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方法文章

通过活体显微镜评估小鼠 cremaster 肌肉中的白细胞浸润

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DOI：

10.3791/60509

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2020年4月15日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neonatology, Heidelberg University Children's Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文展示了如何对小鼠提睾肌的毛细血管后微静脉进行活体显微观察。该技术常用于研究不同类型的炎症和脓毒症模型，尤其是由趋化因子和细胞因子诱导的模型，本文强调了其在研究伴有显著肌肉白细胞浸润的肌病中的重要性。

摘要

活体显微镜（IVM）被广泛用于在体内监测白细胞募集级联中的生理和病理生理过程。本方案提供了一种实用且可重复的方法，用于在完整小鼠机体内的骨骼肌来源组织中可视化白细胞与内皮细胞的相互作用，从而实现白细胞的募集。该模型适用于所有关注粒细胞活化及其在疾病中作用的研究领域。

我们提供了一步一步的实验方案，以指导该方法的实施，并强调其中可能存在的陷阱和技术难点。本方案涵盖以下方面：实验设置与所需材料、小鼠麻醉、提睾肌解剖、气管插管与颈动脉插管、活体显微成像（IVM）记录及离线数据分析。文中详细解释了黏附白细胞、滚动通量（RF）和滚动通量分数（RFF）等数据格式，并讨论了其适当的应用场景。结果部分展示了来自肌营养不良蛋白缺陷型 mdx 小鼠的代表性实验结果。

体内显微镜技术（IVM）是一种用于评估活体环境下白细胞募集的有力工具；然而，若需明确区分内皮细胞与白细胞的功能，则可能需要结合离体实验系统，例如流动腔实验。此外，目标动物的遗传背景可能显著影响基础水平的细胞募集，因此需要对所提供的实验方案进行个体化的精细调整。尽管存在这些局限性，IVM仍可作为将体外研究结果快速转化至活体脊椎动物中的平台。

引言

活体显微镜（IVM）是白细胞生物学领域中常用的研究工具。白细胞募集遵循一系列明确定义的级联事件，起始于白细胞被捕获、沿血管内皮滚动并黏附于内皮壁，最终穿过血管壁迁移至炎症实际发生部位1。每个步骤均由多种趋化因子（如IL-8/CXCL8）、受体（如LFA-1、Mac-1）以及相应的内皮细胞黏附分子（如ICAM-1、VCAM-1和E-选择素）介导并调控2,3。通过IVM技术，研究人员已揭示了调控白细胞募集级联反应中不同调节位点、控制因子及介质之间的相互作用，例如晚期糖基化终产物受体（RAGE）、细胞间黏附分子1（ICAM-1）、C-X-C基序配体（CXCL）1/2及其受体CXCR2的作用机制4,5,6,7,8,9。

体内显微成像（IVM）方法已被描述用于多种不同的器官和组织，例如肠道10、皮肤11、淋巴结12、胚胎卵黄囊13等。然而，IVM 中研究最广泛的方法是提睾肌模型，该模型最初在大鼠中被描述14。尽管目前仍在大鼠中使用15，但由于存在大量不同的转基因小鼠品系，该方法如今主要应用于小鼠。我们课题组近期通过研究抗肌萎缩蛋白缺陷型 mdx 小鼠，强调了提睾肌 IVM 在杜氏肌营养不良症（DMD）等炎症性肌病研究领域中的潜在作用16。由于提睾肌结构纤薄、肌纤维交织且易于接近，是利用光学显微镜或荧光显微镜进行整体组织观察的理想肌肉。白细胞的募集和血管外渗主要发生在后微静脉，这些血管可在提睾肌连续的肌层中清晰识别。

与体外检测相比，活体成像的优势在于其在活体生物中的生物学背景。同时，若要明确特定细胞在白细胞募集改变中的作用，可能需要额外的体外模型，如流动腔室或内皮细胞检测。多种方法的联合使用将获得最具说服力的数据。研究人员应意识到腹股沟肌模型的局限性，因为任何手术操作都会导致白细胞迁移和募集增加，因此难以通过该方法准确估计基础水平的白细胞募集。尽管该模型应用广泛，但腹股沟肌的活体显微成像（IVM）仍具有挑战性，建立新的实验体系可能需要耗费较多时间和资源。本文现提供一种简便的实验方案，有助于避免IVM中的常见错误。同时，本文还将讨论其局限性，并在适用情况下介绍互补的研究方法。

