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方法文章

腹主动脉瘤小鼠模型中脉搏传播速度、可扩张性和应变的测量

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DOI：

10.3791/60515

⸱

2020年2月23日

 ,  ,  , 
1Division of Cardiovascular Medicine, University of Missouri, 2Medical Pharmacology and Physiology, University of Missouri, 3Dalton Cardiovascular Research Center, University of Missouri

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了一种利用高频超声成像技术在腹主动脉瘤小鼠模型上测量管腔直径、脉搏传播速度、可扩张性和径向应变的详细实验方案。

摘要

腹主动脉瘤（AAA）是指腹主动脉局部扩张，其最大管腔内径（MILD）超过原始尺寸的1.5倍。临床和实验研究表明，小型动脉瘤也可能发生破裂，而部分大型动脉瘤则可能保持稳定。因此，除了测量主动脉的管腔内径外，了解血管壁的结构特征可能为评估AAA的稳定性提供重要信息。近年来，主动脉僵硬度的增加已成为检测血管壁早期变化的可靠指标。脉搏波传导速度（PPV）、可扩张性及径向应变是基于超声的常用方法，可用于评估主动脉僵硬度。本方案的主要目的是提供一套完整的技术流程，利用超声成像系统获取图像，并分析由MILD、PPV、可扩张性和径向应变所确定的主动脉结构与功能特性。

引言

腹主动脉瘤（AAA）是一种重要的心血管疾病，其特征是主动脉发生永久性局部扩张，扩张程度超过原始血管直径的1.5倍1。AAA位居美国死亡原因的第13位2。AAA的进展归因于主动脉壁的退化和弹性蛋白的断裂，最终导致主动脉破裂。这些主动脉壁的改变可能在最大管腔内直径（MILD）无明显增加的情况下发生，提示仅凭MILD不足以预测疾病的严重程度3。因此，需要识别其他因素以检测主动脉壁的早期变化，从而指导早期治疗方案的选择。本实验方案的总体目标是提供一种利用超声成像评估主动脉功能特性的实用指南，具体通过测量脉搏传播速度（PPV）、可扩张性和径向应变来表征主动脉功能。

一种经过充分表征的腹主动脉瘤（AAA）实验模型，最初由 Daugherty 及其同事描述，该模型通过在 Apoe-/- 小鼠中使用渗透压泵皮下输注血管紧张素 II（AngII）来诱导 AAA4。利用超声成像对最大内径（MILD）进行精确测量，对于表征该小鼠模型中的 AAA 具有重要作用5。尽管 AAA 发展过程中的组织学变化已被广泛研究，但血管壁功能特性（如主动脉僵硬度）的变化尚未得到充分表征。本实验方案强调将高频超声与先进分析方法相结合，作为研究 AAA 时间进程的有力工具。具体而言，这些方法使我们能够评估血管壁的功能特性，包括脉搏波速度（PPV）、可扩张性及径向应变。

近期在 AAA 患者以及小鼠弹性蛋白酶诱导的 AAA 模型中的临床研究表明，主动脉硬度与主动脉直径之间存在正相关关系6,7。脉搏波传导速度（PPV）作为主动脉硬度的指标，被公认为是量化血管壁硬度变化的优良测量方法6,8。PPV 通过测量脉搏波在血管系统两个不同位置之间的传播时间来计算，从而提供对主动脉硬度的区域性评估。我们最近的研究表明，通过 PPV 测量所得的主动脉硬度增加，以及在细胞水平上利用原子力显微镜所确定的硬度增加，均与动脉瘤的发展呈正相关9。此外，文献提示，主动脉硬度的增加可能早于动脉瘤样扩张，因此可能在腹主动脉瘤（AAA）发展过程中提供有关血管壁区域内在特性的有用信息10。类似地，扩张性和应变测量是用于评估动脉功能早期变化的量化工具。健康的动脉具有良好的柔韧性和弹性，而当硬度增加、弹性降低时，其扩张性和应变能力则下降。本文中，我们提供了一套实用指南及逐步操作方案，介绍如何使用高频超声系统在小鼠中测量 MILD、PPV、扩张性及径向应变。该方案提供了技术性操作方法，应与特定超声成像仪器使用手册所提供的基本说明以及配套的视频教程结合使用。重要的是，由我们实验室实施的该成像方案可获得可重复且准确的数据，这些数据在实验性 AAA 发生与发展研究中具有重要价值。

