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方法文章

小鼠甲型流感病毒感染期间滤泡辅助性T细胞与生发中心反应的评估

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DOI：

10.3791/60523

⸱

2020年6月27日

 ,  ,  , 
1CAS Key Laboratory of Molecular Virology and Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, 2School of Life Science, University of Science and Technology of China, 3State Key Laboratory of Cell Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了在流感病毒感染小鼠模型中评估Tfh和生发中心B细胞反应的实验方案。

摘要

滤泡辅助性T细胞（Tfh）是一类独立的CD4+ T细胞亚群，其主要功能是促进生发中心（GC）的形成以及高亲和力抗体的产生。在流感病毒感染过程中，会诱导产生强烈的Tfh细胞和GC B细胞应答，从而有效清除病毒，因此该模型为研究Tfh细胞相关功能提供了理想的实验小鼠模型。本文描述了在流感病毒感染小鼠模型中检测Tfh细胞相关基础免疫应答的实验方案，包括：流感病毒的经鼻接种；多克隆及抗原特异性Tfh细胞、GC B细胞和浆细胞的流式细胞术染色与分析；生发中心的免疫荧光检测；血清中流感病毒特异性抗体的酶联免疫吸附试验（ELISA）检测。这些检测方法可基本量化流感病毒感染中Tfh细胞的分化状态与功能，从而为深入研究Tfh细胞的分化机制及调控策略提供技术支持。

引言

近十年来，大量研究聚焦于新发现的CD4+ T细胞亚群——Tfh细胞亚群，因其在生发中心（GC）B细胞发育中发挥关键作用。B细胞淋巴瘤6（Bcl6）主要被视为一种基因抑制因子，是Tfh细胞谱系决定的关键因子，证据表明Bcl6的异位表达足以驱动Tfh细胞分化，而Bcl6缺失则导致Tfh细胞分化消失1,2,3。与其他通过迁移至炎症部位发挥效应功能的CD4+辅助性T细胞亚群不同，Tfh细胞主要在脾脏和淋巴结的B细胞滤泡区为B细胞提供辅助作用。共刺激分子ICOS和CD40L在Tfh细胞与生发中心B细胞的相互作用中发挥重要作用。在Tfh细胞分化过程中，ICOS传递来自同源B细胞的必要信号，同时也作为受体接收旁观者B细胞的迁移信号，从而介导Tfh细胞定位于B细胞区4,5。CD40L是Tfh细胞向B细胞传递增殖和存活信号的重要介质6。另一种功能类似于CD40L的因子是细胞因子IL21，主要由Tfh细胞分泌。IL21直接调控生发中心B细胞的发育及高亲和力抗体的产生，但其在Tfh细胞分化中的作用仍存在争议7,8。PD-1和CXCR5目前是流式细胞术分析中鉴定Tfh细胞最常用的标志物，同时也在该细胞亚群的分化与功能中发挥重要作用。CXCR5是B细胞滤泡趋化因子的受体，介导Tfh细胞向B细胞滤泡的定位9。PD-1目前被发现不仅具有引导滤泡定位的功能，还在生发中心B细胞亲和力成熟过程中传递关键信号10。基于上述发现，检测这些分子的表达水平基本可以反映Tfh细胞的成熟状态及其功能。

生发中心（GC）是继发性淋巴器官中一种由Tfh细胞诱导形成的短暂性微解剖结构，因此是评估Tfh细胞应答的理想指标。在生发中心内，B细胞在接受由细胞因子和共刺激分子介导的信号刺激后，会发生类别转换和体细胞高频突变，从而产生高亲和力抗体11。不同细胞因子微环境诱导不同的抗体类别转换，其中IL-4和IL-21促进IgG1类别的转换，而IFNγ则诱导IgG2类别的转换12。浆细胞是分泌型抗体的产生细胞，属于终末分化的细胞类型。与Tfh细胞类似，B细胞在生发中心中的发育过程伴随着多种重要分子的动态表达变化。根据现有研究，生发中心B细胞可通过B220+PNA+Fas+或B220+GL7+Fas+表型进行鉴定；与前体细胞相比，浆细胞下调B220的表达，并上调CD138的表达13。此外，上述特征均可通过流式细胞术和免疫荧光分析进行检测，因此适用于对生发中心应答的评估。

