使用酵母毒性和抑制器屏幕识别细菌效应蛋白的宿主通路

Summary

细菌病原体将蛋白质分泌到宿主中，以关键生物过程为目标。识别细菌效应蛋白所针对的宿主通路是解决分子发病机制的关键。这里，描述了一种使用改性酵母抑制剂和毒性筛分的方法，以阐明有毒细菌效应蛋白所针对的宿主通路。

Abstract

细胞内细菌将称为效应蛋白的毒性因子分泌到宿主细胞醇中，这些细胞醇的作用是破坏宿主蛋白和/或其相关的生物途径，以利于细菌。由于细菌基因组测序的进步和算法的出现，使得假定细菌效应蛋白的识别变得更加易于管理，这些算法允许在硅素识别编码分泌候选项和/或真核生物的基因方面进行编码域。然而，确定这些重要的毒力因素只是第一步。自然地，目标是确定效应蛋白的分子功能，并阐明它们如何与宿主相互作用。近年来，酵母双杂交筛和大规模免疫沉淀技术以及质谱仪等技术有助于识别蛋白质-蛋白质相互作用。虽然识别宿主结合性伴侣是阐明细菌效应蛋白的分子功能的关键的第一步，但有时宿主蛋白具有多种生物功能（例如，活性素、克拉辛、土布林），或细菌蛋白可能不会物理结合宿主蛋白，使研究人员失去有关纵的精确宿主通路的关键信息。经过修饰的酵母毒性筛与抑制器屏幕相结合，已调整，以识别受细菌效应蛋白影响的宿主通路。毒性屏幕依赖于由效应蛋白干扰宿主生物通路引起的酵母中的毒性效应，这通常表现为生长缺陷。酵母基因组库的表达用于识别抑制细菌效应蛋白毒性的宿主因子，从而识别效应蛋白靶向通路中的蛋白质。该协议包含毒性和抑制器屏幕的详细说明。这些技术可以在任何能够进行分子克隆和培养酵母和大肠杆菌的实验室中进行。

Introduction

第一次报告的程序类似于这里提出的那些特点军团菌肺炎嗜血杆菌类型IV效应器SidD，一个deAMPylase，修改Rab1^1。比较技术用于表征几个L.肺炎球菌效应器1，2，3。该测定被调整为Coxiella burnetii型IV效应^蛋白4，最近该技术的效用被扩展为衣原体沙眼结合膜蛋白^的表征5.

该协议可以分为两个主要部分:1）酵母毒性筛，其中感兴趣的细菌效应蛋白在酵母中表达，克隆被筛选为由生长缺陷证明的有毒表型，2）酵母抑制器屏幕，其中毒性表型被毒菌株中的酵母基因组库表达所抑制。因此，毒性屏幕是有毒表型的屏幕，当感兴趣的细菌效应者过度表达时，这些表型表现为生长缺陷。有毒克隆，成功地转换和表达细菌效应器，选择并保存下一步。第二个主要步骤涉及在有毒酵母克隆中过度表达部分消化的酵母基因组库。在该协议中建议使用酵母基因组库的质粒携带5-20 kb的插入物，通常对应于所有质粒平均基因大小为±1.5 kb的3~13个酵母开放阅读框架（ORF），代表覆盖的整个酵母基因组大约10倍。这部分的测定称为抑制器屏幕，因为目标是抑制细菌效应蛋白的毒性。电势抑制质粒从酵母中分离出来，测序，并识别抑制性ORF。抑制器屏幕的基本原理是，效应蛋白与其目标的宿主通路结合、相互作用和/或压倒其目标，而过量地将这些宿主蛋白提供回可挽救该通路的毒性效应，从而，生长缺陷。因此，抑制毒性的确定ORF通常代表宿主通路的多个参与者。然后进行正交实验，以验证细菌效应器确实与牵连通路相互作用。如果已识别出克扯林或肌蛋白等结合性伙伴，这一点尤为必要，因为这些蛋白质涉及多种宿主过程。进一步的实验可以阐明感染过程中效应蛋白的生理功能。毒性和抑制器屏幕也是破译细菌效应蛋白的生理功能的有力工具，这些蛋白质在物理上不会将宿主蛋白与亲和力结合，其亲和力足以通过免疫沉淀检测或与在酶命中和运行交互中主机，这些交互可能不会被酵母-二混合屏幕检测到。

