本文描述了在流感病毒感染小鼠模型中评估Tfh和生发中心B细胞反应的实验方案。
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方法文章
小鼠甲型流感病毒感染期间滤泡辅助性T细胞与生发中心反应的评估
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
滤泡辅助性T细胞（Tfh）是一类独立的CD4+ T细胞亚群，其主要功能是促进生发中心（GC）的形成以及高亲和力抗体的产生。在流感病毒感染过程中，会诱导产生强烈的Tfh细胞和GC B细胞应答，从而有效清除病毒，因此该模型为研究Tfh细胞相关功能提供了理想的实验小鼠模型。本文描述了在流感病毒感染小鼠模型中检测Tfh细胞相关基础免疫应答的实验方案，包括：流感病毒的经鼻接种；多克隆及抗原特异性Tfh细胞、GC B细胞和浆细胞的流式细胞术染色与分析；生发中心的免疫荧光检测；血清中流感病毒特异性抗体的酶联免疫吸附试验（ELISA）检测。这些检测方法可基本量化流感病毒感染中Tfh细胞的分化状态与功能，从而为深入研究Tfh细胞的分化机制及调控策略提供技术支持。
引言
近十年来，大量研究聚焦于新发现的CD4+ T细胞亚群——Tfh细胞亚群，因其在生发中心（GC）B细胞发育中发挥关键作用。B细胞淋巴瘤6（Bcl6）主要被视为一种基因抑制因子，是Tfh细胞谱系决定的关键因子，证据表明Bcl6的异位表达足以驱动Tfh细胞分化，而Bcl6缺失则导致Tfh细胞分化消失1,2,3。与其他通过迁移至炎症部位发挥效应功能的CD4+辅助性T细胞亚群不同，Tfh细胞主要在脾脏和淋巴结的B细胞滤泡区为B细胞提供辅助作用。共刺激分子ICOS和CD40L在Tfh细胞与生发中心B细胞的相互作用中发挥重要作用。在Tfh细胞分化过程中，ICOS传递来自同源B细胞的必要信号，同时也作为受体接收旁观者B细胞的迁移信号，从而介导Tfh细胞定位于B细胞区4,5。CD40L是Tfh细胞向B细胞传递增殖和存活信号的重要介质6。另一种功能类似于CD40L的因子是细胞因子IL21，主要由Tfh细胞分泌。IL21直接调控生发中心B细胞的发育及高亲和力抗体的产生，但其在Tfh细胞分化中的作用仍存在争议7
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方案
动物实验已获得中国上海巴斯德研究所机构动物护理和使用委员会的批准。所有实验均依据该委员会批准的动物实验方案进行。
注意：小鼠病毒感染及器官分离操作应在生物安全二级（ABSL2）条件下进行。
1. PR8流感病毒接种及小鼠体重记录
- 在ABSL2实验室中准备8周龄雄性C57BL/6小鼠用于感染实验。
注：本方案同样适用于雌性小鼠实验。 - PR8病毒稀释：将病毒从-80 °C冰箱中取出，置于冰上孵育直至完全融化。充分涡旋混匀原液病毒，然后在预冷的1.5 mL离心管中用无菌磷酸盐缓冲液（PBS，135 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4）将病毒稀释至2 PFU/µL。
- 小鼠麻醉：称量每只小鼠的体重，计算所需戊巴比妥钠（2 mg/mL）的注射体积（注射体积为小鼠体重（g）的4倍，单位为µL）。通过腹腔注射计算所得体积的戊巴比妥钠。
注：此步骤旨在使小鼠呼吸平稳安静，以便准确进行鼻内接种病毒。心跳过快或过慢均提示麻醉不当。此外，建议使用兽用眼膏以防止角膜干燥。 - 鼻内....
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结果
流感病毒感染中鼠类发病特征的表征
流感病毒感染后，小鼠因患病而活动减少且食欲减退，表现为明显的体重下降，这是监测小鼠发病情况的常用指标19如图所示 图1aPR8病毒感染的小鼠从第6天开始体重下降，第8天达到最低水平，第10天恢复至初始水平。正如预期，PBS处理的对照组小鼠在整个观察期间未出现体重下降。在体内症状方面，病毒感染可导致引流淋巴结（本实验中为mLN）中淋巴细胞显著扩增。因此，与对照组小鼠相比，PR8病毒感染小鼠的mLN体积显著增大（图 1b综上所述，这些小鼠均表现出预期的症状，符合后续Tfh相关免疫反应研究的条件。
Tfh 细胞分化及功能相关分子的检测
为分析Tfh细胞分化，分别在感染后第5、7、10和14天.......
