使用温度控制基于微管的3D活性流体的流速

摘要

该协议的目的是使用温度来控制三维有源流体的流动速度。这种方法的优点不仅允许原地调节流速，还可实现动态控制，例如定期调优流速。

摘要

我们提出了一种利用温度来调整运动因子驱动的基于微管的三维（3D）有源流体的流速的方法。此方法允许原地调整速度，而无需制造新样品以达到不同的期望速度。此外，该方法可实现速度的动态控制。循环温度会导致流体周期性地快速流动和缓慢流动。这种可控性基于激酶-微管反应的Arrhenius特性，显示了4~8μm/s的受控平均流速范围。提出的方法将为微流体器件的设计打开大门，在微流体器件中，通道中的流速可局部调节，无需阀门。

引言

主动物质与传统无源物质不同，因为能将化学能转化为机械工作。具有这种能力的材料可以包括活的或非生物的实体，如细菌、昆虫、胶体、谷物和细胞骨骼细丝1，2，3，4，5，6，7，8，9，10。这些物质实体与其邻居交互。在更大的尺度上，它们自组织成湍状涡流（主动湍流）或物质流动11，12，13，14，15，16，17，18，19，20。对活性物质自组织的理解已导致分子穿梭、光学器件和并行计算21、22、23的各种应用。要将应用程序带到一个新的水平，需要超越自组织的控制。例如，Palacci等人研制出一种赤铁矿封装的胶体，只有在暴露在手动控制的蓝光下才能自行推进，这导致了活^晶体24的出现。Morin等人利用可调谐的外部电场建立了滚动昆克胶体的控制，导致胶体在赛道状的^通道25中形成。这些以前的工作展示了局部控制在应用中的作用，并推进了活性物质的知识库。

在本文中，我们重点介绍了运动因子驱动的基于微管 （MT） 的 3D 活性流体的可控性。流体由三个主要成分组成:MT、激酶分子马达和消耗物。消耗物会产生消耗力来捆绑 MT，这些 MT 后来被电机簇桥接。这些电机沿着 MT 向加端移动。当一对桥接的MTsis反平行时，相应的电机朝相反的方向行走。但是，电机被绑定在一个簇中，无法分开，因此它们协同滑动成对的 MT（间丝滑动，图 1 A）。这些滑动动力学积累，导致束的MTsto延伸，直到达到其屈曲不稳定点和断裂（扩展束，图1B）26。破碎的束被耗尽力退火，随后再次延伸，动态重复。在重复动力学过程中，捆绑运动搅动附近的液体，诱导流动，可以通过使用微米级示踪剂进行掺平来可视化（图1C）。桑切斯等人和Henkin等人对示踪剂的平均速度进行了描述，发现通过改变三磷酸腺苷（ATP）、消耗物、电机簇和MC19、27的浓度，速度是可调节的。然而，这种可调谐性仅在活性流体合成之前存在。合成后，适应性丧失，流体以自己的方式自行组织。为了控制合成后的活性流体活性，Ross.etal.报告了一种使用光激活的马达蛋白二聚化方法，允许使用^光28调节流体活性。虽然光控制在局部激活流体方面是方便的，但该方法需要重新设计运动蛋白的结构，同时在显微镜中修改光学路径。在这里，我们提供了一种易于使用的方法，用于在无需显微镜修改的情况下控制流体流动，同时保持电机结构不变。

我们的局部调谐有源流体流动的方法基于阿雷尼乌斯定律，因为激酶-MT反应已经报告随着温度29，30，31，32增加。我们先前的研究表明，活性流体流的平均速度的温度依赖性遵循Arrhenius方程:v = A exp（- E_a/RT），其中A是指数前因子，R是气体常数，E_a是活化能，T是系统^温度33。因此，流体活性对温度环境敏感，系统温度需要一致，以稳定电机性能，因此，流体流动速度^为34。在本文中，我们演示了利用电机的温度依赖性通过调整系统温度来持续调整有源流体的流速。我们还演示了活性流体样品的制备，然后将样品安装在通过计算机软件控制温度的显微镜阶段。将温度从16°C提高到36°C可加快平均流速从4至8μm/s。 此外，可调节性是可逆的:反复升高和降低温度顺序加速和减速流。演示的方法适用于主要反应遵循Arrhenius定律的各种系统，如MT滑翔测定29、30、31、32。

方案

1. 编制MT

注意:在这一步中，我们从牛脑组织中纯化牛头蛋白。牛脑可能导致变种克罗伊茨费尔特-雅科布病（vCJD）35。因此，应将脑废物及相关溶液、瓶子和移液器吸头收集在生物垃圾袋中，并按照机构规定作为生物危险废物进行处理。