虽然抑制器屏幕可以是一种强大的方法来揭示细菌效应蛋白和宿主通路之间的潜在生理相互作用，但细菌效应蛋白必须诱导酵母中的生长缺陷，否则在抑制器屏幕将没有什么用。此外，有毒表型必须导致至少 2⁄3 log₁₀增长赤字，否则将难以识别抑制器。如果为细胞培养建立实验室，在HeLa等常见细胞系中筛选毒性效应蛋白通常可以洞察是否值得进行酵母毒性筛查。HeLa细胞中效应蛋白的异位表达有时导致毒性，与用于这些^屏幕4的酵母菌株的毒性密切相关。HeLa细胞中可观察到的应力特征包括应力纤维的丧失、细胞脱离板和指示凋亡的核凝结。HeLa细胞中任何压力的视觉指示都使得感兴趣的蛋白质成为诱导酵母生长缺陷的良好候选者，酵母的复制速度要快得多，从而对基本通路的扰动反应更灵敏。

应当指出，抑制器屏幕并不总是将宿主绑定伙伴标识为抑制器，但它仍然可能涉及目标宿主通路的关键组件，从而全面了解被细菌效应蛋白。从表面上看，这似乎是违反直觉的，因为提供过量的效应蛋白的结合伙伴有望挽救生长缺陷。在努力确定C.沙眼效应蛋白CT229（CpoS）所针对的途径时，在^感染5期间与至少10种不同的Rab GTPass结合，没有一个拉布结合伙伴抑制了CT229的毒性。然而，查明了参与克拉林涂层囊泡（CCV）贩运的许多抑制者，这导致进一步的工作表明，CT229特别颠覆了依赖Rab的CCV贩运。同样，在调查C.burnetii效应蛋白Cbu0041（CirA）时，发现了几种能挽救酵母生长缺陷的Rho GTPases，后来发现CirA^作为RhoA4的GTPase激活蛋白（GAP）的作用。

酵母抑制器屏幕对阐明细菌效应蛋白靶向宿主通路的效用怎么强调也不过分，其他试图描述细胞内细菌效应蛋白的研究人员可以从中获益这些技术。如果免疫沉淀和/或酵母-两个混合屏幕未能找到结合的伙伴，并且可以阐明细菌效应蛋白所针对的通路，这些检测是有价值的。在这里，提供了毒性和抑制器屏幕的详细方案，以识别细胞内细菌效应蛋白所针对的宿主生物通路，以及使用这些测定剂及其相应的解决方案。