为了进一步展示超声成像的应用价值，我们提供了来自本实验室研究的示例图像和测量数据，这些研究旨在探索采用药理学方法预防实验性腹主动脉瘤（AAA）的可行性11。具体而言，Notch 信号通路被认为参与了血管发育和炎症反应的多个方面12。我们先前通过基因单倍剂量不足和药理学手段证实，抑制 Notch 信号可减少小鼠腹主动脉瘤的形成，其机制是阻止巨噬细胞在血管损伤部位的浸润13,14,15。在本研究中，我们采用药理学方法抑制 Notch 信号，重点探讨主动脉僵硬度与腹主动脉瘤相关因素之间的关系。这些结果表明，Notch 抑制可降低主动脉僵硬度，而主动脉僵硬度是评估腹主动脉瘤进展的一项指标11。

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方案

小鼠处理与超声成像的实验方案已获得密苏里大学机构动物护理与使用委员会（动物实验编号 8799）的批准，并依照 AAALAC International 的规定进行。

1. 仪器设备设置与小鼠准备

  1. 仪器设置
    1. 打开超声仪器、超声耦合剂加热器和加热垫。
    2. 启动超声程序，并输入每只小鼠的研究名称和描述性信息。
    3. 选择应用模式为 General Imaging。
    4. 选择适用于腹部成像的换能器（图 1B,C）。本实验中使用 MS400 换能器。
    5. 确保每次实验过程中异氟烷和氧气的水平充足。
    6. 清洁超声动物成像平台。
  2. 小鼠准备
    1. 将小鼠笼置于加热垫上（36.5 至 38.5 °C）。
    2. 轻轻抓住小鼠尾根部，将其放入充满氧气的异氟烷诱导室中。
    3. 将异氟烷和氧气气流导向诱导室。
    4. 打开异氟烷蒸发器，将异氟烷浓度设为 1–2% vol/vol；打开氧气瓶，调节氧气流速至 1–2 L/min。
    5. 约 2 分钟后，通过轻捏小鼠足垫观察是否出现回缩反射，以确认麻醉深度足够。
    6. 随后，关闭诱导室供气支路，打开通向麻醉鼻罩的支路。
    7. 将小鼠从诱导室转移至超声成像台，并将麻醉鼻罩罩住动物鼻部。
    8. 将动物成像平台向右下角倾斜约 10°，以获得最佳扫描角度（图 1B）。
    9. 在小鼠双眼各滴一滴无菌眼用溶液，防止麻醉期间角膜干燥。
    10. 将小鼠置于仰卧位，鼻部插入麻醉鼻罩中。
    11. 使用棉签在四只脚掌上涂抹电极凝胶，并用胶带将脚掌固定在动物成像平台的铜导联上，用于心电图监测（图 1C）。
    12. 使用电推剪剃除成像区域的毛发，然后涂抹脱毛膏以清除残留毛发，停留时间少于 1 分钟。
    13. 用湿润的纸巾轻轻擦去脱毛膏和残留毛发。
    14. 监测小鼠呼吸，确保心率维持在 450–550 次/分钟之间。若心率低于此范围，应降低异氟烷流量，并等待心率恢复。
    15. 在准备好的皮肤区域涂抹预热的超声耦合剂（37 °C），将换能器安装至支架并缓慢放下，直至接触耦合剂（图 1C）。