流感病毒感染可诱导强烈的细胞和体液免疫应答，其中滤泡辅助性T细胞（Tfh）和Th1细胞在CD4+ T细胞应答中占主导地位14，这使得该模型成为研究Tfh细胞分化的理想体系。甲型流感病毒A/Puerto Rico/8/34 H1N1（PR8）是一种常用的小鼠适应株，常被用于此类研究14,15,16。本文描述了在流感病毒感染背景下与Tfh细胞研究相关的一些基本实验方法：1）PR8病毒的鼻内接种；2）利用流式细胞术检测抗原特异性Tfh细胞、生发中心B细胞（GC B）、浆细胞及IL-21的表达；3）生发中心的组织学可视化观察；4）通过ELISA检测血清中抗原特异性抗体滴度。这些实验方案为从事Tfh相关研究的新进科研人员提供了必要的技术基础。

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方案

动物实验已获得中国上海巴斯德研究所机构动物护理和使用委员会的批准。所有实验均依据该委员会批准的动物实验方案进行。

注意：小鼠病毒感染及器官分离操作应在生物安全二级（ABSL2）条件下进行。

1. PR8流感病毒接种及小鼠体重记录

  1. 在ABSL2实验室中准备8周龄雄性C57BL/6小鼠用于感染实验。
    注：本方案同样适用于雌性小鼠实验。
  2. PR8病毒稀释：将病毒从-80 °C冰箱中取出，置于冰上孵育直至完全融化。充分涡旋混匀原液病毒，然后在预冷的1.5 mL离心管中用无菌磷酸盐缓冲液（PBS，135 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4）将病毒稀释至2 PFU/µL。
  3. 小鼠麻醉：称量每只小鼠的体重，计算所需戊巴比妥钠（2 mg/mL）的注射体积（注射体积为小鼠体重（g）的4倍，单位为µL）。通过腹腔注射计算所得体积的戊巴比妥钠。
    注：此步骤旨在使小鼠呼吸平稳安静，以便准确进行鼻内接种病毒。心跳过快或过慢均提示麻醉不当。此外，建议使用兽用眼膏以防止角膜干燥。
  4. 鼻内接种：充分涡旋混匀稀释后的PR8病毒。吸取10 µL病毒液，逐滴小心地对一侧鼻孔进行鼻内接种。完成同笼内所有小鼠（最多5只）该侧接种后，再依次对另一侧鼻孔重复相同操作（整个接种过程中保持小鼠呼吸平稳安静）。每只小鼠总共感染40 PFU的PR8病毒。
  5. 将小鼠置于温暖的笼具中，使其保持胸卧位，以利于恢复。
  6. 连续10天每日监测小鼠体重（感染当天记为第0天）。