1. 从牛脑中纯化牛头蛋白（从Castoldi等人^{改过自36年）。}
   1. 将大约1.5公斤的新鲜牛脑从当地的屠宰场运送到大学冷室。在运输过程中，将大脑储存在磷酸盐缓冲液（20mM NaH₂PO₄，150 mM NaCl，pH 7.2）的冰上。
      注:为了最大化图布林的最终产量，新鲜脑组织中功能性图布林的初始量是关键。新鲜的大脑含有更多的功能性图布林。为了从屠宰场获得最新鲜的大脑，我们建议让屠夫提供最近屠宰的奶牛的大脑。启动手术时，大脑不应超过3小时，因为减少屠宰和手术开始之间的时间将产生更好的产量。
   2. 同质化和澄清大脑。
      1. 使用手术刀将血管和结缔组织切成小块，用手从大脑中去除，清洁大脑。
         注:清洁的大脑应该是粉红色的。
      2. 每公斤脑的去聚合缓冲液（DB:50 mM 2-（N-变形）酸，1 mM CaCl 2，pH 6.6）中浸润的脑组织。
      3. 用厨房搅拌机使大脑均匀化。
      4. 在10，000 x g和4°C下将均质脑溶液离心150分钟。
   3. 聚合 MT（第一次聚合）。
      1. 在 37°C 下收集并混合具有相同体积的以下溶液:甘油、高摩尔性 PIPES 缓冲液（HMPB: 1 M PIPES、10 mMMgCl 2、20 mM 乙二醇-二乙二醇-二酯（β-氨基乙醚）-N、N'、N'-四乙酸 [EGTA]、pH 6.9）
      2. 在混合物中加入1.5 mM ATP和0.5 mM三磷酸基苯基。
      3. 在37°C孵育混合物1小时。
   4. 脱聚MT（第一次MT去聚合）。
      1. 在 151，000 x g和 37 °C 下离心 30 分钟。
      2. 丢弃上清液，将每个 MT 颗粒重新悬浮在 4 °C DB 的 10 mL 中。
      3. 在冰上孵育30分钟。
      4. 每 5 分钟用移液器尖搅拌一次混合物，以避免 MT 沉淀。
         注:混合物应在30分钟内变清楚，表明MT去聚合完成。
   5. 聚合 MT（第二 MT 聚合）。
      1. 通过在 70，000 x g和 4 °C 下离心 30 分钟来澄清溶液。
      2. 收集并混合上清液，其体积等于37°C甘油和HMPB。
      3. 在混合物中加入 1.5 mM ATP 和 0.5 mM GTP。
      4. 在37°C下孵育混合物30分钟。
   6. 重复步骤1.1.4，用布林克利重装缓冲液（BRB）80（80 mM PPIPES，1 mM MgCl_2，1mM EGTA，pH 6.8）替换HMPB，然后通过在79，000 x g和4°C处离心30分钟澄清清除的混合物。
   7. 收集上清液。使用光谱仪测量 280 nm 的吸光度。使用啤酒-兰伯特定律确定图布林浓度（图布林的灭绝系数:1.15 （mg/mL）^-1厘米^-1）^37，38。
   8. 将蛋白质储存在-80°C。
2. 回收土布林（从Castoldi^等人36修改）。
   注:为了提高图布林的纯度，纯化的图布林再次聚合和去聚合。
   1. 通过将纯化的图布林（步骤1.1.7）与500μM二硫硫醇（DTT）和20μM GTP混合，然后30分钟在37°C下孵育，从而聚合MT。
   2. 粒点的 MT。