2. 腹主动脉的超声成像

  1. 将换能器水平放置（即垂直于小鼠的中线）。
  2. 使用棉签的木棒部分抹平超声耦合剂，并去除气泡。
  3. 降低换能器，在接触耦合剂后将其置于膈肌下方 0.5 - 1 cm 处。此时开始观察图像。
  4. 在短轴切面下观察腹主动脉（图 1C）。
    注意：B 模式是解剖定位主动脉和调整换能器位置的默认且最有效的模式。在短轴切面（即主动脉的周向横截面）下，通过彩色多普勒和能量多普勒模式观察到搏动性血流即可识别腹主动脉。调节动物载物台和换能器上的微调装置，使主动脉横截面位于图像中心。
  5. 轻轻将换能器顺时针旋转 90°，并缓慢调节 x 轴微调旋钮，以在长轴切面（主动脉的纵向切面）下观察主动脉。
    注意：在许多情况下，胃肠道气体可能干扰图像，或主动脉角度不理想，导致无法获得清晰的长轴图像。缓慢且水平地调节换能器角度，直至获得可接受的长轴切面图像。若问题持续存在，可抬高换能器，检查其下方是否有气泡，轻微调整动物载物台的倾斜角度，重新涂抹耦合剂，并重复所有步骤。
  6. 分别使用聚焦区域和聚焦深度切换按钮，将聚焦区域和深度设置在主动脉所在位置。手动调节时间增益补偿滑块，使主动脉管腔变暗，以获得主动脉壁的最佳对比度。
  7. 调节y 轴操纵器，以观察肠系膜上动脉和右肾动脉的分支点。以右肾动脉为解剖标志，获取肾上主动脉的图像（图 2A）。
  8. 记录至少 100 帧肾上主动脉的 B 模式图像。
  9. 按下 cinestore 键以保存 B 模式图像。
  10. 按下仪器键盘上的M 模式按钮以启用 M 模式记录。滚动轨迹球，将黄色指示线移至血管壁图像清晰的正常主动脉节段，或移至观察到动脉瘤最大直径的节段。
  11. 按下SV/门控切换按钮，并调节轨迹球，确保测量括号包含血管壁。按下更新以记录 M 模式测量值，并按下cinestore进行保存（图 2A,B）。
    注意：动脉瘤的最大直径可能不在主动脉最佳长轴切面的同一成像平面。每次进行 M 模式测量时，轻微调节 x 轴操纵器旋钮，以确保捕获每个节段的最小内径（MILD）。
  12. 为获取心电门控千赫兹可视化（EKV）图像，请按下B 模式按钮返回 B 模式记录。
    注意：如果图像不够清晰，调节 x 轴操纵器，使管腔上壁在一段长度上（即 > 6 mm）呈现最清晰的图像。
  13. 按下键盘上的生理参数设置按钮，并选择呼吸门控。手动调节门控的延迟和窗口，仅在呼吸波形较平坦的部分记录数据。记录段将在呼吸波形轨迹上以彩色块显示。
    注意：若未调整呼吸门控，由于动物呼吸时的正常运动，EKV 图像将变得模糊。
  14. 按下EKV 按钮以启用 EKV 模式。在相应菜单中选择标准 分辨率和帧率 3000 或更高。选择“继续”以记录EKV 图像。按下cinestore保存图像。使用 EKV 模式图像获取脉搏传播速度（PPV）、可扩张性和径向应变的测量值。
    注意：若呼吸出现异常波动、动物呼吸过快或帧率设置过高，EKV 记录可能失败。在此类情况下，应降低帧率，并等待动物呼吸稳定。通常，将帧率设为 3000 对小鼠和大鼠均合适。

3. 成像后步骤

  1. 用温水浸湿的纸巾轻轻擦去小鼠腹部的超声耦合剂。
  2. 将小鼠放回其饲养笼中，并置于加热垫上。
  3. 关闭异氟烷麻醉机，使用湿润的擦拭纸清洁动物成像平台和探头。
  4. 将超声扫描过程中采集的图像数据转移至硬盘。
  5. 关闭超声仪器。
  6. 待小鼠从麻醉状态恢复并清醒后，移除加热垫并将笼子放回动物饲养架。

