使用酵母毒性和抑制器屏幕识别细菌效应蛋白的宿主通路

Summary

细菌病原体将蛋白质分泌到宿主中，以关键生物过程为目标。识别细菌效应蛋白所针对的宿主通路是解决分子发病机制的关键。这里，描述了一种使用改性酵母抑制剂和毒性筛分的方法，以阐明有毒细菌效应蛋白所针对的宿主通路。

Abstract

细胞内细菌将称为效应蛋白的毒性因子分泌到宿主细胞醇中，这些细胞醇的作用是破坏宿主蛋白和/或其相关的生物途径，以利于细菌。由于细菌基因组测序的进步和算法的出现，使得假定细菌效应蛋白的识别变得更加易于管理，这些算法允许在硅素识别编码分泌候选项和/或真核生物的基因方面进行编码域。然而，确定这些重要的毒力因素只是第一步。自然地，目标是确定效应蛋白的分子功能，并阐明它们如何与宿主相互作用。近年来，酵母双杂交筛和大规模免疫沉淀技术以及质谱仪等技术有助于识别蛋白质-蛋白质相互作用。虽然识别宿主结合性伴侣是阐明细菌效应蛋白的分子功能的关键的第一步，但有时宿主蛋白具有多种生物功能（例如，活性素、克拉辛、土布林），或细菌蛋白可能不会物理结合宿主蛋白，使研究人员失去有关纵的精确宿主通路的关键信息。经过修饰的酵母毒性筛与抑制器屏幕相结合，已调整，以识别受细菌效应蛋白影响的宿主通路。毒性屏幕依赖于由效应蛋白干扰宿主生物通路引起的酵母中的毒性效应，这通常表现为生长缺陷。酵母基因组库的表达用于识别抑制细菌效应蛋白毒性的宿主因子，从而识别效应蛋白靶向通路中的蛋白质。该协议包含毒性和抑制器屏幕的详细说明。这些技术可以在任何能够进行分子克隆和培养酵母和大肠杆菌的实验室中进行。

Introduction

第一次报告的程序类似于这里提出的那些特点军团菌肺炎嗜血杆菌类型IV效应器SidD，一个deAMPylase，修改Rab1^1。比较技术用于表征几个L.肺炎球菌效应器1，2，3。该测定被调整为Coxiella burnetii型IV效应^蛋白4，最近该技术的效用被扩展为衣原体沙眼结合膜蛋白^的表征5.

该协议可以分为两个主要部分:1）酵母毒性筛，其中感兴趣的细菌效应蛋白在酵母中表达，克隆被筛选为由生长缺陷证明的有毒表型，2）酵母抑制器屏幕，其中毒性表型被毒菌株中的酵母基因组库表达所抑制。因此，毒性屏幕是有毒表型的屏幕，当感兴趣的细菌效应者过度表达时，这些表型表现为生长缺陷。有毒克隆，成功地转换和表达细菌效应器，选择并保存下一步。第二个主要步骤涉及在有毒酵母克隆中过度表达部分消化的酵母基因组库。在该协议中建议使用酵母基因组库的质粒携带5-20 kb的插入物，通常对应于所有质粒平均基因大小为±1.5 kb的3~13个酵母开放阅读框架（ORF），代表覆盖的整个酵母基因组大约10倍。这部分的测定....

Protocol

1. 培养剂和试剂的制备

注:板材应在测定日之前准备，并好1个月。介质和试剂可随时制成，适合1个月。

1. 通过在 1000 mL 烧杯中溶解 800 mL 蒸馏水中的 100 g D-（+）-葡萄糖，制备 1 L 葡萄糖溶液（10% w/v）。用蒸馏水将音量调节到 1 L。通过 0.2 μm 无菌过滤器过滤到无菌 1 L 介质存储瓶中。
2. 在 1 L 烧杯中溶解 100 g D-（+）- 蒸馏水中的 100 g D-（+）- 甘蔗素，制备 1 L 的甘蔗溶液（10% w/v）。使用蒸馏水将体积调节到 1 mL，并通过 0.2 μm 无菌过滤器过滤到无菌的 1，000 mL 介质储存瓶中。
3. 在1000mL蒸馏水中溶解10克酵母提取物、20克肽、20克葡萄糖和20克琼脂，制备1L酵母提取物肽（YPD）琼脂糖。高压灭菌20分钟，在56°C水浴中冷却，直到冷却。使用每板 20 mL 的介质倒入 100 mm 板。
4. 在1000 mL蒸馏水中溶解10克酵母提取物、20克肽和20克葡萄糖，制备1L的YPD汤。高压灭菌20分钟。
5. 准备合成脱液 （SD） 尿素 （ Ura^-） 葡萄糖琼脂.对于1L，溶解6.7克不含氨基酸的酵母氮碱，1.9克无尿素的脱脂补充剂，以及15克的琼脂蒸馏水。高压灭菌20分钟，在56°C水浴中冷却，直到温度为+50~60°C。使用 50 ....