      1. 在离心管底部装载 1 mL 的甘油缓冲（80 mM PIPES，1 mM MgCl_2，1mM EGTA，60% v/v 甘油，pH 6.8）。
      2. 将聚合的 MT 放在垫子顶部。
      3. 在37°C下以172，000 x g离心90分钟。
   3. 去聚合的MTs。
      1. 拆下上清液和垫子。
      2. 将每 MT 颗粒重新悬浮在 150 μL 的 4 °C MT 缓冲液中（M2B: 80 mM PIPES，2 mM MgCl₂， 1 mM EGTA， pH 6.8）。
      3. 在冰上孵育混合物30分钟。
      4. 每 5 分钟用移液器吸头搅拌混合物。混合物应变清楚。
   4. 在172，000 x g和4°C处离心30分钟，通过离心来澄清混合物。
   5. 收集上清液。测量蛋白质浓度。储存在-80°C。
3. 用荧光^染料39标记图布林。
   1. 聚合性MT.将纯化的图布林（步骤1.1.7）与500μM DTT和16.7μM GTP混合，并在37°C下孵育混合物30分钟。
   2. 粒点的 MT。
      1. 将 1 mL 的 37 °C 高 pH 垫（0.1 M NaHEPES，1 mM MgCl_2，1 mM EGTA， 60% v/v 甘油， pH 8.6） 放入离心管中。
      2. 将聚合的 MT 放在垫子上。
      3. 在37°C下以327，000 x g离心50分钟。
   3. 标签图布林。
      1. 用 700 μL 的 37 °C 标记缓冲液（0.1 M NaHEPES，1 mM MgCl_2，1 mM EGTA， 40% v/v 甘油， pH 8.6） 重新悬浮每个 MT 颗粒。
      2. 将悬浮液与10~20摩尔过量的远红荧光染料混合，与苏奇尼米酯混合。
      3. 在黑暗中在37°C下孵育混合物30分钟，使MT与荧光染料的酯反应。
      4. 用50mM K-谷氨酸饱和悬浮染料的酯，在37°C下孵育5分钟，从而停止标记反应。
   4. 标记的 MT:重复步骤 1.3.2，用低 pH 垫（80 mM 管道、2 mM MgCl_2、1mM EGTA、60% v/v 甘油、pH 6.8）替换高 pH 垫。
   5. 去聚合的MT。
      1. 丢弃上清液和垫子。
      2. 在 4 °C M2B 的 700 μL 中重新悬浮颗粒。
      3. 在冰上孵育悬浮液。
      4. 每 5 分钟用移液器吸头搅拌一次，直到溶液清晰。
   6. 通过在 184，000 x g和 4 °C 下离心 35 分钟，阐明清除溶液。
   7. 通过重复步骤 1.2.1~1.2.4 提高标记的 Tubulin 溶液的纯度。
   8. 测量蛋白质和荧光染料的浓度。使用这些测量来确定塔布林浓度和标记的图布林的馏分，定义为荧光染料与图布林的浓度之比。
   9. 将标记的土布林溶液储存在-80°C。
4. 聚合的MTs（从桑切斯^等人19采用）:
   1. 将回收的图布林（步骤 1.2.5）与标记的图布林（步骤 1.3.9）混合，其比例可产生 3% 标记的图布林分数。
   2. 将8mg/mL图布林混合物与1 mM DTT和0.6 mM瓜诺辛-5'（β，α）-甲基三磷酸（GMPCPP）混合，随后在37°C下孵育30分钟。
   3. 孵育后，在黑暗中将MT在室温下退火6小时。
   4. 在-80°C下，以-80°C的分量和储存。

