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方法文章

斑马鱼胚胎全 mount 原位杂交及iPSC-ECs管形成实验研究内皮糖蛋白在血管发育中的作用

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DOI：

10.3791/60498

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2020年5月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Department of Cardiology of the Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Cell Biology, State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 3Wuxi Lung Transplant Center, Wuxi People's Hospital affiliated to Nanjing Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于研究内皮糖蛋白在血管形成中作用的实验方案，包括斑马鱼全胚胎原位RNA杂交分析以及来源于患者诱导性多能干细胞的内皮细胞的管形成实验。

摘要

血管发育由特定基因的有序表达决定，可通过在斑马鱼不同发育阶段进行原位杂交实验来研究。为了探究endoglin(eng)在遗传性出血性毛细血管扩张症 (HHT) 发生过程中对血管形成的作用，采用吗啉介导的靶向敲低技术在斑马鱼中抑制eng表达，以研究其时间特异性表达及其相关功能。本文采用整体原位RNA杂交（WISH）方法分析斑马鱼胚胎中eng及其下游基因的表达情况。同时，在来源于HHT患者的诱导多能干细胞分化而来的 内皮细胞（iPSC-ECs；携带eng突变）中进行管状结构形成实验。利用整套原位杂交系统（WISH）的特异性信号放大方法，相比传统方法可获得更高的分辨率和更低的背景信号。为获得更佳的信号效果，在探针杂交后将后固定时间调整为30分钟。由于荧光染色在斑马鱼胚胎中灵敏度较低，本实验采用二氨基联苯胺（DAB）染色替代。在本方案中，将携带eng突变的HHT 患者来源的iPSC细胞系分化为内皮细胞。将培养板在37 °C下用基底膜基质包被30分钟后，将iPSC-ECs以单层形式接种至孔板中，并在37 °C孵育3小时。随后，通过显微图像计算管状结构的长度及分支数量。因此，通过改进后的WISH方案表明，eng表达水平降低会影响斑马鱼胚胎中内皮祖细胞的形成。这一结果进一步通过来源于HHT患者的iPSC-ECs的管状结构形成实验得以验证。这些实验共同证实了eng在早期血管发育中的关键作用。

引言

在HHT患者中已报道存在eng（CD105）基因的单个突变。该突变可导致内皮细胞（EC）增殖增加以及血流介导的内皮细胞伸长能力下降1,2。先前研究还报道，ENG缺乏会降低斑马鱼中内皮细胞标志物的表达（例如kdrl、cdh5、hey2）3。Endoglin主要在内皮细胞中表达，是一种跨膜糖蛋白，作为转化生长因子β（TGF-β）家族成员的共受体发挥作用。它可引导BMP9在细胞表面结合，从而调控下游基因（包括Id1）的表达，诱导干细胞向内皮细胞分化4。因此，eng基因在血管发生及人类血管疾病中具有重要作用5,6。我们此前已研究了endoglin基因敲低对斑马鱼胚胎血管形成的影响，并进一步分析了来自携带eng突变的HHT患者的iPSC来源的内皮细胞7。本实验方案展示了ENG缺乏对内皮祖细胞标志物表达及管状结构形成的影响，后者是一种可定量评估体外血管生成能力的方法。

为了研究eng基因的空间和时间表达模式，采用WISH技术在体内检测基因表达8。原位杂交（ISH）是一种利用带有标记的探针（其序列与目标核酸（DNA或mRNA）互补）来检测和可视化固定样本中目标核酸杂交体的方法。该技术可在体内扩增基因表达信号，并通过显微镜观察基因的表达情况。WISH已广泛应用于多种模式动物，尤其是在斑马鱼中9。该方法还可用于获取以下数据：1）基因的空间/时间表达模式，为基因功能和分类提供信息；2）特异性表达的基因标记物，可用于高通量药物筛选或突变体筛选10。