Protocol

1. 培养剂和试剂的制备

注:板材应在测定日之前准备，并好1个月。介质和试剂可随时制成，适合1个月。

1. 通过在 1000 mL 烧杯中溶解 800 mL 蒸馏水中的 100 g D-（+）-葡萄糖，制备 1 L 葡萄糖溶液（10% w/v）。用蒸馏水将音量调节到 1 L。通过 0.2 μm 无菌过滤器过滤到无菌 1 L 介质存储瓶中。
2. 在 1 L 烧杯中溶解 100 g D-（+）- 蒸馏水中的 100 g D-（+）- 甘蔗素，制备 1 L 的甘蔗溶液（10% w/v）。使用蒸馏水将体积调节到 1 mL，并通过 0.2 μm 无菌过滤器过滤到无菌的 1，000 mL 介质储存瓶中。
3. 在1000mL蒸馏水中溶解10克酵母提取物、20克肽、20克葡萄糖和20克琼脂，制备1L酵母提取物肽（YPD）琼脂糖。高压灭菌20分钟，在56°C水浴中冷却，直到冷却。使用每板 20 mL 的介质倒入 100 mm 板。
4. 在1000 mL蒸馏水中溶解10克酵母提取物、20克肽和20克葡萄糖，制备1L的YPD汤。高压灭菌20分钟。
5. 准备合成脱液 （SD） 尿素 （ Ura^-） 葡萄糖琼脂.对于1L，溶解6.7克不含氨基酸的酵母氮碱，1.9克无尿素的脱脂补充剂，以及15克的琼脂蒸馏水。高压灭菌20分钟，在56°C水浴中冷却，直到温度为+50~60°C。使用 50 mL 血清学移液器或无菌分级圆柱体，添加步骤 1.1 中制备的 200 mL 葡萄糖溶液。轻轻旋转或放在搅拌板上，搅拌均匀。使用每板 20 mL 的介质倒入 100 mm 板。
6. 准备合成辍学 （SD） 尿素 （ Ura^-） 加乳酸琼脂.对于1L，溶解6.7克不含氨基酸的酵母氮碱，1.9克无尿素的脱脂补充剂，以及15克的琼脂蒸馏水。高压灭菌20分钟，在56°C水浴中冷却，直到温度为+50~60°C。使用 50 mL 血清学移液器或无菌分级圆柱体，添加步骤 1.2 中制备的 200 mL 的乳酸酶溶液。轻轻旋转或放在搅拌板上，将搅拌均匀。使用每板 20 mL 的介质倒入 100 mm 板。
7. 准备合成脱液 （SD） 尿素 （ Ura^-） 葡萄糖汤.对于1L，溶解6.7克酵母氮碱，不含氨基酸和1.9克滴液补充剂，在800 mL蒸馏水中不使用尿素。高压灭菌20分钟，在56°C水浴中冷却，直到温度为+50~60°C。使用 50 mL 血清学移液器或无菌分级圆柱体，加入步骤 1.1 中制备的 200 ml 葡萄糖溶液。
8. 准备合成脱液 （SD） 尿素 （ Ura^-） 亮氨酸 （ Leu^-） 葡萄糖琼脂.对于1L，溶解6.7克的酵母氮碱，不含氨基酸;1.9克的辍学补充剂，不含尿素、亮氨酸和锥形;15克琼脂;和0.076克的锥子醇在800 mL蒸馏水中。高压灭菌20分钟，在56°C水浴中冷却，直到温度为+50~60°C。使用 50 mL 血清学移液器或无菌分级圆柱体，添加步骤 1.1 中制备的 200 mL 葡萄糖溶液。使用每板 20 mL 的介质倒入 100 mm 板。
9. 准备合成辍学 （SD） 尿素 （ Ura^-） 亮氨酸 （ Leu^-） 加乳酸琼脂.对于1L，溶解6.7克不含氨基酸的酵母氮碱;1.9克的辍学补充剂，不含尿素、亮氨酸和锥形;15克琼脂;和0.076克的锥子醇在800 mL蒸馏水中。高压灭菌20分钟，在56°C水浴中冷却，直到温度为+50~60°C。使用 50 mL 血清学移液器或无菌分级圆柱体，添加步骤 1.2 中制备的 200 mL 的乳酸酶溶液。轻轻旋转或放在搅拌板上，将混合均匀。使用每板 20 mL 的介质倒入 100 mm 板。
10. 准备合成脱液 （SD） 尿素 （ Ura^-） 亮菌 （ Leu^-） 葡萄糖汤.对于1L，溶解6.7克不含氨基酸的酵母氮碱;1.9克的辍学补充剂，无尿素、亮氨酸、锥形;和0.076克的锥子醇在800 mL蒸馏水中。高压灭菌20分钟，在56~60°C水浴中冷却，直到温度为+50°C。使用 50 mL 血清学移液器或无菌分级圆柱体，添加步骤 1.1 中制备的 200 mL 葡萄糖溶液。
11. 制备聚乙烯乙二醇（PEG）溶液。在蒸馏水中加入50%的聚乙烯乙二醇3350。通过高压灭菌进行灭菌。
12. 在 200 mL 蒸馏水中溶解 10.2 g 醋酸锂脱水，制备 1 M 醋酸锂 （LiAc）。通过高压灭菌进行灭菌。
13. 准备青鱼精子DNA。使用蒸馏水将10mg/mL的青鱼精子DNA稀释至2mg/mL。在100°C加热5分钟，并立即放在冰上5分钟。

2. 将感兴趣的基因克隆到酵母毒性质粒pYesNTA-Kan中

注:目前，有各种酵母毒性载体可用于商业和学术。酵母抑制器屏幕可以与许多这些载体结合使用，只要表达感兴趣的效应蛋白的质粒使用除乌拉西尔以外的辍学选择和Bla^R以外的抗生素标记。这项工作使用经过改良的pYesNTA^{载体4，5，}其中包括一个卡那霉素抗卡带，以方便筛选潜在的抑制剂。克隆方案必须允许效应蛋白与Gal启动子和His-Tag结合。衣原体沙眼纳入膜蛋白CT229被用作这些测定的原理证明。