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讨论
由于Tfh细胞在辅助B细胞产生高亲和力抗体方面具有特殊作用，其分化机制及调控方法已被广泛研究，以期为疫苗设计提供新策略。流感病毒感染可诱导强烈的Tfh细胞和生发中心B细胞应答，因此是该研究领域的合适模型。本文描述了通过鼻内接种进行流感病毒感染、利用流式细胞术、免疫荧光和ELISA检测Tfh相关应答的实验方案。这些检测方法将有助于研究人员观察Tfh细胞分化、生发中心B细胞发育以及流感病毒特异性抗体的产生，并进一步探索和鉴定免疫应答中的关键分子。
在流感病毒感染小鼠模型的研究中，体重下降是衡量小鼠发病情况的常用指标。流感病毒感染小鼠后预期的体重变化动力学如图1a所示，反映了小鼠体内诱导出的正常免疫应答。然而，实验中常会出现异常情况，例如小鼠体重持续下降或在整个观察期内均未出现体重减轻。根据我们的经验，这些小鼠通常存在异常偏低或偏高的免疫反应，从而干扰实验结果。为避免此类变异，首先应确保实验所用小鼠性别和年龄一致，以保证其对病毒的反应能力相似。每只小鼠接种的病毒滴度保持一致也至关重要21
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披露
作者无任何披露信息。
致谢
我们感谢上海巴斯德研究所流式细胞仪平台、ABSL2 实验室和 SPF 动物实验平台工作人员提供的技术帮助与建议。本工作获得以下基金项目资助：中国科学院战略性先导科技专项（XDB29030103）、国家重点领域研发计划&中国国家重点研发计划（2016YFA0502202）、国家自然科学基金（31570886）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Tfh细胞、NP特异性Tfh细胞及Bcl-6的免疫染色 | |||
| 37% 甲醛 | Sigma | F1635 | |
| 抗小鼠CD16/32抗体 | Thermo Fisher Scientific | 14-0161-86 | |
| APC标记的IAbNP311-325 MHC II类四聚体 | NIH | ||
| Bcl-6 PE | Biolegend | 358504 | 克隆号: 7D1 |
| 生物素标记的CXCR5 | Thermo Fisher Scientific | 13-7185-82 | 克隆号: SPRCL5 |
| CD4 Percp-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-0041-82 | 克隆号: GK1.5 |
| CD44 eVolve 605 | Thermo Fisher Scientifi | 83-0441-42 | 克隆号: IM7 |
| CD44 FITC | Thermo Fisher Scientifi | 11-0441-82 | 克隆号: IM7 |
| CD62L FITC | BD Pharmingen | 553150 | 克隆号: MEL-14 |
| ICOS BV421 | Biolegend | 564070 | 克隆号: 7E.17G9 |
| PD1 PE/Cy7 | Biolegend | 135216 | 克隆号: 29F.1A12 |
| 链霉亲和素 BV421 | BD Pharmingen | 563259 | |
| 链霉亲和素 PE | BD Pharmingen | 554081 | |
| IL21的胞内染色 | |||
| 37% 甲醛 | Sigma | F1635 | |
| 抗人IgG抗体 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-605-098 | |
| 布雷菲德菌素A | Sigma | B6542 | |
| 人Fcγ IL-21受体 | R&D System | ||
| 离子霉素 | Sigma | I0634 | |
| 可固定的活死细胞染色试剂盒（Aqua） | Thermo Fisher Scientific | L34966 | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| 皂苷 | MP | 102855 | |
| 生发中心B细胞和浆细胞染色 | |||
| B220 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0452-81 | 克隆号: RA3-6B2 |
| CD138 PE | BD Pharmingen | 561070 | 克隆号: 281-2 |
| CD95 (FAS) PE/Cy7 | BD Pharmingen | 557653 | 克隆号: Jo2 |
| IgD eFluor 450 | Thermo Fisher Scientific | 48-5993-82 | 克隆号: 11-26c |
| PNA FITC | Sigma | L7381 | |
| 采用ELISA检测HA特异性抗体滴度 | |||
| PR8-HA | Sino Biological | 11684-V08H | |
| BSA | SSBC | ||
| 羊抗小鼠Ig（SBA克隆分型系统-HRP） | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| 羊抗小鼠IgM（SBA克隆分型系统-HRP） | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| 羊抗小鼠IgG1（SBA克隆分型系统-HRP） | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| 羊抗小鼠IgG2b（SBA克隆分型系统-HRP） | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| 羊抗小鼠IgG2c（SBA克隆分型系统-HRP） | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| TMB底物试剂盒 | BD Pharmingen | 555214 | |
| 组织学 | |||
| Alexa Fluor 555标记的羊抗大鼠IgG | Life Technology | A21434 | |
| 抗小鼠IgD抗体 | Biolegend | 405702 | |
| 生物素化PNA | Vector laboratories | B-1075 | |
| 稀释的Alexa Fluor 488标记的链霉亲和素 | Life Technology | S11223 | |
| 正常山羊血清 | SouthernBiotech | 0060-01 | |
| Pro-long gold抗荧光淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | P3630 | |
| 链霉亲和素/生物素封闭试剂盒 | Vector laboratories | SP-2002 |
参考文献
- Johnston, R. J., et al. Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cell....
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重印与许可