Results

在实际的酵母抑制器屏幕可以执行之前，必须测试感兴趣的效应蛋白在酵母中的毒性。这是通过在一个可诱导诱导剂的控制下表达对酵母感兴趣的蛋白质来实现的。葡萄糖的生长（非诱导条件）应首先进行比较，以确保毒性是特别由于感兴趣的蛋白质的表达，而不是一般的缺陷。如图3所示，毒性表现为较小的菌落和/或生长减少。酵母生长减少2⁄3对数是酵母抑制器屏幕的理想选择。

如图4所示，使用协议部分中描述的方法，毒性和抑制器屏幕可以分八个步骤完成。感兴趣的基因被克隆成合适的^载体1，所得的构造被转化为酵母来评估毒性。本研究以CT229作为感兴趣的基因，以pYesNTA-Kan为载体。此外，西印印证实了他标记的融合蛋白的表达。理想情况下，应观察到在含乳酸酶培养的酵母中减少2⁄3对数。如果感兴趣的蛋白质对酵母有毒（图3和图4），抑制器屏.......

Discussion

该协议概述了使用改性酵母毒性和抑制器屏幕识别细菌效应蛋白靶向宿主生物通路的分步程序。使用的酵母菌株，S.cerevisiae W303，是辅助营养的尿素和亮氨酸。该菌株的Uracil辅助营养器用于选择含有pYesNTA-Kan载体上感兴趣的蛋白质的酵母，而亮氨酸辅助营养器用于选择酵母基因组库载体pYep13。酵母基因组库质粒携带3~13个ORF，因此每个ORF应单独克隆到p415-ADH^载体6或类似载体中，并重新转化为有毒酵母，以识别谁是真正的抑制者。它是典型的识别代表宿主生物通路的几个抑制器。抑制剂有时可以是感兴趣的细菌蛋白的直接结合伙伴，但并非总是如此。

生产含有pYesNTA-Kan上感兴趣的细菌蛋白的酵母克隆是第一步，应尽快非常小心，以保持这些克隆的完整性，因为携带毒性的酵母有很强的负选择蛋白质，即使没有故意的锥形诱导，它们可能会失去质粒。偶尔有质粒损失，即使酵母在辍学介质的选择下保持。以前曾报道过一种方法，通过线性化载体并将其整合到酵母^基因组1中，来减少质粒损.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
琼脂	Fisher Scientific	BP2641500
半乳	MilliporeSigma	G0750-1KG
GeneJet 凝胶提取试剂盒	ThermoFisher Scientific	K0691
GeneJet PCR 纯化试剂盒	ThermoFisher Scientific	K0701
GeneJet 质粒小量制备试剂盒	Thermo	K0503
葡萄糖	MilliporeSigma	G8270-1KG
鲱鱼精子 DNA	Promega	D1811
KpnI-HF	New England Biolabs	R3142S
醋酸锂二水合	MilliporeSigma	L6883-250G
蛋白胨	Fisher Scientific
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	New England Biolabs	M0530
聚乙二醇 3350	MilliporeSigma	1546547-1G
pYep13	ATCC	37323
T4 DNA 连接酶	New England Biolabs	M0202S
色氨酸	MilliporeSigma	470031-1G
XhoI-HF	New England Biolabs	R0146S
酵母提取物	Fisher科学	BP1422-500
酵母小量制备试剂盒	Zymo	D2001
不含氨基酸的酵母氮碱	MilliporeSigma	Y0626-250G
酵母合成辍学培养基补充剂	MilliporeSigma	Y1501-20G	不含尿嘧啶
合成辍学培养基补充剂	MilliporeSigma	Y1771-20G	不含尿嘧啶、亮氨酸、色氨酸