1. 使用 PCR 根据制造商的说明，使用 CT229 +1 Kpn F （CCGGTACATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAGGT） 和 CT229 XhoI R （CCCTCGAGTTTTCGCGAGATATC. 引物，使用 PCR 扩增来自C. 沙眼瘤的基因组DNA。使用以下 PCR 条件: （1） 98 °C 30 s;（2） 98 °C 10 秒，55 °C 30 秒，72°C 2 分钟;（3） 重复步骤 2 共 25 倍;（4） 72 °C 10 分钟;和 （5） 4 °C 保持。
2. 在1%的甘蔗凝胶上分析PCR产物的5μL（图1）。
3. 按照制造商的说明，使用 PCR 纯化试剂盒纯化剩余的 45 μL DNA。
4. 使用KpnI-HF和XhoI-HF在水浴中，在37°C下消化50μL的纯化PCR插入和pYesNTA-Kan（图2）。
   注:对于pYesNTA-Kan，使用5μL的KpnI-HF、5μl的XhoI-HF和6μL的缓冲液在60μL的总体积下消化5μg的质粒。对于刀片，使用 2 μL 的 KpnI-HF、2 μL 的 XhoI-HF 和 6 μL 的缓冲液消化整个 50 μL 的纯化 PCR 产物。
5. 在1%的甘蔗凝胶上运行整个质粒消化。按照制造商的说明，使用凝胶提取试剂盒对消化的质粒进行纯化。
6. 按照制造商的说明，使用 PCR 纯化套件纯化消化的 PCR 插件。
7. 使用 2 μL 的 pYesNTA-Kan（步骤 2.5）、2 μL DNA 连带酶缓冲液、1 μL T4 连带酶和 15 μL 的插入（步骤 2.6）将插入物克隆到 pYesNTA-Kan 中。在室温下孵育1小时。
8. 将整个克隆反应加入50μL的大肠杆菌能称量细胞，并进行转化反应。
9. 在含有100微克/mL的LB板上将整个转化反应板板。
10. 接种含有100微克/mL的含有100微克/mL的LB，具有三个单独的菌落。在 37°C 下孵育过夜，在 150 rpm 下摇动。
11. 按照制造商的说明，使用质粒小试剂盒分离质粒。
12. 使用基因特异性引源对分离的质粒进行测序（步骤2.1）。

3. 测试酵母中感兴趣的蛋白质的毒性

1. 在 YPD琼脂上（步骤 1.3）上获取孤立菌落的 Streak Sacchariisae W303。在30°C孵育24小时。
2. 用琼脂板中的单个菌落（步骤3.1）接种10 mL的YPD汤（步骤1.4）。在 30°C 下孵育，在 150 rpm 转速下过夜。
3. 将0.5 mL的隔夜培养剂加入10 mL的YPD汤（步骤1.4），在30°C下孵育，在150rpm下摇动4小时。
   1. 在 4°C 下在 3，000 x g下将 10 mL 的培养值颗粒 10 分钟。
   2. 将颗粒重新悬浮在1 mL无菌水中，转移到微离心管中，在3000 x g下在室温下将颗粒悬浮1分钟。
   3. 在室温下，将颗粒悬浮在1 mL的1 mM醋酸锂（LiAc）和3，000 x g的颗粒中1分钟。
   4. 重复 LiAc 洗涤 2 次。
   5. 拆下洗涤液。在 2.4 mL 的 50% PEG 3350 中重新悬浮颗粒。加入360μL的1M LiAc，500μL的2mg/mL的青鱼精子DNA，和400μL的无菌水。
      注: 这足以进行 20 次转换。
   6. 从步骤3.3.5向含有5μL的pYesNTA-Kan CT229质粒DNA（100~500 ng）的微离心管中加入180μL。
   7. 在30°C的水浴中孵育30分钟。
   8. 在42°C的水浴中孵育30分钟。
   9. 在室温下，在3，000 x g下颗粒1分钟。
   10. 用移液器拆下变换混合物。将颗粒重新悬浮在100 μL无菌水中。在 SD Ura^上板面变换 - 带葡萄糖的琼脂（步骤 1.5）。
   11. 在30°C孵育板48小时。
4. 用单片菌群接种5 mL的SD Ura^-含有葡萄糖的肉汤（步骤1.7）。在 30°C 下孵育过夜，在 150 rpm 下摇动。包括酵母与载体单独转换作为阴性对照。
   1. 在 96 井板 （A2+A6） 的 5 口井中加入 180 μL 无菌水。
   2. 漩涡通宵文化混合。
   3. 将180μL的酵母加入第一口井（A1）。连续稀释 1:10（共 6 个样本，包括未稀释）。
   4. 使用多通道移液器，在 SD Ura^-葡萄糖 （步骤 1.5） 和 Ura^-加乳糖（步骤 1.6）琼脂糖（步骤 1.6）上，将每个稀释的 5 μL 点。在30°C孵育48小时。
5. 通过比较表达在含乳酸酶介质上生长的感兴趣的效应蛋白的酵母的生长与单独表达载体的酵母的生长，评估毒性。
6. 通过西方印迹确认他标记融合蛋白的表达。