提睾肌的活体显微成像（IVM）是炎症与感染研究领域理想的实施方法。更具体而言，在炎症性疾病背景下研究骨骼肌生物学的科研人员可能会对提睾肌模型产生浓厚兴趣。

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方案

动物在德国海德堡的跨学科生物医学研究机构（IBF）的受控且无特定病原体的环境中饲养。本文所述所有实验程序均经当地机构审查委员会及德国巴登-符腾堡州卡尔斯鲁厄政府地区委员会批准。

1. 麻醉给药

  1. 通过腹腔（i.p.）推注125 mg/kg的氯胺酮和12.5 mg/kg的赛拉嗪，使小鼠麻醉。
  2. 将小鼠仰卧位固定于加热垫上，以维持其体温（36.5–38 °C）。使用不可吸收的无菌缝线（6/0）在门齿周围缠绕成一个简单的环形结扎，并将缝线两端粘贴固定在加热垫上。此固定方式旨在保持小鼠口腔张开，避免呼吸受阻。
  3. 通过趾间夹捏测试检查小鼠麻醉深度（不应出现回缩反应）。
  4. 当达到足够麻醉深度后，开始手术准备。在实验过程中每30分钟重复确认一次麻醉状态；若需要，按上述剂量追加药物。
  5. 用5% CO2/95% N2气体平衡生理盐溶液（PSS，成分为132 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、1.2 mmol/L MgSO4、2.0 mmol/L CaCl2、18 mmol/L NaHCO3）15分钟。在整个实验过程中持续以5% CO2/95% N2气体鼓泡维持PSS，并保持温度为37 °C。

2. 气管和颈动脉的手术准备（可选）

  1. 用镊子在颈部中线处轻轻牵拉皮肤，从颈部区域进行解剖。使用剪刀做一直径为 1-2 cm 的环形切口，以提供足够的手术准备空间。
  2. 使用镊子仔细解剖颈动脉周围的肌肉、脂肪和结缔组织。
  3. 用小型手术剪刀在气管上做一横向切口（约 1.3 mm），并将一根聚乙烯导管（内径 × 外径 0.034" × 0.050"）插入气管的尾端，以确保上呼吸道通畅。
  4. 用单圈结缝合线（6/0 USP）固定插入气管内的导管。
  5. 沿气管右侧定位颈动脉，并解剖颈动脉壁周围的组织。也可选择使用颈外静脉或尾静脉建立静脉通路。操作时应尽量避免损伤邻近的迷走神经。
  6. 将两根缝合线（6/0）从颈动脉下方穿过。第一根缝合线置于近端，靠近颈动脉分叉处，并永久结扎。第二根缝合线置于第一根远端约 5-8 mm 处，用于后续固定颈动脉内的导管，暂不结扎。
  7. 准备一根长度为 30 cm 的聚乙烯导管（内径 × 外径 0.011" × 0.024"），将其末端弯曲后连接至装有生理盐水（0.9% NaCl）的 1 mL 注射器针头。充分冲洗导管至关重要，可防止制备过程中发生空气栓塞。
  8. 使用 7 mm 血管夹在第二根缝合线远端夹闭颈动脉。
  9. 在颈动脉上做一小的横向切口（约 0.5 mm），插入无菌聚乙烯导管，并使用之前准备好的第二根缝合线固定导管。
  10. 移除血管夹，轻轻牵拉连接至聚乙烯导管的注射器，施加轻微张力。该颈动脉导管现可用于给药或采集血样，必要时还可借助相应设备监测血压或脉率。

