma-AldrichG7528
二甲基亚砜（ACS认证），Fisher ChemicalFisher ScientificD128DMSO
DL-1,4-二硫苏糖醇，99%，生化级，ACROS OrganicsFisher ScientificAC165680050DTT
DOWSIL 340散热膏Dow1446622导热硅脂
乙醇，200 proof，ACS/USP/NF级，5加仑聚乙烯方桶Pharmco by Greenfield Global111000200CB05乙醇
乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸Sigma-AldrichE3889EGTA
乙二胺四乙酸Sigma-Aldrich798681EDTA
Fisher BioReagents微生物培养基添加剂：胰蛋白胨Fisher ScientificBP1421胰蛋白胨
Fisher BioReagents微生物培养基添加剂：酵母提取物Fisher ScientificBP1422酵母提取物
Fluoresbrite YG微球，校准级，3.00 µmPolysciences18861示踪颗粒
来自黑曲霉的葡萄糖氧化酶Sigma-AldrichG2133
甘油Sigma-AldrichG5516
GpCppJena BioscienceNU-405L鸟苷-5’[(α,β)-亚甲基]三磷酸（GMPCPP）
GS Power 18号规格（美标线规），100英尺，99.9%绞合无氧铜OFC，红/黑双芯并联电源/扬声器电缆，适用于汽车、音频、家庭影院AmazonB07428NBCW铜线
鸟苷-5'-三磷酸钠盐水合物Sigma-AldrichG8877GTP
Hellmanex IIISigma-AldrichZ805939洗涤剂
HEPES钠盐（白色粉末），Fisher BioReagentsFisher ScientificBP410NaHEPES
高性能搅拌机AIMORESAS-UP1250搅拌机
His GraviTrapGE Healthcare11003399重力柱
咪唑Sigma-AldrichI5513
IPTGSigma-AldrichI6758异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷
异丙醇 99%Pharmco by Greenfield Global231000099异丙醇
JA-10转子Beckman Coulter369687
L-谷氨酸钾盐一水合物Sigma-AldrichG1501K-谷氨酸盐
来自鸡蛋清的溶菌酶Sigma-AldrichL6876
六水合氯化镁Sigma-AldrichM2670MgCl2•6H2O
MES钠盐Sigma-AldrichM50572-(N-吗啉代)乙磺酸钠盐
MOPSSigma-AldrichM12543-(N-吗啉代)丙磺酸
MP-3022TE TechnologyMP-3022热电偶
N,N,N',N'-四甲基乙二胺，99%，ACROS OrganicsFisher ScientificAC138450500TEMED
Nanodrop 2000c紫外-可见分光光度计Thermo Fisher ScientificE112352分光光度计
Nikon Ti2-E倒置显微镜NikonMEA54000
Norland光学胶81Norland ProductsNOA81紫外胶
Novex Sharp预染蛋白标准品Thermo Fisher ScientificLC5800蛋白标准品梯
NuPAGE 4-12% Bis-Tris蛋白凝胶，1.5 mm，10孔Thermo Fisher ScientificNP0335BOXSDS凝胶
Optima L-90K超速离心机Beckman Coulter365672
Parafilm PM996封口膜，宽4"，每卷125英尺Cole-ParmerEW-06720-40石蜡膜
Pe 300 ultra照明系统单波段，3 mm导光管控制舱电源NikonPE-300-UT-L-SB-40冷LED照明器
苯甲基磺酰氟Sigma-Aldrich78830PMSF
磷酸烯醇式丙酮酸单钾盐，99%BeanTown Chemical129745PEP
Pierce考马斯亮蓝（Bradford）蛋白检测试剂盒Thermo Fisher Scientific23200
Pierce蛋白酶抑制剂迷你片剂Thermo Fisher ScientificA32953
PIPESSigma-AldrichP67571,4-哌嗪二乙磺酸
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443
聚乙二醇Sigma-Aldrich81300PEG。平均分子量20,000 Da
氢氧化钾（颗粒/ACS认证），Fisher ChemicalFisher ScientificP250-500KOH
PowerEase 300W电源（115 VAC）ThermoFisher ScientificPS0300电泳槽直流电源
PS-12-8.4ATE TechnologyPS-12-8.4A温控器直流电源
来自兔肌肉的丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶酶Sigma-AldrichP-0294PK/LDH
Quiet One Lifegard喷泉泵，每小时296加仑AmazonB005JWA612鱼缸泵
Rosetta 2(DE3)pLysS感受态细胞 - NovagenMillipore Sigma71403感受态细胞
Sharp ZSMC0912BS微波炉，900W台式，0.9立方英尺，不锈钢AmazonB01MT6JZMR用于加热水的微波炉
氯化钠（晶体/ACS认证），Fisher ChemicalFisher ScientificS271-500NaCl
十二烷基硫酸钠Sigma-AldrichL3771SDS
磷酸二氢钠Sigma-AldrichS8282NaH2PO4
链霉亲和素蛋白Thermo Fisher Scientific21122
蔗糖Sigma-AldrichS7903
TC-720TE TechnologyTC-720温度控制器
Tris碱，分子生物学级 - CAS 77-86-1 - CalbiochemSigma-Aldrich648310Tris-HCL
Type 45 Ti转子Beckman Coulter339160
Type 70 Ti转子Beckman Coulter337922
Type 70.1 Ti转子Beckman Coulter342184
VWR通用实验室标签胶带VWR89097-916纸质胶带
VWR显微盖玻片，方形，No. 1 1/2VWR48366-227玻璃盖玻片
VWR普通和磨砂显微载玻片，优质VWR75799-268玻璃载玻片
XCell SureLock Mini-CellThermoFisher ScientificEI0001电泳槽
ZYLA 5.5 USB3.0相机NikonZYLA5.5-USB3单色CCD相机

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