2. 合成运动体簇

注:细菌无处不在，可以在介质中生长并污染制备过程。为了防止污染，必须在火焰附近执行与细胞培养物接触（例如移液）的操作。使用前必须对烧瓶、移液器、移液器尖端、介质和板等工具进行高压灭菌。

1. 快速激酶电机在^{大肠杆菌40。}
   1. 转换单元格。
      1. 将K401-BCCP-H6质粒的移液器1μL放入10μL的合格细胞中。
      2. 在冰上孵育5分钟。
      3. 42.5 °C 的热休克，45 s。
      4. 在冰上孵育细胞2分钟，以便恢复。
      5. 将细胞与300 μL的无抗生素2XYT（5克/L NaCl，10克/L酵母提取物，16克/L胰腺酮）混合。
      6. 在37°C孵育细胞1小时。
         注:除非指定，否则在孵育期间不需要监测细胞生长。
   2. 接种板介质。
      1. 在 2XYT 板上传播细胞培养物（10 g/L NaCl，5 g/L 酵母提取物，10 g/L 胰腺酮，15 g/L 琼脂，100 μg/mL 阿霉素，25微克/mL氯霉素）。
      2. 在37°C过夜时倒置孵育板。
   3. 接种液体介质。
      1. 从隔夜的盘子里，用移液器尖收获一个孤立的菌群。
      2. 将尖端喷射到装有 50 mL 2XYT 的烧瓶中。
      3. 在 37°C 和 200 rpm 下孵育和摇动培养基，12~16 小时。
   4. 展开单元格。
      1. 在 500 mL 的 2XYT 中混合 2.5 mL 的细胞培养。
      2. 在 37°C 和 250 rpm 下孵育和摇动 500 mL 培养基，3~6 小时。
   5. 诱导蛋白质表达。
      1. 在孵育过程中，使用2XYT作为参考，在600nm处测量吸收率，以监测细胞生长。每 60 分钟测量一次吸光度，直到达到 OD₆₀₀ = 0.3。然后每 30 分钟测量一次吸光度，直到达到 0.5~0.6。
      2. 允许细胞生长，直到吸收率达到 OD₆₀₀ = 0.5±0.6
      3. 在细胞培养中加入24微克/mL生物素和1 mM等丙基β-D-1-硫丙酮（IPTG）。
         注:IPTG用于诱导运动蛋白的表达，其标记为生物蛋白卡贝基载体蛋白（BCCP）和六种分子（H6）。H6 标记用于纯化过程（步骤 2.2），而 BCCP 与添加的生物素分子结合，对表达的激酶电机进行生物素化。
      4. 在20°C和250rpm下孵育和摇动细胞培养，12~20小时。
   6. 在5000 x g和4°C下离心10分钟，收获细胞。丢弃上清液。将细胞颗粒储存在-80°C。
2. 纯化激酶运动蛋白（从斯普里斯特巴赫等人改^性:
   1. 使用相同体积的莱沙缓冲液（50 mM PIPES， 4 mM MgCl₂， 50 μM ATP， 10 mM 2-甲基苯丙胺 （βME）， 20 mM imidazole， pH 7.2）， 然后加入一片蛋白酶抑制剂， 2毫克苯基甲基磺酸氟化物 （PMSF）， 和 2 毫克溶酶.
   2. 通过在液氮（LN）中闪冻结3倍并解冻细胞混合物来使细胞变亮。
      注:乳化后，混合物应变得粘稠。
   3. 在230，000 x g和4°C处离心30分钟，通过离心来澄清裂化细胞混合物。
   4. 收集上清液并将其流过重力柱，然后用 10 mL 的液化缓冲液清洗该柱。
      注:带有 H6 标记的蛋白质（如激酶 K401-BCCP-H6）应保留在列中。
   5. 用5 mL洗脱缓冲液（50 mM PIPES，4 mM MgCl_2，50μM ATP，500 mM imidazole，pH 7.2）对标记的蛋白质进行脱脂。以 1 mL 分数顺序收集流。要确定含蛋白质的馏分，将每个馏分的3μL与100μL的三烯甲烷染料混合。含蛋白质的分数应该变成蓝色。将这些分数合并，与莱沙缓冲液稀释5倍。
   6. 浓缩蛋白质溶液。
      1. 将溶液装入离心滤管中。
      2. 在 3，000 x g下在 4°C 下离心 10 分钟。
      3. 轻轻摇动管，然后再次离心，直到溶液体积为 <3 mL。
   7. 使用光谱仪测量蛋白质浓度（消光系数:0.549 （mg/mL）^-1cm^-1）^42，43。将蛋白质稀释至1mg/mL，同时加入35%的蔗糖。
   8. 储存在-80°C。
3. 用电泳凝胶测量激酶浓度（从泰勒^等人44中修饰）。
   注:为了用电泳凝胶测量激酶浓度，图布林是一种理想的浓度阶梯，因为它纯度高，并通过光谱仪（图2A）36可测量的浓度。
   1. 制备浓度为0.25、0.5、0.75、1.00和1.25毫克/升/mL的图布林样品。将每个图布林样品和激酶样品（步骤2.2.8）的15μL分别与5μL样品缓冲液（200 mM Tris-HCl，8%硫酸钠（SDS）、400 mM DTT、0.2%溴酚蓝、40%甘油、pHH 6.8）混合，并在90°C孵育3分钟。
   2. 准备电泳。
      1. 将电泳凝胶锁入凝胶盒中。
      2. 在箱内填充运行缓冲液（50 mM MOPS、50 mM Tris 底座、0.1% SDS、1 mM 乙烯二甲酸乙酸 （EDTA）、pH 7.7）。
         注:确保缓冲液水平高于凝胶的顶部开口。
   3. 将10μL的蛋白质标准梯、图布林样品和激酶样品加载到单独的井中，在凝胶中涂抹200 V45分钟。
   4. 凝胶染色。
      1. 用煮沸（约95°C）染色溶液A（0.5克/升三烯甲烷染料，10%v/v醋酸，25%异丙醇）孵育和摇动凝胶5分钟，然后用去离子（DI）水冲洗凝胶。
      2. 重复染色溶液B（0.05 g/L三苯甲酸，10%v/v醋酸，10%异丙醇），C（0.02克/升三烯甲烷染料，10%v/v醋酸）和D（10%v/v醋酸），顺序顺序。孵育和摇动凝胶在DI水中过夜。
   5. 扫描凝胶。将凝胶图像转换为灰度图像，然后进行黑白反转和对比度增强，以显示黑色背景中的明亮蛋白质带。
   6. 通过对像素值求和来测量每个波段的亮度。应用线性拟合C = aB = b，其中B是图布林带的亮度，C是相应的浓度，a和b是拟合参数。使用激酶带B_k的亮度计算线性方程:C_k = aB_k = b，确定激酶C_k的浓度。
4. 聚组运动位。
   1. 将 1.5 μM 激酶（步骤 2.2.8）与 120 μM DTT 和 120 nM 链球菌。在冰上孵育30分钟。
   2. 储存在-80°C。

