通过活体显微镜评估小鼠 cremaster 肌肉中的白细胞浸润

摘要

本文展示了如何对小鼠提睾肌的毛细血管后微静脉进行活体显微观察。该技术常用于研究不同类型的炎症和脓毒症模型，尤其是由趋化因子和细胞因子诱导的模型，本文强调了其在研究伴有显著肌肉白细胞浸润的肌病中的重要性。

摘要

活体显微镜（IVM）被广泛用于在体内监测白细胞募集级联中的生理和病理生理过程。本方案提供了一种实用且可重复的方法，用于在完整小鼠机体内的骨骼肌来源组织中可视化白细胞与内皮细胞的相互作用，从而实现白细胞的募集。该模型适用于所有关注粒细胞活化及其在疾病中作用的研究领域。

我们提供了一步一步的实验方案，以指导该方法的实施，并强调其中可能存在的陷阱和技术难点。本方案涵盖以下方面：实验设置与所需材料、小鼠麻醉、提睾肌解剖、气管插管与颈动脉插管、活体显微成像（IVM）记录及离线数据分析。文中详细解释了黏附白细胞、滚动通量（RF）和滚动通量分数（RFF）等数据格式，并讨论了其适当的应用场景。结果部分展示了来自肌营养不良蛋白缺陷型 mdx 小鼠的代表性实验结果。

体内显微镜技术（IVM）是一种用于评估活体环境下白细胞募集的有力工具；然而，若需明确区分内皮细胞与白细胞的功能，则可能需要结合离体实验系统，例如流动腔实验。此外，目标动物的遗传背景可能显著影响基础水平的细胞募集，因此需要对所提供的实验方案进行个体化的精细调整。尽管存在这些局限性，IVM仍可作为将体外研究结果快速转化至活体脊椎动物中的平台。

引言

活体显微镜（IVM）是白细胞生物学领域中常用的研究工具。白细胞募集遵循一系列明确定义的级联事件，起始于白细胞被捕获、沿血管内皮滚动并黏附于内皮壁，最终穿过血管壁迁移至炎症实际发生部位¹。每个步骤均由多种趋化因子（如IL-8/CXCL8）、受体（如LFA-1、Mac-1）以及相应的内皮细胞黏附分子（如ICAM-1、VCAM-1和E-选择素）介导并调控^2,3。通过IVM技术，研究人员已揭示了调控白细胞募集级联反应中不同调节位点、控制因子及介质之间的相互作用，例如晚期糖基化终产物受体（RAGE）、细胞间黏附分子1（ICAM-1）、C-X-C基序配体（CXCL）1/2及其受体CXCR2的作用机制^4,5,6,7,8,9。

体内显微成像（IVM）方法已被描述用于多种不同的器官和组织，例如肠道¹⁰

方案

动物在德国海德堡的跨学科生物医学研究机构（IBF）的受控且无特定病原体的环境中饲养。本文所述所有实验程序均经当地机构审查委员会及德国巴登-符腾堡州卡尔斯鲁厄政府地区委员会批准。

1. 麻醉给药

1. 通过腹腔（i.p.）推注125 mg/kg的氯胺酮和12.5 mg/kg的赛拉嗪，使小鼠麻醉。
2. 将小鼠仰卧位固定于加热垫上，以维持其体温（36.5–38 °C）。使用不可吸收的无菌缝线（6/0）在门齿周围缠绕成一个简单的环形结扎，并将缝线两端粘贴固定在加热垫上。此固定方式旨在保持小鼠口腔张开，避免呼吸受阻。
3. 通过趾间夹捏测试检查小鼠麻醉深度（不应出现回缩反应）。
4. 当达到足够麻醉深度后，开始手术准备。在实验过程中每30分钟重复确认一次麻醉状态；若需要，按上述剂量追加药物。
5. 用5% CO₂/95% N₂气体平衡生理盐溶液（PSS，成分为132 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、1.2 mmol/L MgSO₄、2.0 mmol/L CaCl₂、18 mmol/L NaHCO₃）15分钟。在整个实验过程中持续以5% CO₂/95% N₂气体鼓泡维持PSS，并保持温度为37 °C。