显色探针在传统的染色体原位杂交（CISH）中容易降解 ，导致背景噪声高和非特异性信号11,12。WISH 方法使用两个独立的双Z探针，这些探针设计用于与目标RNA序列杂交。每个探针包含一段18-25个碱基与目标RNA互补的序列，以及一段14个碱基的尾部序列（概念化为Z）。目标探针以成对形式（双Z）使用。两个尾部序列共同形成一个28个碱基的预扩增子结合位点，预扩增子含有20个扩增子结合位点。而扩增子又含有20个标记探针结合位点，理论上每个目标RNA序列可产生多达8,000个标记。

该先进技术可实现信号的同时扩增和背景抑制，从而在保持组织形态的同时实现单分子水平的可视化13。对WISH方法的进一步改进基于先前的研究14，包括额外的固定步骤和DAB染色。本文提供了一种改进的WISH方案，即使目标RNA部分减少或降解，该方法仍可有效工作。其优势包括：无需无RNase环境，可在24小时内完成实验；可通过多个通道同时检测多个目标信号，且结果具有一致性，可与不同高通量自动化平台的结果兼容。

动物模型的结果不一定反映在人类中发生的相同现象。ENG 包含两对保守的半胱氨酸残基 C30-C207 和 C53-C182，它们在孤儿区域中形成二硫键。为了进一步研究 eng 在遗传性出血性毛细血管扩张症（HHT）患者中的作用，已开展利用 HHT 患者来源的诱导性多能干细胞（iPSCs）进行的管状结构形成实验，比较了无/eng 突变（Cys30Arg，C30R）细胞的情况15。自 Kubota 等人首次报道管状结构形成实验以来16，该检测方法已得到多方面的发展，被用于鉴定促血管生成或抗血管生成因子、定义血管生成中的信号通路，以及识别调控血管生成的基因17。

在患者来源的iPSC-ECs出现之前，研究人员主要使用培养的内皮细胞（ECs）来研究血管生成16。然而，对于内皮细胞而言，利用病毒转导外源基因存在技术上的挑战，原因是内皮细胞的传代次数有限。这是因为从手术中或匹配的合格供体获取的人体血管中几乎无法获得足够的细胞材料。随着山中伸弥（Shinya Yamanaka）发明了诱导性多能干细胞（iPSC）的生成技术，如先前报道所述，来源于iPSC的人体内皮细胞已可稳定地用于体外实验18。

使用病毒转导的内皮细胞（ECs）进行信号通路研究时，细胞数量较少且传代次数有限可能已足够；但对于功能研究，最好先构建突变型多能干细胞系（包括诱导多能干细胞iPSCs或经CRISPR/Cas9靶向编辑的hESCs），再将其分化为内皮细胞，用于基于管状结构形成实验的血管生成研究19。管状结构形成实验可用于评估携带突变的内皮细胞功能。本方案还描述了在µ-slide血管生成板上进行管状结构形成的实验方法，该方法操作简便、成本较低且具有良好的可重复性。

