本文介绍了一种用于研究内皮糖蛋白在血管形成中作用的实验方案，包括斑马鱼全胚胎原位RNA杂交分析以及来源于患者诱导性多能干细胞的内皮细胞的管形成实验。
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方法文章
斑马鱼胚胎全 mount 原位杂交及iPSC-ECs管形成实验研究内皮糖蛋白在血管发育中的作用
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
血管发育由特定基因的有序表达决定，可通过在斑马鱼不同发育阶段进行原位杂交实验来研究。为了探究endoglin(eng)在遗传性出血性毛细血管扩张症 (HHT) 发生过程中对血管形成的作用，采用吗啉介导的靶向敲低技术在斑马鱼中抑制eng表达，以研究其时间特异性表达及其相关功能。本文采用整体原位RNA杂交（WISH）方法分析斑马鱼胚胎中eng及其下游基因的表达情况。同时，在来源于HHT患者的诱导多能干细胞分化而来的 内皮细胞（iPSC-ECs；携带eng突变）中进行管状结构形成实验。利用整套原位杂交系统（WISH）的特异性信号放大方法，相比传统方法可获得更高的分辨率和更低的背景信号。为获得更佳的信号效果，在探针杂交后将后固定时间调整为30分钟。由于荧光染色在斑马鱼胚胎中灵敏度较低，本实验采用二氨基联苯胺（DAB）染色替代。在本方案中，将携带eng突变的HHT 患者来源的iPSC细胞系分化为内皮细胞。将培养板在37 °C下用基底膜基质包被30分钟后，将iPSC-ECs以单层形式接种至孔板中，并在37 °C孵育3小时。随后，通过显微图像计算管状结构的长度及分支数量。因此，通过改进后的WISH方案表明，eng表达水平降低会影响斑马鱼胚胎中内皮祖细胞的形成。这一结果进一步通过来源于HHT患者的iPSC-ECs的管状结构形成实验得以验证。这些实验共同证实了eng在早期血管发育中的关键作用。
引言
在HHT患者中已报道存在eng（CD105）基因的单个突变。该突变可导致内皮细胞（EC）增殖增加以及血流介导的内皮细胞伸长能力下降1,2。先前研究还报道，ENG缺乏会降低斑马鱼中内皮细胞标志物的表达（例如kdrl、cdh5、hey2）3。Endoglin主要在内皮细胞中表达，是一种跨膜糖蛋白，作为转化生长因子β（TGF-β）家族成员的共受体发挥作用。它可引导BMP9在细胞表面结合，从而调控下游基因（包括Id1）的表达，诱导干细胞向内皮细胞分化4。因此，eng基因在血管发生及人类血管疾病中具有重要作用5,6。我们此前已研究了endoglin基因敲低对斑马鱼胚胎血管形成的影响，并进一步分析了来自携带eng突变的HHT患者的iPSC来源的内皮细胞7。本实验方案展示了ENG缺乏对内皮祖细胞标志物表达及管状结构形成的影响，后者是一种可定量评估体外血管生成能力的方法。
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方案
所有所述动物实验均经浙江大学医学院研究伦理委员会批准。
1. 全胚胎原位杂交
- 斑马鱼品系的饲养与繁殖
- 在循环水养殖系统中，于26–28 °C条件下饲养所有成年斑马鱼，每日光照14小时，黑暗10小时。后续实验使用AB（野生型）斑马鱼品系。
- 在繁殖盒底部铺一层小石子，作为鱼卵的庇护所。按2:1的比例（即两条雌鱼和一条雄鱼）将亲代鱼分组放入每个繁殖盒中。让雌鱼产卵1天。产卵结束后立即移除亲代鱼，以防止其吞食鱼卵。
- 使用显微注射系统（Femto Jet注射系统），向单细胞期胚胎注射2 ng的吗啉代寡核苷酸（morpholinos）和500 pg的mRNA（endoglin-MOs序列：5'-GATGAACTCAACACTCGTGTCTGAT-3'；5-错配对照MOs序列：5'-AAACAGACCACATCCTCTTCATCTC-3'）。
- 将受精卵在pH值为27 °C的酸性海水中孵育约48小时。
- 斑马鱼胚胎的收集与固定
- 当胚胎脱膜并发育至特定阶段时，使用塑料移液管从循环水系统（pH = 5.0）中收集20–40个斑马鱼胚胎，置于1.5 mL离心管中。加入1 mL室温（RT）下新鲜配制的4%多聚甲醛（PFA）溶液。
注意：选择胚胎的发育阶段应根据实验目的而....