3. 制备聚丙烯酰胺涂层玻璃玻片和盖玻片（从Lau等人修改^为45）

1. 将新的玻璃玻片和玻璃盖玻片装入相应的容器中。在 DI 水中将幻灯片和盖玻片浸入 1% v/v 洗涤剂中，然后在微波炉中煮沸。
2. 将幻灯片和盖玻片松口5分钟，然后用DI水冲洗以去除洗涤剂。
3. 在乙醇中浸入和声波滑片和盖玻片5分钟，用DI水冲洗。
4. 在 100 mM 氢氧化钾 （KOH） 中浸入并声波滑动和盖玻片 5 分钟，用 DI 水冲洗。
5. 在硅烷溶液中孵育滑片和盖玻片（1%醋酸和0.5%3-（三聚氧乙酰）丙酸丙烯酸丙烯酸酯，在乙醇中孵育15分钟，然后用DI水冲洗。
6. 在丙烯酰胺溶液中孵育幻灯片和盖玻片（2% w/w丙烯酰胺，0.7 mg/mL 二铵，DI 水中0.0035%v/v四甲基二甲二胺）的含量为±3小时。
7. 将幻灯片和盖玻片存储在丙烯酰胺溶液中。

4. 制备运动动酶驱动、基于MT的有源流体

1. 制备活性流体（从桑切斯^等人19号修改）。
   注:以下步骤演示了使用示例库存制备 100 μL 活性流体的过程。最终交易量是可扩展的，只要保持每个组件的最终浓度，就可以调整示例库存的浓度。
   1. 将 16.7 μL 的 8 mg/mL MT（步骤 1.4.4）与 6.7 μL 的 1.8 μM 激动素电机簇（步骤 2.4.2）和 1.1 μL 的 500 mM DTT 在高盐 M2B （M2B = 3.9 mM MgCl₂） 中混合。
   2. 通过添加 11.4 μL 的 7% 的 7% 不含聚乙烯乙二醇 （PEG） 来捆绑 MT。
   3. 通过添加 2.8 μL 的 50 mM ATP 来激活运动因子电机。
   4. 通过加入2.8 μL的血酸激酶/乳酸脱氢酶（PK/LDH）和13.3 μL的200 mM磷苯丙酸酯（PEP），维持ATP浓度。
   5. 通过添加 10 μL 的 20 mM Trolox、1.1 μL 3.5 mg/mL 催化酶、1.1 μL 20 mg/mL 葡萄糖氧化酶和 1.1 μL 300 mg/mL 葡萄糖，降低光漂白效果。
   6. 通过添加 1.6 μL 的 0.025% v/v 示踪颗粒来跟踪流体的运动。
   7. 加入高盐M2B，达到100μL的总体积。
      注: 步骤 4.1.1~4.1.6 中的混合顺序可互换。但是，一旦 ATP、MT 和电机混合，电机开始消耗 ATP，同时沿着 MT 步进。由于燃料有限（ATP 和 PEP），样品的激活寿命有限，因此应迅速启动实验。最终有源流体应含有1.3mg/mL MT，120 nM运动体运动簇， 5.5 mM DTT， 0.8% w/w PEG， 1.4 mM ATP， 2.8% v/v PK/LDH， 27 mM PEP， 2 mM Trolox， 0.038 mg/mL 催化酶， 0.22 mg/mL 葡萄糖氧化酶， 3.3 mg/mL 葡萄糖， 和 0.0004% v/v 在高盐 M2B 中。
2. 在流道中制备样品（从钱德拉卡尔^等人46中修改）:
   1. 用DI水冲洗聚丙烯酰胺涂层玻璃滑块和盖玻片（步骤3.7）。用加压空气擦干玻璃杯。放置在干净、平坦的表面上。
   2. 切割两条蜡膜，宽度为 3 mm，长度与玻璃盖玻片（20 mm）相同。将滑轨和盖玻片作为通道垫片插入。
   3. 将玻璃蜡复合物放在 80°C 热板上以熔化蜡，将玻璃粘附在蜡膜上。在熔炼过程中，用移液器尖端轻轻按压盖玻片，将蜡膜均匀地粘附在玻璃表面。粘附后，将玻璃复合物冷却至室温。
   4. 将有源流体（步骤 4.1）加载到流道。用紫外线胶水密封通道。