以下方案提供了一种可靠且系统的方法，用于研究特定基因在血管形成中的作用，同时包含体内表达模式和体外功能定量的详细步骤，以模拟人类疾病。

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方案

所有所述动物实验均经浙江大学医学院研究伦理委员会批准。

1. 全胚胎原位杂交

  1. 斑马鱼品系的饲养与繁殖
    1. 在循环水养殖系统中，于26–28 °C条件下饲养所有成年斑马鱼，每日光照14小时，黑暗10小时。后续实验使用AB（野生型）斑马鱼品系。
    2. 在繁殖盒底部铺一层小石子，作为鱼卵的庇护所。按2:1的比例（即两条雌鱼和一条雄鱼）将亲代鱼分组放入每个繁殖盒中。让雌鱼产卵1天。产卵结束后立即移除亲代鱼，以防止其吞食鱼卵。
    3. 使用显微注射系统（Femto Jet注射系统），向单细胞期胚胎注射2 ng的吗啉代寡核苷酸（morpholinos）和500 pg的mRNA（endoglin-MOs序列：5'-GATGAACTCAACACTCGTGTCTGAT-3'；5-错配对照MOs序列：5'-AAACAGACCACATCCTCTTCATCTC-3'）。
    4. 将受精卵在pH值为27 °C的酸性海水中孵育约48小时。
  2. 斑马鱼胚胎的收集与固定
    1. 当胚胎脱膜并发育至特定阶段时，使用塑料移液管从循环水系统（pH = 5.0）中收集20–40个斑马鱼胚胎，置于1.5 mL离心管中。加入1 mL室温（RT）下新鲜配制的4%多聚甲醛（PFA）溶液。
      注意：选择胚胎的发育阶段应根据实验目的而定。表1列出了不同胚胎发育阶段所需的固定时间。
    2. 去除固定液，用含Tween-20的磷酸盐缓冲液（PBST，将1 mL Tween加入1000 mL PBS溶液中稀释）在室温下清洗胚胎，每次5分钟，共清洗3次。
    3. 通过依次在25%、50%和75%甲醇（用PBST稀释）中各孵育5分钟进行脱水处理。将胚胎转移至100%甲醇中孵育5分钟，并更换新鲜甲醇。于-20 °C保存过夜或更长时间。
  3. 水化与消化
    1. 使用底部带有尼龙网筛的装置，将保存在100%甲醇中的胚胎依次在12孔板的孔中用75%、50%和25%甲醇（用PBST稀释）各清洗5分钟进行水化。随后在室温下用PBST清洗胚胎3次，每次5分钟。
    2. 向含有胚胎的离心管中加入50 µL蛋白酶K（10 mg/mL），在室温下按照表2中的消化时间进行处理。
    3. 去除蛋白酶K，用PBST在室温下清洗胚胎3次，每次5分钟。
  4. 探针杂交与后固定
    1. 将根据各基因mRNA序列设计的探针置于40 °C杂交系统中，直至沉淀溶解（约需10分钟）。在1.5 mL离心管中按50:1:1的比例混合目标探针eg（XM_007116.7）以及另外两个参与早期中胚层内皮前体细胞形成的基因探针（此处为aplnr [NM_001075105.1] 和 nrp1a [NM_001040326.1]）。
    2. 向每管胚胎中加入50–100 µL混合探针，于40 °C孵育过夜。
      注意：预混探针在使用前必须预热至40 °C，然后冷却至室温。
    3. 配制含Tween-20的0.2x柠檬酸钠盐溶液（SSCT）：将175.3 g NaCl和88 g柠檬酸钠溶于1 L dH2O中，得到20x SSC溶液；再将其用dH2O按1:100稀释，得到0.2x SSCT溶液；最后将Tween-20按1:1000比例加入0.2x SSCT溶液中稀释。
    4. 将回收的探针转移至新离心管中。用0.2x SSCT溶液在室温下清洗胚胎3次，每次15分钟。回收的探针可重复使用5–10次。
    5. 使用4%多聚甲醛（PFA）在室温下固定胚胎30分钟。随后用0.2x SSCT溶液在室温下清洗胚胎3次，每次15分钟。
      注意：Gross-Thebing等人的研究建议后固定时间为10分钟14，但实际操作中需根据情况调整。我们测试了三次10分钟的后固定，发现DAB染色的灵敏度显著受影响。经验证，0.5–1.0小时的固定时间为最佳条件（固定时间过短无法获得清晰的目标RNA信号，适当延长固定时间有助于增强信号并降低背景噪音）。
  5. 顺序放大与标记探针杂交
    1. 去除SSCT溶液，加入50 µL Amp 1。在40 °C下孵育30分钟使胚胎沉降。随后用0.2x SSCT溶液在室温下清洗3次，每次15分钟。
    2. 去除SSCT溶液，加入50 µL Amp 2。在40 °C下孵育15分钟。随后用0.2x SSCT溶液在室温下清洗3次，每次15分钟。
    3. 去除SSCT溶液，加入50 µL Amp 3，并轻轻振荡离心管。在40 °C下孵育30分钟。随后用0.2x SSCT溶液在室温下清洗3次，每次15分钟。
    4. 去除SSCT溶液，逐滴加入50 µL Amp 4，并小心振荡离心管。在40 °C下孵育15分钟。随后用0.2x SSCT溶液在室温下清洗3次，每次15分钟。
  6. 复染与显微观察
    1. 去除SSCT溶液，向每管中加入50 µL DAPI，在4 °C下孵育过夜。
    2. 用PBST充分清洗胚胎，并在盛有PBST的培养皿中用1%低熔点琼脂糖（LMP）溶液（1 g LMP溶于100 mL dH2O）包埋样品，准备成像。
    3. 使用DAB过氧化物酶底物试剂盒对样本进行染色。将试剂A、B、C各50 µL加入1 mL蒸馏水中，充分混匀，配制成完整的DAB工作液。将该液体加入样本中，避光孵育10分钟。
    4. 染色后用PBST彻底清洗样本。
    5. 使用具备摄影功能的光学显微镜对样本进行成像。
      注意：若需延迟拍照，应将样本管用铝箔包裹，并于4 °C保存。