2. 从脾脏和纵隔淋巴结（mLN）中分离淋巴细胞

  1. 小鼠安乐死：将小鼠放入一个小容器中，从容器底部缓慢通入CO2，使其平静地安乐死。当小鼠不再活动时将其取出，并实施颈椎脱位以确保完全死亡。用75%乙醇浸泡小鼠体表，随后转移至生物安全柜中。
  2. 将小鼠固定在铺有吸水纸的解剖泡沫板上，使用解剖剪沿腹部中线及后肢剪开皮肤，用镊子将皮肤向两侧拉伸，并用解剖针固定拉伸后的皮肤。
  3. 为每只小鼠准备两个6 cm培养皿，并置于冰上。在每个培养皿中放置一个70-μm细胞筛网，并加入5 mL含1%胎牛血清的DMEM培养基（DMEM (1% FBS)）。
  4. 脾脏分离：用解剖剪剪开腹膜以暴露腹腔，取出脾脏并放入已准备好的培养皿中。
  5. 纵隔淋巴结（mLN）分离：剪开膈肌及肋笼底部至胸腺附近区域，将肋骨向一侧拉开并用解剖针固定，以暴露胸腔。将肺向右侧推开，用镊子在心脏下方、气管腹侧附近取出mLN。
  6. 将mLN放入已准备好的培养皿中。
  7. 制备单细胞悬液：用3 mL注射器的推杆轻轻研磨脾脏或mLN，使其通过70-μm细胞筛网。用1 mL新鲜DMEM (1% FBS)冲洗细胞筛网。重悬细胞悬液后转移至15 mL离心管中。
  8. 在4 °C条件下，以350 × g离心6分钟，弃上清，加入1 mL DMEM (1% FBS)。
  9. 用1 mL移液器彻底重悬细胞沉淀。向脾细胞悬液中加入4 mL DMEM (1% FBS)，并在后续操作中保持在冰上。
    注意：为完全从沉淀中分离出单个细胞，必须先用1 mL培养基重悬细胞沉淀，而不是直接使用5 mL。 
    从本步骤开始，所有操作可在普通实验室中进行。
  10. 脾细胞计数
    1. 通过反复倒置离心管数次重悬细胞。取10 μL细胞悬液加入90 μL红细胞裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.5，155 mM NH4Cl）中。室温（RT）孵育3分钟，然后加入900 µL冷PBS终止反应。
    2. 在4 °C条件下以400 × g离心6分钟，弃上清，用100 μL冷PBS重悬细胞沉淀。取10 μL细胞悬液与10 μL 0.4% w/v台盼蓝混合，从中取出10 µL混合液用于血细胞计数板进行细胞计数。
    3. 计算方法：按常规方法计算细胞数量。简而言之，计数血细胞计数板上两个对角线角落方格内的细胞数，分别记为N1和N2。5 mL细胞悬液的细胞浓度应按(N1+N2)/2 × 104 /mL计算。

3. 使用 PD-1 和 CXCR5 对多克隆 Tfh 细胞进行免疫染色

  1. 使用生物素标记的抗CXCR5抗体进行染色。
    1. 通过上下颠倒离心管重悬细胞悬液。取2 × 106 个细胞加入流式管中，并加入2 mL染色缓冲液（PBS含1% FBS和1 mM EDTA）。在涡旋振荡仪上涡旋洗涤。
    2. 在4 °C下以350 × g离心6分钟。倾去上清液，并将管口在吸水纸上轻蘸两次以去除残留液体。
    3. 轻轻敲击管底，利用残留液体重悬细胞沉淀。将离心管置于冰上的管架中。
      注意：残留液体积约为25 μL。
    4. 每管加入0.2 µL抗小鼠CD16/CD32（Fc受体阻断剂）。轻敲管底混匀，冰上孵育10分钟。
      注意：若需处理多个样本，可通过将每管5 µL染色缓冲液进行稀释来配制抗体混合液。混合液的配制方法为：将(n/10+1) × 0.2 µL Fc受体阻断剂加入(n/10+1) × 5 µL染色缓冲液中混匀，每管加入5.2 µL混合液。
    5. 每管在残留的30 µL染色缓冲液中加入0.3 µL生物素标记的抗小鼠CXCR5抗体，轻敲管底涡旋混匀。
      注意：抗体混合液的配制方法同步骤3.1.4。
    6. 冰上孵育1小时，于30分钟时轻敲管底轻轻重悬细胞。
      注意：30分钟时轻敲是为了防止细胞聚集，以获得更好的染色效果。
    7. 加入2 mL染色缓冲液，在涡旋振荡仪上涡旋混匀。在4 °C下以350 × g离心6分钟，按步骤3.1.2所述弃去上清液。轻敲管壁涡旋重悬细胞，冰上放置以进行后续染色。
  2. 使用其他表面标志物进行染色。
    1. 按照步骤3.1.4所述方法配制抗体混合液（表1）。
    2. 将抗体混合液加入各管中。轻敲管底混匀，冰上孵育30分钟。
    3. 用2 mL染色缓冲液洗涤细胞。在4 °C下以350 × g离心6分钟。
    4. 弃去上清液，每管加入400 µL染色缓冲液。在涡旋振荡仪上涡旋混匀，避光保存直至进行流式细胞术分析。 