5. 控制样品温度

1. 建立一个温度控制设置（从Lowensohn等人和Wu^{等人47、48、49}等设计中修改）。
   1. 准备铝制冷却块。
      1. 铣削尺寸约为 30 mm × 30 mm × 5 mm 的铝板。
      2. 钻穿板的内部通道（图3A），并在通道端安装软管接头。
      3. 将每个配件钩到水管上。
      4. 将一根管连接到水箱中的鱼缸泵，同时将另一根管延伸到储水箱。
         注:泵将通过铝内部通道循环储液罐水，使缸体温度保持在大约室温。
   2. 将热电冷却器 （TEC） 和热传感器连接到温度控制器。使用 USB 端口将控制器连接到计算机 （图 3B）。
   3. 将温度控制器连接到直流 （DC） 电源。将电源插入电源插座，打开控制器。
   4. 按照控制器制造商指南执行 TEC 的初始设置。测试 TEC 输出。建议通过制造商提供的软件控制温度控制器，允许热传感器数据记录和更容易操作温度控制器。
   5. 确定 TEC 的加热和冷却侧。
   6. 使用热浆将 TEC 的冷却侧连接到冷却块（步骤 5.1.1）。
   7. 使用热膏将蓝宝石圆盘连接到 TEC 的加热侧。
   8. 设置已完成。蓝宝石表面和热传感器可以接触样品，根据样品的温度和目标温度对样品进行冷却和加热。
      注:建议 TEC 和冷却模块具有对齐的中心孔，用于使用明热场显微镜对样品进行成像（图 3C）。
2. 使用温度控制设置控制样品^温度33。
   1. 将示例装载到设置中。
      1. 将活性流体样品（步骤 4.2.4）放在蓝宝石表面，滑动侧与表面接触。
      2. 用纸带固定玻璃滑块。
      3. 使用铜胶带将热传感器连接到盖玻片表面。
   2. 将设置安装在显微镜台上，盖玻片侧朝向目标。例如，在倒置显微镜上，盖玻片侧应朝下。使用纸带和显微镜级针夹（如果适用）固定设置。
      注:呈现的温度级应与倒置或直立的普通显微镜配合使用。为确保在实验期间温度级不移动，最好用胶带将温度级固定到显微镜级。
   3. 控制样品温度。
      1. 打开温度控制器和鱼缸泵。
      2. 按照制造商指南设置目标温度并启用温度控制。控制器将根据目标温度和样品温度调整加热或冷却功率，由热传感器进行评估。
   4. 记录样品温度。
      1. 在实验期间，请按照制造商指南记录热传感器温度数据。
         注:样品温度现在应由控制器控制并由计算机记录（图3D）。

6. 描述活性流体活性（根据Henkin等人和Wu^{等人20、27}的方法修改）

注:前几节用于制备活性流体样品（第 1-4 节）并控制其温度（第 5 节）。演示使用温度来控制活性流体活动，观察流体行为，分析其活动，并描述其对温度的反应。

1. 监视跟踪器。
   1. 使用绿色荧光蛋白 （GFP） 荧光以捕获示踪粒子的运动，使用恒定间隔 μt对样品进行成像。
      注: 应选择μt以允许跟踪器移动。大 μt值（如 100 s）会导致跟踪轨迹丢失，而短 μt值（如 0.1 s）会阻止跟踪算法检测帧之间的跟踪器移动。工作 μt应允许帧之间的跟踪器位移在 ±9 像素内。对于使用 4 倍物镜以 10 μm/s 移动的成像示踪剂，建议 μt为 1⁄5 s。
   2. 将图像另存为 TIFF 文件，根据帧号命名文件，并将它们存储在单独的文件夹中。这些过程对于确保使用提供的 MATLAB 脚本（步骤 6.2.2）正确分析获取的图像是必要的。
2. 跟踪跟踪器采用由Ouellette等人开发的跟踪^{软件50，51}）:
   1. 从斯坦福大学环境复杂性实验室（https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml）下载跟踪软件。确保每个 MATLAB 文件都位于同一文件夹中。
   2. 使用自定义 MATLAB 脚本跟踪跟踪器:particle_tracking.该脚本读取跟踪图像（步骤6.1），并使用Ouellette^{等人50，51}的软件跟踪跟踪器运动。它输出两个文件:1）背景.tif，表示图像背景，和2）跟踪.mat，包含粒子轨迹和速度在每个帧（图4A）。
3. 使用自定义 MATLAB 脚本分析跟踪器的平均速度:分析.该脚本读取跟踪文件（Tracktrack.mat），并输出跟踪器与时间的平均速度，以及具有指定平均窗口的时间平均平均速度（图4B）³³。
4. 记录时间平均平均速度。
5. 在 10–40 °C 处重复实验（步骤 4、5.2 和 6.1-6.4），测量时间平均平均速度。使用记录的平均速度绘制平均速度与温度（图4C）³³。

结果

准备运动动酶驱动的基于MT的有源流体需要运动因子和MT。MC 从标记的 tubulin（步骤 1.3 和 1.4）中聚合，这些牛脑被纯化（步骤 1.1，图 2A），然后回收以提高纯度（步骤 1.2，图 2B）。激酶运动蛋白在大肠杆菌中表达和纯化（步骤2.1和2.2，图2B）41，52。 通过比较主带亮度与已知浓度的再生图布林的亮度（步骤2.3，图2B内窥，用SDS凝胶测量制备的激酶的浓度）。图布林带（B） 的亮度值线性适合其相应的浓度 （C）， 使用方程C<...