4. 使用酵母基因组库转化有毒酵母

1. 使用步骤 3.4 中的 1 mL 库存接种 100 mL SD Ura^-葡萄糖汤（步骤 1.7）。在 30°C 下孵育 16⁄24 小时，在 150 rpm 下摇动。将 900 mL 的 SD Ura^-葡萄糖汤放在 30°C 过夜，以预热介质。
2. 将整个 100 mL 的隔夜文化添加到预热的 1 L 烧瓶中。在 30°C 下孵育 4⁄5 小时，在 150 rpm 下摇动。
   1. 在 4°C 下在 6，000 x g下将培养基颗粒 10 分钟。
   2. 丢弃上清液。在250 mL无菌水中重新悬浮颗粒。在 4°C 下在 6，000 x g下将培养基颗粒 5 分钟。
   3. 丢弃上清液。在 250 mL 的 1 mM LiAc 中重新悬浮颗粒。在 4°C 下在 6，000 x g下将培养基颗粒 5 分钟。
   4. 取出 LiAc 并重新悬浮在 9.6 mL 的 50% PEG 3350 中。加入1.44毫升的1M LiAc，2毫升2毫克/毫升的青鱼精子DNA，50μg的pYep13基因组库（ATCC 37323）。使用无菌水将音量调节到 15 mL。通过反转轻轻混合。
   5. 在30°C的水浴中孵育30分钟。
   6. 加入750μL二甲基亚硫酸盐（DMSO），以提高转化效率。在42°C的水浴中孵育30分钟，每10分钟通过温和的倒置混合。
   7. 在室温下，在3，000 x g下将酵母丸5分钟。
   8. 丢弃上清液，在10 mL无菌水中重新悬浮颗粒。在室温下，在3，000 x g下5分钟。
   9. 将颗粒重新悬浮在8 mL无菌水中。
   10. 要确定转化效率，在 SD Ura^- Leu^-葡萄糖琼脂上稀释 1:10 和板 100 μL 的每次稀释（步骤 1.8）。
   11. SD Ura^- Leu^-乳酸琼脂琼脂（步骤1.9）板上样品的板200 μL。总共使用 50 个板。
   12. 在30°C孵育48~96小时或直到菌落出现。
       注:菌落一般出现在葡萄糖琼脂板上，在48-72小时，和加糖琼脂琼脂琼脂片在72-96小时。
3. 补丁殖民地（潜在的救援）在SD Ura^- Leu^-加拉克托塞琼脂（步骤1.9）扩大和使股票。在30°C孵育24~48小时。
4. 使用贴片部分接种 5 mL 的 SD Ura^- Leu^-葡萄糖汤（步骤 1.10）。在 26°C 下孵育过夜，在 150 rpm 下摇动。
   1. 将 180 μL 的无菌水添加到 96 井板 （A2+A6） 的 5 口井中。
   2. 漩涡通宵文化混合。
   3. 将180μL的酵母加入第一口井（A1）。连续稀释 1:10（共 6 个样本，包括未稀释）。
   4. 使用多通道移液器，在 SD Ura^-葡萄糖和 SD Ura^-加乳糖琼脂琼脂琼脂琼脂板上，发现每个稀释液的 5 μL。单独将有毒效应器作为控制。
   5. 在30°C孵育48小时。
5. 将单独表达毒性效应器的酵母的生长与含有潜在抑制物的酵母进行比较。只进行与单独表达效应剂的酵母相比毒性降低的潜在抑制剂。