2. 管状结构形成实验

注意：eng 突变型和野生型内皮细胞（对照）分别由来自一名遗传性出血性毛细血管扩张症（HHT）患者（本例为一名62岁女性患者，自22岁起反复出现鼻出血、胃肠道出血及肺动静脉畸形，携带外显子2上c.88T>C位点的错义eng突变）和一名健康供体（无eng突变）的诱导多能干细胞（iPSCs）分化而来，细胞由北京协和医院提供，并经学院科研伦理委员会批准。

  1. 对照和HHT诱导多能干细胞（iPSC）的培养
    1. 向6孔细胞培养板中加入一定体积的基底膜基质（例如Matrigel），使其覆盖孔底，于37 °C孵育1小时。
      注意：首次使用储存于-20 °C的基底膜基质时，需在冰上或无霜4 °C冰箱中解冻。然后用DMEM/F12按1:100稀释，再将稀释液分装至200 µL离心管中，每管100 µL。储存于-20 °C，避免反复冻融。加入稀释后的基底膜基质时，不要产生气泡。加样后，用手轻轻晃动6孔板，使其均匀覆盖孔底。
    2. 包被完成后，吸除各孔中的基底膜基质溶液。每孔加入2 mL mTeSR1培养基，接种上一次传代获得的iPSC，密度约为每孔1 × 106个细胞。
  2. 由iPSC生成并扩增内皮细胞（ECs）
    1. iPSC培养约4天后，更换为添加了激活素A（25 ng/mL）、BMP4（30 ng/mL）、VEGF165（50 ng/mL）和CHIR99021（1.5 µM）的BEL培养基。继续培养3天以诱导中胚层细胞生成。
    2. 将步骤2.2.1所述培养基更换为添加VEGF（50 ng/mL）和SB431542（10 µM）的BEL培养基，培养4天以扩增血管内皮细胞。继续使用相同培养基再培养3–4天。
    3. 使用CD31磁珠纯化成熟的血管内皮细胞：参照CD31磁珠试剂盒说明书，该试剂盒通过将人CD31抗体与磁珠结合，捕获内皮细胞表面表达的CD31分子，随后用洗脱缓冲液收集CD31阳性细胞。将纯化的内皮细胞维持并扩增于含VEGF165（30 ng/mL）、bFGF（30 ng/mL）和FBS（1%）的EC-SFM培养基中。
  3. 将内皮细胞接种于Matrigel包被的培养板并进行显微观察
    1. 每孔加入10 µL基底膜基质，包被血管生成检测板（见材料表），于37 °C孵育30分钟。
    2. 通过免疫荧光染色检测内皮标志物CD31和VE-钙黏蛋白后，收集内皮细胞，并用移液器反复吹打使其重悬于内皮细胞生长培养基2中。每孔加入50 µL细胞悬液（2 × 105个细胞/mL），置于已凝固的基质上，于37 °C孵育3–5小时。
      注意：在进行管状结构形成实验前，应检测内皮标志物以确认功能性内皮细胞具有正确的表型。每孔1 × 104个细胞是管状结构形成的理想数量；细胞过多或过少均不利于管状结构形成。加样时应从培养皿侧壁加入，避免触碰基底膜基质。使用高倍视野的光学显微镜观察细胞并拍照。
  4. 管状结构形成的定量分析
    1. 使用高分辨率显微镜观察结果，对每组至少拍摄10个区域，以获得可靠的统计数据。
    2. 评估内皮细胞管状结构形成情况：通过观察总管长度、管数量和分支点来估计管状结构形成的程度。使用ImageJ软件分析并计数分支的数量和长度。