- 当胚胎脱膜并发育至特定阶段时，使用塑料移液管从循环水系统（pH = 5.0）中收集20–40个斑马鱼胚胎，置于1.5 mL离心管中。加入1 mL室温（RT）下新鲜配制的4%多聚甲醛（PFA）溶液。
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结果
整体原位杂交基于类似于荧光共振能量转移的原理。该方法旨在提高斑马鱼原位杂交的灵敏度和特异性，同时在不影响背景信号的前提下放大靶标特异性信号。
在24 hpf的斑马鱼胚胎中， endoglin 在后主静脉（PCV）、节间血管（ISVs）和血岛中高表达3. 传统显色原位杂交（CISH）中染色时间难以控制，某些区域会出现非阳性信号，如卵黄囊（图1A）。为了研究……的作用 eng 在早期血管发育过程中，使用了一种造血内皮细胞标志物（aplnra）以及另一种内皮祖细胞标志物（nrp1a）以检测哪种类型的内皮受到的影响 eng 沉默20的表达 aplnra 和 n.......
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讨论
本方案采用了一种改进的斑马鱼全胚胎原位RNA分析平台，并对来自遗传性出血性毛细血管扩张症（HHT）患者的诱导多能干细胞来源的内皮细胞（iPSC-ECs）进行了管形成实验。传统的原位杂交（ISH）方法需要更长的实验周期，并包含额外的实验步骤。本方案包含若干重要改进：分别在全胚胎原位杂交（WISH）实验和管形成实验中使用了独立的双Z探针以及来自HHT患者的iPSCs。这些优化对于提高检测灵敏度至关重要，相较于传统ISH方法具有明显优势。独特设计的探针结合靶信号扩增技术，使得低丰度转录本的检测成为可能（例如aplnra基因在24小时受精后（hpf）的胚胎中表达水平极低）。其中一项改进是在探针杂交后增加一次额外的固定步骤，该步骤可增强探针与转录本的结合。此外，采用DAB染色而非荧光染色，原因是某些低丰度基因的荧光染色难以实现。随后，利用iPSCs进行血管生成实验，进一步提升了本研究的意义及其临床相关性。然而，iPSCs的生成需要严格的培养条件，这也是本方案的一项局限性。
必须强调一些关键步骤。在WISH分析中，斑马鱼胚胎的消化时间应严格遵循文本所述。消化时间过短无法保证探.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了中国国家重点研发计划——干细胞与转化医学研究项目 [项目编号 2016YFA0102300（资助对象：Jun Yang）]；国家自然科学基金 [项目编号 81870051、81670054（资助对象：Jun Yang）]；中国医学科学院医学科学创新基金（CIFMS）[项目编号 2016-I2M-4-003（资助对象：Jun Yang）]；北京协和医学院青年基金及中央高校基本科研业务费专项资金 [项目编号 2017310013（资助对象：Fang Zhou）] 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| µ-Slide 血管生成 | ibidi | 81506 | 细胞培养 |
| Amp 1-FL | ACD | SDS 320852 | 信号扩增 |
| Amp 2-FL | ACD | SDS 320853 | 信号扩增 |
| Amp 3-FL | ACD | SDS 320854 | 信号扩增 |
| Amp 4 Alt B-FL | ACD | SDS 320856 | 信号扩增 |
| Corning Matrigel 基质 | Corning | 354234 | 生长因子减少型 Matrigel |
| DEPC | Sigma | D5758 | RNA酶-free 水 |
| 人内皮细胞-SFM | Thermofisher | 11111044 | 细胞培养 |
| 多聚甲醛 | Sigma | 30525-89-4 | 固定胚胎 |
| 多聚甲醛 | Sigma | 30525-89-4 | 固定细胞 |
| 蛋白酶 K | ACD | SDS 322337 | 组织消化 |
| 柠檬酸钠 | Sigma | 6132-04-3 | SSCT 溶液：洗涤缓冲液 |
| VEGF-165 | STEMCELL Technologies | 78073 | 生长因子 |
参考文献
- Jin, Y., et al. Endoglin prevents vascular malformation by regulating flow-induced cell migration and specification through VEGFR2 signalling. Nature Cell Biology. 19 (6), 639-652 (2017).
- Sugden, W. W., et al.
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重印与许可
