冠状动脉祖细胞与可溶性生物标志物在冠状动脉血管成形术后心血管预后中的作用

摘要

主要不良心血管事件的发生会影响冠状动脉成形术后的心血管预后，其发生受冠状动脉损伤程度和血管修复情况的影响。检测对血管损伤和修复具有反应性的新型冠状动脉细胞和可溶性生物标志物，有助于预测主要不良心血管事件的发生及患者预后。

摘要

主要不良心血管事件（MACEs）会因冠状动脉缺血性损伤而对接受冠状动脉成形术患者的 cardiovascular 预后产生负面影响。冠状动脉损伤程度以及血管修复机制是影响未来 MACEs 发生的因素。诸如斑块特征和冠状动脉复杂性等内在血管特征已被证实可提供 MACEs 的预后信息。然而，有研究提出，冠状动脉内循环生物标志物的检测可作为早期识别和评估 MACEs 预后的便捷方法，因其更能准确反映与冠状动脉损伤及修复相关的动态机制。在成形术期间测定冠状动脉循环生物标志物，例如单个核祖细胞（MPCs）亚群的数量，以及反映炎症、细胞黏附和修复过程的可溶性分子浓度，有助于评估冠状动脉成形术后6个月内的 MACEs 发生风险及预后情况。该方法具有良好的转化应用价值，且在预测 MACEs 及评估心血管预后方面优于外周血循环生物标志物，因此可用于接受成形术的冠状动脉疾病患者的风险分层。

引言

冠状动脉成形术和支架植入术是冠状动脉疾病（CAD）患者的补救性治疗措施。然而，主要不良心血管事件（MACEs），包括心血管死亡、心肌梗死、冠状动脉再狭窄以及心绞痛或失代偿性心力衰竭发作，可能在冠状动脉介入治疗后数月内发生，导致患者非计划性入院。MACEs 在全球范围内较为常见，其发病率和死亡率均较高¹。

冠状动脉缺血性损伤会引发早期血管反应及修复机制，其中包括由于MPCs的分化能力及/或血管修复潜能所导致的MPCs动员，以及细胞间黏附分子（ICAMs）、基质金属蛋白酶（MMPs）和活性氧等可溶性分子的产生，这些分子反映了细胞黏附、组织重塑和氧化应激过程。尽管已采用斑块特征和冠状动脉复杂性等内在血管特征来预测主要不良心血管事件（MACEs），但一些研究表明，与冠状动脉内皮损伤和修复机制相关的生物标志物可能在接受冠状动脉成形术的冠心病（CAD）患者中对心血管事件的早期识别和预后评估具有重要价值^2,3,4,5。

人们对理解冠状动脉疾病（CAD）损伤与修复机制的持续关注，促使研究人员致力于研究冠状动脉内循环生物标志物，因为冠状动....

方案

本方案符合人类研究伦理委员会的机构指南。

1. 冠状动脉造影、超声检查和采血

1. 在冠状动脉介入治疗前获取基线临床和人口统计学信息。收集个体的数据：年龄、性别、当前吸烟状况、体重指数（BMI）、高血压、血脂异常、糖尿病、用药情况以及本次冠状动脉造影的适应证。
2. 通过经桡动脉途径的心导管术进行冠状动脉造影。该操作应在导管室的透视引导下由经验丰富的心脏病专家完成。
   注：确定可评估血管。本研究中，可评估血管定义为管径大于1.5 mm且管腔狭窄程度超过50%的动脉。
3. 将血管内超声导管送至目标区域并记录图像。使用相应软件定位并测量最小管腔面积。
4. 使用冠状动脉导管从斑块最近处采集10 mL血液。
5. 患者出院后，安排定期医学评估以随访研究终点。若无法通过电话联系或医生就诊延迟超过2个月，应要求一位预先指定的授权人员核实研究终点。
   注：以下任一情况均视为主要不良心血管事件（MACE）：1）心血管死亡；2）新发心肌梗死；3）不稳定型心绞痛导致24小时内非计划性就医；4）冠状动脉造影证实的支架内再狭窄；5）需临床干预的失代偿性心力衰竭发作。

2. 循环MPC的测定（图2）

1. 采集血液后1小时内进行处理。将6 mL采集的血液转....