4. PR8流感病毒NP特异性Tfh细胞的免疫染色

注意：该针对NP特异性Tfh细胞的染色方案来自先前的研究15,17。

  1. 进行生物素标记的CXCR5染色，步骤同3.1，但染色时细胞数量取3 × 106，以确保在流式细胞术中能记录到足够数量的抗原特异性细胞。
  2. 向3.1.7步骤中的离心管中加入0.3 µL APC标记的IAbNP311-325 MHC II类（NP311-325）四聚体。如步骤3.1.4所述，为多个样本配制混合液。
    注意：必须在加入抗CD4抗体之前进行四聚体染色，因为CD4与抗CD4抗体的结合会干扰四聚体的最佳染色效果。
  3. 轻轻敲击离心管使细胞混合物重悬，并在室温下避光孵育30分钟。
    注意：在管口覆盖湿润的纸巾以减少蒸发。
  4. 加入其他表面标志物的混合抗体（表1），继续在室温下孵育30分钟。
  5. 按照步骤3.2.3和3.2.4所述进行洗涤并重悬细胞。

5. 多克隆Tfh细胞中Bcl6的免疫染色

  1. 按照第3节所述进行表面标志物（表2）染色，但最后一次用2 mL PBS洗涤，而非染色缓冲液。
  2. 在4 °C下以350 × g离心6分钟。弃去上清液，通过轻轻敲击管底重悬细胞沉淀。
  3. 向管中加入300 µL 3.7%甲醛溶液（用PBS稀释37%甲醛制备），用于细胞固定。在涡旋振荡仪上涡旋混匀，并在室温下孵育20分钟。
  4. 加入2 mL染色缓冲液进行洗涤，在4 °C下以500 × g离心6分钟。弃去上清液，通过轻轻敲击管壁重悬细胞。
  5. 向管中加入300 µL 0.2% Triton-X 100，并在涡旋振荡仪上涡旋重悬细胞。室温孵育15分钟。
  6. 加入2 mL染色缓冲液进行洗涤，在4 °C下以500 × g离心6分钟。弃去上清液，通过轻轻敲击管底重悬细胞。
  7. 每管加入1.5 µL PE标记的抗Bcl6抗体。轻轻敲击管底以重悬混合物，在室温下孵育2小时，每隔30分钟轻敲一次管底。
    注意：在管口覆盖湿润的滤纸，以减少混合液蒸发。
  8. 向管中加入2 mL含0.01% Triton-X 100的PBS。涡旋混匀后，在4 °C下以500 × g离心6分钟。
  9. 重复步骤5.8的洗涤操作。用400 µL染色缓冲液重悬细胞，将细胞置于冰上避光保存，直至进行流式细胞术分析。