3. 提睾肌的手术准备

  1. 将小鼠连同加热垫一起转移到用于后续显微镜观察的定制塑料支架上，并调整小鼠体位，使其阴囊朝向显微镜载物台。
    1. 在继续操作前重新评估麻醉深度；如有需要，追加四分之一至一半剂量的麻醉剂。
  2. 定位阴囊，用镊子夹住其最远端，轻轻拉起，用剪刀切除直径约5 mm的圆形阴囊皮肤。注意避免损伤下方结构（如提睾肌）。确保切口组织始终用生理盐水充分润湿。
  3. 使用两把镊子分离疏松结缔组织，暴露两侧睾丸。
  4. 远端夹持一侧睾丸，轻柔地逐步将其拉出，同时逐步去除周围结缔组织。
  5. 当睾丸完全外翻后，将其远端固定在载物台周围的橡胶环上。在整个外翻过程中，持续用生理盐水润湿组织。
  6. 关键步骤：小心去除结缔组织，避免损伤下方的提睾肌。残留过多结缔组织可能阻碍后续显微镜观察，导致图像模糊。
  7. 将睾丸远端固定，用横向小切口（约1 mm）切开提睾肌，随后从远端至近端做纵向切口，使提睾肌呈球形展开。不应切断肉眼可见的血管，以免影响血流动力学。
  8. 小心将肌肉在玻璃载物台上展开，并固定于橡胶环上。注意避免触碰或损伤中央区域，因该区域将用于显微成像。
    注意：过度牵拉可能阻碍血流。
  9. 将另一侧未使用的睾丸移至旁边，以便暴露感兴趣区域。需反复用PSS溶液润湿组织，防止干燥。此时安装好的肌肉组织已准备好进行显微镜观察。

4. 活体显微成像

  1. 将固定好的提睾肌置于直立显微镜中，使用40倍物镜进行显微观察。
  2. 通过高通量成像光谱技术采集并导出数据。
  3. 在持续灌流预热（35–37 °C）的PSS17条件下进行记录。通过一根固定在显微镜直立物镜上的细导管进行灌流，使PSS沿物镜持续滴加至肌肉组织表面。
  4. 识别后微静脉（两条较小血管汇合处），并对直径为20–40 μm的微静脉测量微循环情况。
  5. 在30秒的时间范围内记录提睾肌微循环的高分辨率图像。由于记录过程中肌肉组织可能出现轻微的收缩与舒张，需持续调整焦距。通常情况下，小鼠的血液循环可稳定维持约2小时。可从不同区域获取多个不同血管的记录。随后可使用一个或两个睾丸进行实验。
    注意：由于该模型用于研究炎症，常见的诱导方法包括：全身性给予或局部阴囊注射促炎介质，以及通过灌流施加例如N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP）等物质。局部TNF-α刺激常用于诱导白细胞募集；LPS诱导的内毒素血症则是严重全身性炎症反应综合征（SIRS）的常用模型。

5. 白细胞可视化

注意：黏附和滚动的白细胞无需进一步显影即可清晰观察。为测定自由移动白细胞的中心线流速，需进行差异染色。

  1. 若使用 eGFP 标记的小鼠，可直接通过荧光显微镜进行分析。
  2. 对于非 eGFP 标记的小鼠品系，使用罗丹明染色。
    1. 以 0.2 mg/kg 体重剂量给予罗丹明 6G。可能需要重复给药以达到足够的染色强度。注意保持较小的给药体积，因为较大体积可能影响血流动力学参数。
    2. 如需快速染色白细胞，可通过颈动脉给予染料。若未进行颈动脉分离，也可采用相同剂量腹腔注射，通常可达到足够的染色效果18。作为颈动脉插管的替代方案，也可进行其他任何静脉插管。
      注意：需注意罗丹明染色与 eGFP 标记不同，其荧光强度会随时间衰减，且在较高浓度下白细胞总体染色率最高约为 80%。
    3. 通过荧光显微镜观察自由移动的罗丹明染色白细胞。

6. 实验结束

注意：执行本方案的总预计时间为 90 – 150 分钟。

  1. 通过颈椎脱位实施安乐死，结束实验。
  2. 如需进行进一步分析（例如跨膜迁移实验），在仍将 cremaster 肌肉固定于载物台并保持拉伸状态时，用 PFA 固定，并根据需要进行组织学染色。

7. 离线分析

  1. 在视频回放期间，将以下参数作为简单计数进行分析。
    1. 计算滚动通量 [个/min]：每分钟通过假想线的滚动细胞数量
    2. 计算黏附量 [个/mm2]：在视野内黏附于血管壁持续 ≥ 30 秒的细胞数量/血管表面积 [mm2]
  2. 使用 ImageJ 测量以下血流动力学和微血管参数。
    1. 将血管直径 [µm] 计算为血管内壁直径
    2. 将血管长度 [µm] 计算为血管中心线长度
    3. 通过中心线上自由移动的白细胞的逐帧视频分析，获得中心线流速 figure-protocol-1
  3. 使用以下公式进行估算。
    1. 计算血管表面积 [mm2]：血管长度 [µm] × 血管直径 [µm] × π × 10-6
    2. 计算管壁剪切速率 figure-protocol-2：4.9 × (8 × 中心线流速 figure-protocol-3 × 0.625 / 血管直径 [µm])
    3. 计算平均血流速度 figure-protocol-4：中心线流速 figure-protocol-5 × 0.625
    4. 计算总白细胞通量 figure-protocol-6：系统性白细胞计数 figure-protocol-7 × (平均血流速度 figure-protocol-8 × 60 / 1000) × π × figure-protocol-9
    5. 计算滚动通量分数 [%]：滚动通量 / 总白细胞通量 × 100