结果

采集了52名接受冠状动脉造影（图1）的患者的冠状动脉、静脉窦及外周血样本，这些患者中高血压和血脂异常的患病率较高。在临床随访期间，冠状动脉造影术后6个月发生了11例（21.1%）主要不良心血管事件（MACE）：死亡（n = 1）、需住院治疗的心绞痛（n = 6）、心肌梗死（n = 2）和/或心力衰竭证据（n = 4）。

发生主要不良心血管事件（MACE）的患者，其大多数MPCs的基础冠状动脉浓度显著较低（图4），其中CD34⁺CD133⁺和CD45⁺CD34⁺CD133⁺CD184⁺亚群的下降更为明显。同样，发生MACE的患者冠状动脉中sICAM-1的基础水平升高，而MMP-9水平降低（表.......

讨论

从受累冠状动脉采血可能较为困难，有时冠状动脉几乎无法接近。在此情况下，可考虑从静脉窦采样作为替代方法。我们进行了验证试验，比较了冠状动脉与静脉窦中循环生物标志物的水平，结果显示无显著差异。然而，循环生物标志物的性能仅在冠状动脉采样条件下得到验证，因此从静脉窦获取的生物标志物性能仍有待进一步探索。

采集血液后应最好在3小时内处理样本以分离MPCs。因此，心脏病学团队与实验室研究人员之间应建立良好的沟通。在分离MPCs过程中，进行密度梯度制备时加入血液样本以及洗涤MPCs沉淀时需格外小心。为方便起见，我们通常将细胞转移至流式管中，加入一抗，固定后于4 °C过夜保存，次日进行流式细胞术检测。关于循环MPCs的生物标志物作用，目前已有重要努力致力于在前体细胞中标准化最具临床应用价值的免疫表型¹²，但本研究的一个局限性在于，对于冠状动脉疾病（CAD）或其他血管疾病中的所有临床情况，循环前体细胞的特定亚群尚未被充分表征。因此，每项研究都应探索不同的循环前体细胞亚群。

在检测可溶性标志物时，E.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BSA	Roche	10735086001	牛血清白蛋白（BSA），用作缓冲剂、稳定剂、标准品以及用于混合。
校准微珠	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-607	MACQuant 校准微珠以含 0.05% 叠氮化钠的水溶液形式提供，3.5 ml 可用于最多 100 次检测。
CD133/1 (AC133)-PE	Milteny Biotec / MACS	#130-080-801	与 R-藻红蛋白偶联的抗体，溶于 PBS/EDTA 缓冲液中。
CD184 (CXCR4)-PE-VIO770	Miltenyi Biotec / MACS	#130-103-798	单克隆抗体，同型为重组人 IgG1，已偶联。
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-093-601	与 R-藻红蛋白偶联的抗体，溶于 PBS/EDTA 缓冲液中。
CD34-FITC	Miltenyi Biotec / MACS	#130-081-001	单克隆抗体克隆 AC136 可识别 CD34 的 III 类表位。
CD45-VioBlue	Miltenyi Biotec / MACS	#130-092-880	单克隆 CD45 抗体，人源化偶联。
锥形管	Thermo SCIENTIFIC	#339651	15 ml 锥形离心管。
流式细胞管	FALCON Corning Brand	#352052	5 mL 聚苯乙烯圆底管，12×75 型，无菌。
EDTA	BIO-RAD	#161-0729	重金属（以铅计）<10 ppm，铁 <0.01%，砷 <1 ppm，不溶物 <0.005%。
改良纽鲍尔计数板	无品牌	无货号	用于细胞计数的血细胞计数板（范围 0.1000 mm，0.0025 mm2）。
K2 EDTA 血液采集管	BD Vacutainer	#367863	紫色塑料真空采血管（K2E），含 10.8 mg，6 mL。
Lymphoprep	Stemcell Technologies	01-63-12-002-A	无菌且经内毒素检测合格。密度：1.077±0.001 g/mL。
多聚甲醛	SIGMA-ALDRICH	#SZBF0920V	用于生物样本固定（粉末，95%）。
1.3 mL 移液管	CRM Globe	PF1016, PF1015	移液管是一种可实现更精确液体转移的工具。
试管	KIMBLE CHASE	45060 13100	耐热试管，尺寸/管帽：13 × 100 mm。