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结果

整体原位杂交基于类似于荧光共振能量转移的原理。该方法旨在提高斑马鱼原位杂交的灵敏度和特异性，同时在不影响背景信号的前提下放大靶标特异性信号。

在24 hpf的斑马鱼胚胎中， endoglin 在后主静脉（PCV）、节间血管（ISVs）和血岛中高表达3. 传统显色原位杂交（CISH）中染色时间难以控制，某些区域会出现非阳性信号，如卵黄囊（图1A）。为了研究……的作用 eng 在早期血管发育过程中，使用了一种造血内皮细胞标志物（aplnra）以及另一种内皮祖细胞标志物（nrp1a）以检测哪种类型的内皮受到的影响 eng 沉默20的表达 aplnra 和 n...

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讨论

本方案采用了一种改进的斑马鱼全胚胎原位RNA分析平台，并对来自遗传性出血性毛细血管扩张症（HHT）患者的诱导多能干细胞来源的内皮细胞（iPSC-ECs）进行了管形成实验。传统的原位杂交（ISH）方法需要更长的实验周期，并包含额外的实验步骤。本方案包含若干重要改进：分别在全胚胎原位杂交（WISH）实验和管形成实验中使用了独立的双Z探针以及来自HHT患者的iPSCs。这些优化对于提高检测灵敏度至关重要，相较于传统ISH方法具有明显优势。独特设计的探针结合靶信号扩增技术，使得低丰度转录本的检测成为可能（例如aplnra基因在24小时受精后（hpf）的胚胎中表达水平极低）。其中一项改进是在探针杂交后增加一次额外的固定步骤，该步骤可增强探针与转录本的结合。此外，采用DAB染色而非荧光染色，原因是某些低丰度基因的荧光染色难以实现。随后，利用iPSCs进行血管生成实验，进一步提升了本研究的意义及其临床相关性。然而，iPSCs的生成需要严格的培养条件，这也是本方案的一项局限性。

必须强调一些关键步骤。在WISH分析中，斑马鱼胚胎的消化时间应严格遵循文本所述。消化时间过短无法保证探...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了中国国家重点研发计划——干细胞与转化医学研究项目 [项目编号 2016YFA0102300（资助对象：Jun Yang）]；国家自然科学基金 [项目编号 81870051、81670054（资助对象：Jun Yang）]；中国医学科学院医学科学创新基金（CIFMS）[项目编号 2016-I2M-4-003（资助对象：Jun Yang）]；北京协和医学院青年基金及中央高校基本科研业务费专项资金 [项目编号 2017310013（资助对象：Fang Zhou）] 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
µ-Slide 血管生成ibidi81506细胞培养
Amp 1-FLACDSDS 320852信号扩增
Amp 2-FLACDSDS 320853信号扩增
Amp 3-FLACDSDS 320854信号扩增
Amp 4 Alt B-FLACDSDS 320856信号扩增
Corning Matrigel 基质Corning354234生长因子减少型 Matrigel
DEPCSigmaD5758RNA酶-free 水
人内皮细胞-SFMThermofisher11111044细胞培养
多聚甲醛Sigma30525-89-4固定胚胎
多聚甲醛Sigma30525-89-4固定细胞
蛋白酶 KACDSDS 322337组织消化
柠檬酸钠Sigma6132-04-3SSCT 溶液：洗涤缓冲液
VEGF-165STEMCELL Technologies78073生长因子

参考文献

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