6. IL21 的细胞内染色

  1. 用PMA（佛波酯12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯）和离子霉素刺激细胞。
    1. 从脾细胞悬液中取2 × 106个细胞，于4 °C下以350 × g离心6分钟。弃去上清液，用500 µL完全T细胞培养基重悬细胞沉淀，将细胞转移至24孔板中。
    2. 向500 µL完全培养基中加入20 nmol PMA和2 µmol离子霉素18，通过反复吹打充分混匀。
    3. 将步骤6.2中配制的溶液加入24孔板的细胞悬液中，轻轻振荡混匀。设置未刺激对照组：向另一孔细胞中加入500 µL不含PMA和离子霉素的完全T细胞培养基。将板置于 CO2培养箱 中 37°C孵育4小时。
    4. 向每孔中加入10 μmol BFA（布雷菲德菌素A，用甲醇溶解），以阻断高尔基体介导的蛋白质转运。将培养板放回细胞培养箱，继续孵育2小时。
  2. 进行细胞表面标志物染色。
    1. 轻轻吹打使细胞重悬，转移至FACS管中。向管中加入1 mL染色缓冲液，在4 °C下以350 × g离心6分钟。
    2. 参照步骤3.1.4进行Fc受体阻断染色。
    3. 参照步骤3.2.1至3.2.3进行细胞表面标志物染色（表3），但用2 mL PBS洗涤细胞。
    4. 在4 °C下以350 × g离心6分钟，弃去上清液，轻敲管底使细胞重悬。
  3. 向每管中加入0.2 µL活/死可固定Aqua死细胞染色试剂盒中的试剂，在室温避光孵育10分钟，以标记死细胞。
  4. 向管中加入2 mL PBS，使用涡旋振荡器混匀，在4 °C下以350 × g离心6分钟，弃去上清液。
  5. 参照步骤5.3和5.4进行细胞固定。
  6. 加入300 µL染色缓冲液重悬细胞，将样品管于4 °C冰箱中过夜保存。在4 °C下以500 × g离心6分钟，弃去上清液。
    注意：此步骤可省略，直接从步骤6.5进入步骤6.7。
  7. 向管中加入1 mL皂苷缓冲液（含0.2%（w/v）皂苷的染色缓冲液），使用涡旋振荡器混匀，冰上孵育20分钟，以实现细胞通透化。
  8. 在4 °C下以500 × g离心6分钟，弃去上清液。
  9. 向每管中加入0.5 µL人Fc-IL21受体。若需处理多个样本，参照步骤3.1.4配制抗体混合液，但使用皂苷缓冲液而非染色缓冲液稀释抗体。
  10. 室温孵育1小时，期间在30分钟时轻敲管底使细胞重悬。
  11. 加入2 mL皂苷缓冲液洗涤细胞，在500 × g下离心6分钟，弃去上清液，重复洗涤一次。
  12. 向每管中加入0.1 µL APC-抗人Ig(H+L)抗体。若需处理多个样本，参照步骤3.1.4配制混合液，但使用皂苷缓冲液而非染色缓冲液稀释抗体。
  13. 将样品置于冰上避光孵育30分钟，并参照步骤6.11进行洗涤。
  14. 用400 µL染色缓冲液重悬细胞，样品置于冰上避光保存，直至进行流式细胞术分析。

7. 生发中心B细胞和浆细胞染色

  1. 取细胞，并按照步骤 3.1.1 至 3.1.4 进行抗 Fc 受体抗体染色。
  2. 进行表面标志物染色（表 4），步骤同 3.1.5 至 3.1.7，但孵育时间为 30 分钟，而非 1 小时。
  3. 用 400 µL 染色缓冲液重悬细胞。将样品置于冰上避光保存，直至进行流式细胞术分析。

8. 从血液中分离血清

  1. 感染后第14天（d.p.i 14），从面部静脉采集血液，并将血液样本置于4 °C冰箱中过夜。
    注意：血液采集需在ABSL2条件下进行，从本步骤起，后续所有操作可在普通实验室中进行。
  2. 在4 °C条件下，以400 × g 离心10分钟。使用200 µL移液器小心分离血清，避免红细胞污染。每份样本分装至3个管中，并储存于-80°C。

9. 采用ELISA法检测HA特异性抗体滴度

  1. 每孔加入 50 µL 浓度为 2 µg/mL 的 HA 蛋白溶液，包被 ELISA 板，在 4 °C 冰箱中过夜孵育。
  2. 用 200 µL 含 0.05% Tween 的 PBS（PBST）洗涤三次。每孔加入 100 µL 含 5% 脱脂奶粉的 PBST 溶液，室温孵育 2 小时，以封闭非特异性结合位点。
  3. 血清稀释与孵育：以 PBS 中含 3% BSA 作为稀释缓冲液。将血清用稀释缓冲液按 1:50、1:150、1:450，…… 至 1:36450 进行系列稀释（建议采用 3 倍系列稀释）。每孔加入 50 µL 稀释后的血清，置于 4°C 冰箱中过夜孵育。
  4. 弃去血清，每孔加入 200 µL PBST 快速洗涤一次（轻轻震荡后弃去）。随后在摇床上用 200 µL PBST 缓慢洗涤三次，每次 5 分钟。
  5. 每孔加入 100 µL 辣根过氧化物酶（HRP）标记的针对总 IgG、IgM、IgG1、IgG2b、IgG2c 的二抗（用 PBST 按 1:5000 稀释），室温孵育 1 小时。按步骤 9.4 所述方法用 PBST 洗涤酶标板。
  6. 从 4 °C 保存条件下取出等体积的缓冲液 A 和缓冲液 B（TMB），在室温下预热至少 30 分钟后使用。将 A 和 B 混合后，每孔加入 100 µL TMB 显色液，在室温下轻轻震荡孵育 10–30 分钟。
    注意：此为 TMB 底物试剂盒（BD,555214）说明书的简要描述。
  7. 每孔加入 100 µL 2M H2SO4 终止反应，使用仪器测定 OD450 值。
  8. 数据分析：通过减去空白孔的背景信号（空白孔的 OD450 值）获得最终 OD450 值。以稀释倍数为 X 轴，OD450 值为 Y 轴，绘制各样本对应抗体亚型的曲线。