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结果

按照所提供的实验方案进行活体显微成像（IVM），将有助于深入理解白细胞在骨骼肌中募集过程的级联反应。结果部分将重点介绍通过IVM获得的典型结果，并指出可能遇到的潜在问题。

活体显微镜实验装置的示意图见图1。制备提睾肌并去除结缔组织是获得聚焦清晰、表面均匀的显微图像的关键步骤。在进行活体显微镜检查（IVM）时，残留过多的结缔组织最终会导致显微图像模糊（补充视频1）。图2展示了使用IVM可获得的代表性显微图像。首先，通过两条较细血管汇合处识别后微静脉，其直径应在20–40 µm之间。仅能观察到黏附和滚动的白细胞，循环中的白细胞只能通过回放录制视频的慢动作进行追踪。黏附白细胞的数量定义为在30秒时间内保持静止的白细胞数，以每mm2血管表面积上的数量表示（图2）。滚动白细胞的数量通过统计经过预先定义血管横截面的细胞数来确定；滚动速度可在离线分析中获得。滚动可...

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讨论

活体显微成像（IVM）作为一种方法，已被广泛用于研究不同器官中的多种细胞类型，并已有大量文献对其进行详细描述和讨论19。本研究的主要目的是提供一种高效的方法，用于在提睾肌中建立并实施IVM。熟练掌握该技术将产生可靠且可重复的实验结果。因此，周密的规划与标准化操作是掌握该技术的关键。尤为重要的是，该技术高度依赖于血流动力学和微血管参数，这些参数必须被严密监测和控制。因此，不同组之间的血流动力学差异可能导致误导性的结果。

尽管活体显微镜（IVM）在研究生理和病理状态中具有重要作用，但仅靠IVM可能无法完全揭示特定细胞类型在炎症过程中对白细胞募集的独立贡献。为此，可将IVM与其他互补方法结合使用。例如，离体（ex vivo）方法如流式腔实验可用于区分内皮细胞或白细胞各自的作用。此外，流动腔装置是将啮齿类动物的研究结果转化为人类白细胞研究的优良平台，例如在新生儿中的应用20。此外，体外（in vitro）方法如流式细胞术（FACS）或免疫组织化学也应作为IVM实验的补充。每种方法均可在干扰因素较...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由德国联邦教育与研究部（BMBF）资助，项目编号为01GL1746E，属于PRIMAL联盟项目的一部分。作者感谢Britta Heckmann和Silvia Pezer提供的娴熟技术协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
材料
Ketanest SPfizer Pharma GmbHPZN: 08509909麻醉剂。通用名/IUPAC名称：ketamine
XylazineCP-Pharma GmbH货号：1205 麻醉剂。通用名/IUPAC名称：xylazine (盐酸盐形式)
生理盐水溶液B. Braun Melsungen PZN 02737756手术准备。通用名/IUPAC名称：sodium chloride
Omnican F 注射器针头B. Braun Melsungen 目录号 9161502手术准备 
6/0 USP 缝合线Resorba目录号 4217手术准备 
聚乙烯导管 #10 BD GmbH供应商编号 427401手术准备 
聚乙烯导管 #90 BD GmbH供应商编号 427421手术准备 
Rhodamine 6GSigma-Aldrich Chemie GmbHCAS 编号 989-38-8 白细胞染色。通用名/IUPAC名称：ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate
实验设备
正置显微镜 Olympus BX51W1显微成像
40倍物镜 ZeissAchroplan 40 × /0.80 W显微成像
ImSpector 软件Lavision Biotec GmbH版本 4.0.469软件
ImageJ美国国立卫生研究院（National Institute of Health, USA）版本 1.51j8软件

参考文献

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  19. Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
  20. Nussbaum, C., et al. Neutrophil and endothelial adhesive function during human fetal ontogeny. Journal of Leukocyte Biology. 93 (2), 175-184 (2013).

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