讨论

就地控制活性物质为主动物质4、5、24、28、54的定向自组织打开了大门。在本文中，我们提出了一个协议，使用温度来控制运动因子驱动的，基于MT的有源流体的原位，基于系统的Arrhenius特性29，30，31。由于该系统基于蛋白质，因此在整个实验中保持蛋白质功能是成功应用该协议的关键。系统中的主要蛋白质是MT和激酶簇。前者在16°C以下脱聚，后者故障在36°C^以上33。因此，保持系统温度在16~36°C之间对于有源流体发展稳定动力学和使其对温度的可逆反应至关重要（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
（±）-6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸	Sigma-Aldrich	238813	Trolox
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M6250
3-（三甲氧基甲硅烷基）甲基丙烯酸丙酯，98%，ACROS Organics	Fisher Scientific	AC216550050
3.2 mm 内径 Tygon 管 R-3603	HACH	2074038	水管
直径 31.75 mm，无涂层，蓝宝石窗口	Edmund Optics	43-637	蓝宝石盘
3M 1181 铜带 - 1/2 英寸 宽 X 18 码 长度 - 2.6 MIL 总厚度 - 27551	R.S. HUGHES	054007-27551	铜带
醋酸	Sigma-Aldrich	A6283
丙烯酰胺溶液（40%/电泳），Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1402-1
腺苷 5'-三磷酸二钾盐水合	Sigma-Aldrich	A8937	ATP
Alexa Fluor 647 NHS 酯（琥珀酰亚胺酯）	Thermo Fisher Scientific	A20006	远红外荧光染料。Alexa 647 在与微管 （1.3.3.2） 混合之前，可以预悬浮在二甲基亚砜 （DMSO） 中。
Amicon Ultra-4 离心过滤装置	Sigma-Aldrich	UFC801024	离心过滤管。截留分子量：10 kDa
过硫酸铵，100 g，MP Biomedicals	Fisher Scientific	ICN802829	APS
氨苄青霉素钠盐（结晶粉末），Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1760	氨苄青霉素
防振台	Nikon	63-7590S
Avanti J-E 离心机	Beckman Coulter	369001
Bacto 琼脂 销售剂， BD Diagnostics	VWR	90000-760	琼脂
生物素	Alfa Aesar	A14207
桶 - 塑料白色 - 2 加仑	Bon	84-715	水桶
氯化钙	Sigma-Aldrich	746495	CaCl2
牛肝过氧化氢酶	Sigma-Aldrich	C40
CFI Plan Apo Lambda 4x Obj	尼康	MRD00045	4x 空气物镜
C-FLLL-FOV GFP HC HS HISN ero Shift	尼康	96372	GFP 滤光片立方体
CH-109-1.4-1.5	TE 技术	CH-109-1.4-1.5	热电冷却器 （TEC）
氯霉素，98%，ACROS Organics	Fisher Scientific	C0378
冷却块	N/A	N/A	定制铣削铝
考马斯亮蓝 R-250 #1610400	Bio-Rad	1610400	三苯甲烷染料
D-（+）-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G7528
二甲基亚砜（ACS 认证），Fisher 化学	Fisher Scientific	D128	DMSO
DL-1,4-二硫苏糖醇，99%，用于生物化学，ACROS Organics	Fisher Scientific	AC165680050	DTT
DOWSIL 340 散热器化合物	Dow	1446622	导热膏
乙醇，200 PROOF： ACS/USP/NF 5 加仑聚立方体	Pharmco by Greenfield Global	111000200CB05	乙醇
乙二醇-双（2-氨基乙基醚）-N，N，N'，N'-四乙酸	Sigma-Aldrich	E3889	EGTA
乙二胺四乙酸	Sigma-Aldrich	798681	EDTA
Fisher BioReagents 微生物学培养基添加剂：胰蛋白胨	Fisher Scientific	BP1421	胰蛋白胨
Fisher BioReagents 微生物学培养基添加剂：酵母提取物	Fisher Scientific	BP1422	酵母提取物
荧光灯 YG 微球，校准级 3.00 和微量;m	Polysciences	18861	示踪颗粒
来自黑曲霉的葡萄糖氧化酶	Sigma-Aldrich	G2133
甘油	Sigma-Aldrich	G5516
GpCpp	Jena Bioscience	NU-405L	鸟苷-5'[（α，β）-甲基苯]三磷酸盐 （GMPCPP）
GS Power 的 18 号规格（真正的美国线 Ga），100 英尺，99.9% 绞合无氧铜 OFC，红/黑 2 导体粘合拉链线 汽车、音响、家庭影院用电源/扬声器电缆	亚马逊	B07428NBCW	铜线
鸟苷 5'-三磷酸钠盐水合物	Sigma-Aldrich	G8877	GTP
Hellmanex III	Sigma-Aldrich	Z805939	洗涤剂