4. 腹主动脉影像分析

  1. 利用M型图像分析测量主动脉内径（MILD）
    1. 打开超声程序，输入每只小鼠的研究名称及相关描述信息。
    2. 在分析软件中打开超声数据，调出M型图像并暂停心跳图像。
    3. 点击 测量（Measurements）。
    4. 从下拉选项中选择 血管分析模块（vascular package）。点击 Depth，然后在主动脉管腔内从一侧内壁到对侧内壁画一条直线（图2C,D）。
      注意：为保持一致性，应在心动周期的收缩期（主动脉扩张最明显时）进行测量。在三个不同的心动周期中各画一条线，以获得准确且平均的MILD测量值。对于腹主动脉瘤（AAA），应在主动脉最大扩张处进行测量。建议在图像采集前禁食动物4–6小时，以避免肠道蠕动干扰并确保图像清晰度。
  2. 脉搏波传导速度（PPV）分析
    1. 打开EKV图像并暂停心跳。
    2. 点击名称图标，在分析软件（例如Vevo Vac）中打开一个新窗口。
    3. 点击 PPV选项（PPV option）（见 图3D 中箭头所示），将弹出一个小窗口，显示主动脉图像。
    4. 通过点击血管上壁并拖动指针约4 mm，绘制一个覆盖腹主动脉上方双侧管壁的矩形框。
      注意：所有图像中矩形框的长度应保持一致（约4 mm）。用户可通过旋转调整矩形框方向，并选择线条后拖动至待分析血管的合适位置，以获得最清晰准确的脉搏波转折点。矩形框提取的数据垂直线将在感兴趣区域（ROI）中标记为左侧（上图）和右侧（下图）。为更清晰地观察脉搏波转折点，有时可仅在上壁绘制矩形框（如 图3 所示）。软件将自动计算PPV（m/s）。但建议手动调整紫色标线，以精确定位脉搏波上的转折点，PPV值将随之更新。
    5. 最后，选择 接受（Accept） 命令以保存PPV数值，并将图像和数据导出至数据存储设备。
  3. 扩张性与径向应变分析
    1. 打开EKV图像并暂停心跳。
    2. 点击软件图标，软件将打开一个新窗口。
    3. 点击 新建感兴趣区域轨迹（trace new ROI），并在血管双侧管壁上绘制一个矩形框。软件将自动追踪血管的上壁和下壁。用户可通过点击绿色标记点来调整轨迹，使其与管壁对齐（见 图4A,B）。
    4. 确认轨迹后点击接受。软件将自动计算所选感兴趣区域内的扩张性（1/Mpa）。
    5. 进行径向应变测量时，从左上角菜单栏中选择相应的应变分析选项，径向应变和切向应变图像将随之打开。
    6. 将光标移至曲线峰值处，获取径向应变（%）数值。将数据以图像或视频格式导出（见 图4A,B）。

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结果

正常小鼠和腹主动脉瘤小鼠的代表性M型图像分别如图2A和图2B所示。肾上腹主动脉可通过其位于右肾动脉和肠系膜上动脉旁的位置进行识别（图2A）。用于计算MILD的代表性图像分别显示了正常和瘤变主动脉在收缩期心动周期三个不同心跳时相的图像（图2C,D）。当腹主动脉瘤形成时，管腔直径通过在最大扩张区域的管腔内缘之间绘制一条垂直的黄色线来确定（图2B）。通常取三次独立测量的平均值以获得准确的管腔内径。

用于分析脉搏波传导速度（PPV）的腹主动脉代表性EKV图像见图3。PP...

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讨论

超声成像通过测量脉压变异性（PPV）、扩张性和径向应变，为评估主动脉功能特性提供了一种强有力的技术。这些测量指标对于研究腹主动脉瘤（AAA）的小鼠模型尤其具有指导意义，体内检测方法可获取纵向数据，有助于理解主动脉病变随时间发展的过程。具体而言，通过分析EKV数据，在腹主动脉局部测定体内主动脉僵硬度，包括PPV、扩张性和径向应变，这些参数被视为AAA不稳定性的独立危险因素16。本实验方案所述技术相对简便，每只小鼠获取图像集仅需8至10分钟。所有图像最好由同一名操作人员采用明确定义且一致的解剖标志进行采集，以生成可重复且精确的数据。

这些工具的应用中存在一些需要专业技术的因素。例如，第一，脉搏波速度（PPV）可能无法完全反映局部动脉壁腹主动脉瘤（AAA）的发展程度，因为它是区域动脉僵硬度的间接测量指标。第二，如果内膜壁受损，则准确测量PPV可能会变得困难。第三，若缺乏仪器操作经验，可能难以获得高分辨率的清晰图像。在近期版本的超声成像系统中，部分上述问题已得到改善，这些系统在减少散斑噪声和伪影的同时，保留并增强了小动物研究中的数据采集能力。...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由 R01HL124155（CPH）以及密苏里大学研究所对 CPH 的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
血管紧张素 IISigmaA9525
Apoe-/- 小鼠杰克逊实验室figure-materials-1
剪刀WAHL1854
棉签棉签
DAPTSigmaD5942
脱毛膏NairLL9038
电极膏Sigma17-05
凝胶加热器Thermasonic（Parker）82-03（LED）
加热垫StrykerT/pump 专业版
异氟烷VetOneFluriso TM
异氟烷蒸发器VisualsonicsVS4244
润滑性眼膏Lacri-lube
渗透泵AlzetModel 2004
氧气瓶空气气体
换能器VisualsonicsMS-400 或 MS550D
超声耦合剂ParkerAquasonic 透明
超声成像系统VisualsonicsVevo 2100
Vevo Vasc 软件Visualsonics

参考文献

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