5. 识别和确认抑制器

1. 接种 5 mL SD Ura^- Leu^-葡萄糖汤（步骤 1.10），步骤 4.4 起使用 100 μL 的酵母，在 30°C 下孵育过夜，在 150 rpm 下摇动。
   1. 在室温下，在3，000 x g下将酵母丸2分钟。使用移液器轻轻丢弃上清液。
   2. 按照制造商的说明，使用酵母质粒小试剂盒分离质粒。
2. 将分离的质粒转化为大肠杆菌的能合细胞，用100μg/mL的卡比西林在LB琼脂体上盘整个转化。在37°C孵育24小时。
3. 接种含有100微克/mL的10 mL的LB溴，从板中分泌三个菌落，在37°C孵育过夜，在150rpm下摇动。
   1. 在室温下，在3，000 x g下培养10分钟。按照制造商的说明，使用微型制备试剂盒分离质粒。
4. 按照协议第3部分的步骤，从步骤5.3.1中用分离的质粒重新改造有毒酵母。
   1. 从转化板中用菌群接种 5 mL 的 SD Ura^- Leu^-葡萄糖汤。在 30°C 下孵育过夜，在 150 rpm 下摇动。
   2. 在Ura^- Leu^-葡萄糖和乳糖琼脂糖上点，以确认毒性抑制。
5. 序列使用pYep13F（ACTACGATATATGCGGCGA）和pYep13 R（TGATGCCCCGATGC）引物来识别酵母ORF。

Results

在实际的酵母抑制器屏幕可以执行之前，必须测试感兴趣的效应蛋白在酵母中的毒性。这是通过在一个可诱导诱导剂的控制下表达对酵母感兴趣的蛋白质来实现的。葡萄糖的生长（非诱导条件）应首先进行比较，以确保毒性是特别由于感兴趣的蛋白质的表达，而不是一般的缺陷。如图3所示，毒性表现为较小的菌落和/或生长减少。酵母生长减少2⁄3对数是酵母抑制器屏幕的理想选择。

如图4所示，使用协议部分中描述的方法，毒性和抑制器屏幕可以分八个步骤完成。感兴趣的基因被克隆成合适的^载体1，所得的构造被转化为酵母来评估毒性。本研究以CT229作为感兴趣的基因，以pYesNTA-Kan为载体。此外，西印印证实了他标记的融合蛋白的表达。理想情况下，应观察到在含乳酸酶培养的酵母中减少2⁄3对数。如果感兴趣的蛋白质对酵母有毒（图3和图4），抑制器屏...

Discussion

该协议概述了使用改性酵母毒性和抑制器屏幕识别细菌效应蛋白靶向宿主生物通路的分步程序。使用的酵母菌株，S.cerevisiae W303，是辅助营养的尿素和亮氨酸。该菌株的Uracil辅助营养器用于选择含有pYesNTA-Kan载体上感兴趣的蛋白质的酵母，而亮氨酸辅助营养器用于选择酵母基因组库载体pYep13。酵母基因组库质粒携带3~13个ORF，因此每个ORF应单独克隆到p415-ADH^载体6或类似载体中，并重新转化为有毒酵母，以识别谁是真正的抑制者。它是典型的识别代表宿主生物通路的几个抑制器。抑制剂有时可以是感兴趣的细菌蛋白的直接结合伙伴，但并非总是如此。

生产含有pYesNTA-Kan上感兴趣的细菌蛋白的酵母克隆是第一步，应尽快非常小心，以保持这些克隆的完整性，因为携带毒性的酵母有很强的负选择蛋白质，即使没有故意的锥形诱导，它们可能会失去质粒。偶尔有质粒损失，即使酵母在辍学介质的选择下保持。以前曾报道过一种方法，通过线性化载体并将其整合到酵母^基因组1中，来减少质粒损...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
琼脂	Fisher Scientific	BP2641500
半乳	MilliporeSigma	G0750-1KG
GeneJet 凝胶提取试剂盒	ThermoFisher Scientific	K0691
GeneJet PCR 纯化试剂盒	ThermoFisher Scientific	K0701
GeneJet 质粒小量制备试剂盒	Thermo	K0503
葡萄糖	MilliporeSigma	G8270-1KG
鲱鱼精子 DNA	Promega	D1811
KpnI-HF	New England Biolabs	R3142S
醋酸锂二水合	MilliporeSigma	L6883-250G
蛋白胨	Fisher Scientific
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	New England Biolabs	M0530
聚乙二醇 3350	MilliporeSigma	1546547-1G
pYep13	ATCC	37323
T4 DNA 连接酶	New England Biolabs	M0202S
色氨酸	MilliporeSigma	470031-1G
XhoI-HF	New England Biolabs	R0146S
酵母提取物	Fisher科学	BP1422-500
酵母小量制备试剂盒	Zymo	D2001
不含氨基酸的酵母氮碱	MilliporeSigma	Y0626-250G
酵母合成辍学培养基补充剂	MilliporeSigma	Y1501-20G	不含尿嘧啶
合成辍学培养基补充剂	MilliporeSigma	Y1771-20G	不含尿嘧啶、亮氨酸、色氨酸