10. 组织学

  1. 在感染后第10天（d.p.i.）分离脾脏。用3.7%甲醛溶液在室温下固定1小时。弃去固定液，用PBS在摇床上洗涤5分钟，重复三次。
  2. 将脾脏置于含10%蔗糖的PBS中，4°C下脱水1小时；随后转移至含30%蔗糖的PBS中，4°C轻轻振荡脱水，直至脾脏沉入15 mL离心管底部。
  3. 取出已脱水的脾脏，包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并进行冷冻切片。
  4. 将丙酮预冷至-20°C。用预冷的丙酮孵育组织切片10分钟。用PBS洗涤组织切片三次。
  5. 用含0.2% Triton X-100的PBS对组织切片进行通透处理20分钟，并用PBS洗涤三次。
  6. 用含10%正常山羊血清（封闭缓冲液）的PBS在室温下封闭非特异性结合位点1小时，随后用PBS洗涤一次。
  7. 使用链霉亲和素/生物素封闭试剂盒进行进一步封闭。
    注意：从本步骤开始，切勿让样品干燥。
  8. 一抗染色：小心地将用封闭缓冲液稀释的生物素化PNA（25 µg/mL）和大鼠抗小鼠IgD抗体（2.5 µg/mL）加至组织切片上。将切片置于湿盒中，在4°C冰箱中孵育过夜。
  9. 用PBST快速洗涤组织切片一次，随后在PBST中缓慢振荡洗涤5分钟。重复洗涤三次。
  10. 用封闭缓冲液将Alexa Fluor 488标记的链霉亲和素（1:500）和Alexa Fluor 555标记的山羊抗大鼠IgG抗体（1:500）稀释后，小心地加至组织切片上。
  11. 在室温下孵育1小时。
  12. 按照步骤10.8的方法洗涤组织切片，小心地用Prolong封片液封片。轻轻加盖盖玻片，避光保存于4°C，直至进行共聚焦显微镜分析。
  13. 通过计数单位面积内的生发中心（GC）数量来评估GC反应的强度。

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结果

流感病毒感染中鼠类发病特征的表征
流感病毒感染后，小鼠因患病而活动减少且食欲减退，表现为明显的体重下降，这是监测小鼠发病情况的常用指标19如图所示 图1aPR8病毒感染的小鼠从第6天开始体重下降，第8天达到最低水平，第10天恢复至初始水平。正如预期，PBS处理的对照组小鼠在整个观察期间未出现体重下降。在体内症状方面，病毒感染可导致引流淋巴结（本实验中为mLN）中淋巴细胞显著扩增。因此，与对照组小鼠相比，PR8病毒感染小鼠的mLN体积显著增大（图 1b综上所述，这些小鼠均表现出预期的症状，符合后续Tfh相关免疫反应研究的条件。

Tfh 细胞分化及功能相关分子的检测
为分析Tfh细胞分化，分别在感染后第5、7、10和14天...

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讨论

由于Tfh细胞在辅助B细胞产生高亲和力抗体方面具有特殊作用，其分化机制及调控方法已被广泛研究，以期为疫苗设计提供新策略。流感病毒感染可诱导强烈的Tfh细胞和生发中心B细胞应答，因此是该研究领域的合适模型。本文描述了通过鼻内接种进行流感病毒感染、利用流式细胞术、免疫荧光和ELISA检测Tfh相关应答的实验方案。这些检测方法将有助于研究人员观察Tfh细胞分化、生发中心B细胞发育以及流感病毒特异性抗体的产生，并进一步探索和鉴定免疫应答中的关键分子。