结果

按照所提供的实验方案进行活体显微成像（IVM），将有助于深入理解白细胞在骨骼肌中募集过程的级联反应。结果部分将重点介绍通过IVM获得的典型结果，并指出可能遇到的潜在问题。

活体显微镜实验装置的示意图见图1。制备提睾肌并去除结缔组织是获得聚焦清晰、表面均匀的显微图像的关键步骤。在进行活体显微镜检查（IVM）时，残留过多的结缔组织最终会导致显微图像模糊（补充视频1）。图2展示了使用IVM可获得的代表性显微图像。首先，通过两条较细血管汇合处识别后微静脉，其直径应在20–40 µm之间。仅能观察到黏附和滚动的白细胞，循环中的白细胞只能通过回放录制视频的慢动作进行追踪。黏附白细胞的数量定义为在30秒时间内保持静止的白细胞数，以每mm²血管表面积上的数量表示（图2）。滚动白细胞的数量通过统计经过预先定义血管横截面的细胞数来确定；滚动速度可在离线分析中获得。滚动可.......

讨论

活体显微成像（IVM）作为一种方法，已被广泛用于研究不同器官中的多种细胞类型，并已有大量文献对其进行详细描述和讨论¹⁹。本研究的主要目的是提供一种高效的方法，用于在提睾肌中建立并实施IVM。熟练掌握该技术将产生可靠且可重复的实验结果。因此，周密的规划与标准化操作是掌握该技术的关键。尤为重要的是，该技术高度依赖于血流动力学和微血管参数，这些参数必须被严密监测和控制。因此，不同组之间的血流动力学差异可能导致误导性的结果。

尽管活体显微镜（IVM）在研究生理和病理状态中具有重要作用，但仅靠IVM可能无法完全揭示特定细胞类型在炎症过程中对白细胞募集的独立贡献。为此，可将IVM与其他互补方法结合使用。例如，离体（ex vivo）方法如流式腔实验可用于区分内皮细胞或白细胞各自的作用。此外，流动腔装置是将啮齿类动物的研究结果转化为人类白细胞研究的优良平台，例如在新生儿中的应用²⁰。此外，体外（in vitro）方法如流式细胞术（FACS）或免疫组织化学也应作为IVM实验的补充。每种方法均可在干扰因素较.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
Ketanest S	Pfizer Pharma GmbH	PZN: 08509909	麻醉剂。通用名/IUPAC名称：ketamine
Xylazine	CP-Pharma GmbH	货号：1205	麻醉剂。通用名/IUPAC名称：xylazine (盐酸盐形式)
生理盐水溶液	B. Braun Melsungen	PZN 02737756	手术准备。通用名/IUPAC名称：sodium chloride
Omnican F 注射器针头	B. Braun Melsungen	目录号 9161502	手术准备
6/0 USP 缝合线	Resorba	目录号 4217	手术准备
聚乙烯导管 #10	BD GmbH	供应商编号 427401	手术准备
聚乙烯导管 #90	BD GmbH	供应商编号 427421	手术准备
Rhodamine 6G	Sigma-Aldrich Chemie GmbH	CAS 编号 989-38-8	白细胞染色。通用名/IUPAC名称：ethyl 2-[3-(ethylamino)-6-ethylimino-2,7-dimethylxanthen-9-yl]benzoate
实验设备
正置显微镜	Olympus	BX51W1	显微成像
40倍物镜	Zeiss	Achroplan 40 × /0.80 W	显微成像
ImSpector 软件	Lavision Biotec GmbH	版本 4.0.469	软件
ImageJ	美国国立卫生研究院（National Institute of Health, USA）	版本 1.51j8	软件