HEPES 钠盐（白色粉末），Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP410	NaHEPES
高性能搅拌机	AIMORES	AS-UP1250	搅拌机
His GraviTrap	GE Healthcare	11003399	重力塔
咪唑	Sigma-Aldrich	I5513
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758	异丙基 &β;-D-1-硫代吡喃半乳糖苷
异丙醇 99%	Pharmco by Greenfield Global	231000099	异丙醇
JA-10 转子	贝克曼库尔特	369687
L-谷氨酸 钾盐一水合物	Sigma-Aldrich	G1501	K-谷氨酸
溶菌酶 来自鸡蛋清	Sigma-Aldrich	L6876
氯化镁六水合	Sigma-Aldrich	M2670	MgCl2•6H2O
MES 钠盐	Sigma-Aldrich	M5057	2-（N-吗啉代）乙磺酸钠盐
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254	3-（N-吗啉代）丙磺酸
MP-3022	TE 技术	MP-3022	热电偶
N，N，N'，N'-四甲基乙二胺 99%， ACROS Organics	Fisher Scientific	AC138450500	TEMED
Nanodrop 2000c 紫外可见分光光度计	Thermo Fisher Scientific	E112352	光谱仪
尼康 Ti2-E 尼康倒置显微镜	尼康	MEA54000
Norland 光学胶粘剂 81	Norland 产品	NOA81	UV 胶
Novex Sharp 预染蛋白质标准品	Thermo Fisher Scientific	LC5800	蛋白质标准品分子量标准
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 蛋白凝胶，1.5 mm，10 孔	Thermo Fisher Scientific	NP0335BOX	SDS 凝胶
Optima L-90K 超速离心机	Beckman Coulter	365672
Parafilm PM996 包装，4 英寸宽;125 英尺/卷	Cole-Parmer	EW-06720-40	蜡膜
Pe 300 超照明系统 单波段，3 毫米光导控制 Pod 电源	尼康	PE-300-UT-L-SB-40	冷 LED 照明器
苯基甲磺酰氟	Sigma-Aldrich	78830	PMSF
磷酸烯醇丙酮酸单钾盐，99%	BeanTown 化学	129745	PEP
Pierce 考马斯（布拉德福德）蛋白质检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	23200
Pierce 蛋白酶抑制剂迷你片剂	Thermo Fisher Scientific	A32953
管道	Sigma-Aldrich	P6757	1,4-哌嗪二烷磺酸
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
聚乙二醇	Sigma-Aldrich	81300	PEG.平均分子量 20,000 Da
氢氧化钾（颗粒/ACS 认证），Fisher Chemical	Fisher Scientific	P250-500
KOH PowerEase 300W 电源 （115 VAC）	ThermoFisher Scientific	PS0300	凝胶盒直流电源
PS-12-8.4A	TE Technology	PS-12-8.4A	温度控制器
直流电源来自兔子肌肉的丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶	Sigma-Aldrich	P-0294	PK/LDH
Quiet One Lifegard 喷泉泵，每小时 296 加仑	Amazon	B005JWA612	鱼缸泵
Rosetta 2（DE3）pLysS 感受态细胞 - Novagen	Millipore Sigma	71403	感受态细胞
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W 台面微波炉，0.9 立方英尺，不锈钢	Amazon	B01MT6JZMR	用于煮水的微波炉
氯化钠（结晶/认证 ACS），Fisher Chemical，Fisher Scientific		S271-500	NaCl
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich	L3771	SDS
磷酸二氢钠	Sigma-Aldrich	S8282	NaH2PO4
链霉亲和素蛋白	Thermo Fisher Scientific	21122
蔗糖	Sigma-Aldrich	S7903
TC-720	TE 技术	TC-720	温度控制器
Tris 碱，分子生物学级 - CAS 77-86-1 - Calbiochem	Sigma-Aldrich	648310	Tris-HCL
45 型 Ti 转子	贝克曼库尔特	339160
70 型 Ti 转子	贝克曼库尔特
型 70.1 Ti 转子	贝克曼库尔特	342184
VWR 通用实验室标签胶带	VWR	89097-916	纸胶带
VWR 微型盖玻片，方形，1 1/2 号	VWR	48366-227	玻璃盖玻片
VWR 普通和磨砂微型载玻片，高级	VWR	75799-268	载玻片
XCell SureLockMini-Cell	ThermoFisher Scientific	EI0001	凝胶盒
ZYLA 5.5 USB3.0 相机	尼康	ZYLA5.5-USB3	单色 CCD 相机