在流感病毒感染小鼠模型的研究中，体重下降是衡量小鼠发病情况的常用指标。流感病毒感染小鼠后预期的体重变化动力学如图1a所示，反映了小鼠体内诱导出的正常免疫应答。然而，实验中常会出现异常情况，例如小鼠体重持续下降或在整个观察期内均未出现体重减轻。根据我们的经验，这些小鼠通常存在异常偏低或偏高的免疫反应，从而干扰实验结果。为避免此类变异，首先应确保实验所用小鼠性别和年龄一致，以保证其对病毒的反应能力相似。每只小鼠接种的病毒滴度保持一致也至关重要21

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披露

作者无任何披露信息。

致谢

我们感谢上海巴斯德研究所流式细胞仪平台、ABSL2 实验室和 SPF 动物实验平台工作人员提供的技术帮助与建议。本工作获得以下基金项目资助：中国科学院战略性先导科技专项（XDB29030103）、国家重点领域研发计划&中国国家重点研发计划（2016YFA0502202）、国家自然科学基金（31570886）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Tfh细胞、NP特异性Tfh细胞及Bcl-6的免疫染色
37% 甲醛SigmaF1635
抗小鼠CD16/32抗体Thermo Fisher Scientific14-0161-86
APC标记的IAbNP311-325 MHC II类四聚体NIH
Bcl-6 PEBiolegend358504克隆号: 7D1
生物素标记的CXCR5Thermo Fisher Scientific13-7185-82克隆号: SPRCL5
CD4 Percp-eFluor 710Thermo Fisher Scientific46-0041-82克隆号: GK1.5
CD44 eVolve 605Thermo Fisher Scientifi83-0441-42克隆号: IM7
CD44 FITCThermo Fisher Scientifi11-0441-82克隆号: IM7
CD62L FITCBD Pharmingen553150克隆号: MEL-14
ICOS BV421Biolegend564070克隆号: 7E.17G9
PD1 PE/Cy7Biolegend135216克隆号: 29F.1A12
链霉亲和素 BV421BD Pharmingen563259
链霉亲和素 PEBD Pharmingen554081
IL21的胞内染色
37% 甲醛SigmaF1635
抗人IgG抗体Jackson ImmunoResearch Laboratories109-605-098
布雷菲德菌素ASigmaB6542
人Fcγ IL-21受体R&D System
离子霉素SigmaI0634
可固定的活死细胞染色试剂盒（Aqua）Thermo Fisher ScientificL34966
PMASigmaP1585
皂苷MP102855
生发中心B细胞和浆细胞染色
B220 APCThermo Fisher Scientific17-0452-81克隆号: RA3-6B2
CD138 PEBD Pharmingen561070克隆号: 281-2
CD95 (FAS) PE/Cy7BD Pharmingen557653克隆号: Jo2
IgD eFluor 450Thermo Fisher Scientific48-5993-82克隆号: 11-26c
PNA FITCSigmaL7381
采用ELISA检测HA特异性抗体滴度
PR8-HASino Biological11684-V08H
BSASSBC
羊抗小鼠Ig（SBA克隆分型系统-HRP）SouthernBiotech5300-05
羊抗小鼠IgM（SBA克隆分型系统-HRP）SouthernBiotech5300-05
羊抗小鼠IgG1（SBA克隆分型系统-HRP）SouthernBiotech5300-05
羊抗小鼠IgG2b（SBA克隆分型系统-HRP）SouthernBiotech5300-05
羊抗小鼠IgG2c（SBA克隆分型系统-HRP）SouthernBiotech5300-05
TMB底物试剂盒BD Pharmingen555214
组织学
Alexa Fluor 555标记的羊抗大鼠IgGLife TechnologyA21434
抗小鼠IgD抗体Biolegend405702
生物素化PNAVector laboratoriesB-1075
稀释的Alexa Fluor 488标记的链霉亲和素Life TechnologyS11223
正常山羊血清SouthernBiotech0060-01
Pro-long gold抗荧光淬灭封片剂Thermo Fisher ScientificP3630
链霉亲和素/生物素封闭试剂盒Vector laboratoriesSP-2002

参考文献

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