自由游动鱼类中通过可移动四极电极进行神经元无线电生理记录

摘要

本文介绍了一种用于记录自由游动金鱼脑部细胞外神经信号的新型无线技术。记录装置由两个四极电极、一个微型驱动器、一个神经数据记录仪和一个防水外壳组成。除数据记录仪及其连接器外，所有部件均为定制。

摘要

尽管鱼类占所有脊椎动物的大多数，但调控鱼类行为的神经机制在很大程度上仍不清楚。能够记录自由游动鱼类的脑活动将极大推动鱼类行为神经基础的研究。此外，精确控制脑内记录位置对于研究鱼类大脑不同区域之间协调的神经活动至关重要。本文介绍了一种可在自由游动鱼类脑内进行无线记录并精确控制记录深度的技术。该系统基于一种神经记录仪，并结合一种新型的可与水环境兼容的植入装置，该装置可通过微驱动控制的四极电极调节记录位置。通过在金鱼端脑中的记录，展示了该系统的性能。

引言

鱼类是种类最多、多样性最丰富的脊椎动物类群，与其他脊椎动物一样，它们表现出复杂的认知能力，例如导航、社交、睡眠、捕食等。然而，调控鱼类行为的神经机制在很大程度上仍不清楚。

在过去几十年中，对固定鱼类的细胞外记录主要用于研究行为神经基础的各个方面^1,2。尽管该技术适用于某些感觉系统，但在固定动物中，要研究行为神经基础的完整谱系，即使并非完全不可能，也极为困难。早期进展包括对束缚状态下游泳鱼类的Mauthner细胞进行记录^3,4。然而，Mauthner细胞异常巨大，所记录到的动作电位幅度可高达数毫伏（mV），这为记录提供了便利。随后，Canfield等人首次提出利用束缚动物记录鱼类端脑神经活动的概念验证⁵。另一种近期用于记录鱼类神经活动的技术是钙成像（参见Orger与de Polavieja⁶以及Vanwalleghem等人⁷的综述）。该技术最初是为斑马鱼幼体开发的，因为其皮肤和颅骨在幼体阶段具有透明性。然而，该技术无法用于研究发育后期阶段的复杂行为。

方案

所有手术操作必须经过动物福利本地伦理委员会（例如 IACUC）批准。

1. 微驱动装置外壳的构建

1. 制作外壳时，使用锯子将1 mm厚的黄铜板切割成19 mm × 29 mm × 1 mm的板片。在长边两侧各切割两个5.5 mm的狭缝，狭缝方向垂直于边缘，且每个狭缝距离窄边6.5 mm（图2A）。
2. 使用钳子将长边两侧狭缝之间的区域向内弯折，然后将底部向内弯折，上部向外弯折，从而形成外壳（图2B,C）。
3. 使用3 mm钻头在外壳上钻出用于螺钉的孔。
   注意：这些孔稍后将用于将外壳固定到记录仪盒上（图2D）。
4. 对外壳的接缝处进行焊接。
5. 使用细圆锉在外壳底部加工出一个半径为1.5 mm的小型半圆形狭缝（图2E）。
   注意：该狭缝稍后用于插入不锈钢管以引导电极。
6. 使用1 mm钻头在外壳背面钻一个用于四极电极（....

结果

在记录过程中，金鱼在一个方形水族箱中自由游动，同时记录其端脑的神经活动。这些实验的目的是研究单个细胞的神经活动如何决定鱼的行为。为此，需要在记录的数据中识别出放电活动。记录过程中，脑活动信号由数据记录仪以 31,250 Hz 的频率进行数字化，并通过 300 Hz 的高通滤波。随后，在离线分析中对信号施加带通滤波（300−5,000 Hz），并将预分类的原始数据按每个四极电极的通道和参考通道进行分离（图 4A）。接着，使用常规的 spike 分类算法¹²来表征单个细胞的活动。首先，根据每个通道的噪声水平，手动设定最小 spike 幅值阈值对各通道进行筛选。其次，由于四极电极的尖端不在同一位置，且参考电极位于脑外，因此出现在多个四极电极或参考通道中的 spike 也被过滤掉。然后，对过滤后的数据通过 spike 形态、持续时间、峰间间隔（连续动作电位之间的时间必须符合神经元的不应期）以及主成分分析（PCA）进行人工聚类和进一步筛选。单.......

讨论

本方案详细介绍了将四极电极阵列植入自由游动的金鱼端脑的步骤。该技术采用一种神经记录仪，可放大并记录来自最多16个通道的信号，同时结合一个可调节脑内电极位置的微型驱动装置。微型驱动装置使得能够在脑内调整电极位置，以优化记录效果。

该方案可轻松修改，用于记录其他脑区（参见Vinepinsky等人的研究⁸，其中使用类似技术记录视顶盖的活动）或任何体长15 cm及以上（约相当于一条金鱼从头到尾的长度，体重约100克）的水生动物。此外，只要数据记录仪的通信频率能够穿透水体，该方案即可适配于任何类型的数据记录仪。本研究中使用的记录仪采用900 MHz的射频进行通信，可穿透约20 cm深的水层。2.4 GHz的射频也可穿透约15 cm的淡水。更低的频率或其他替代方案可能获得更优的效果^13,14,15。本方案采用了一个包含八个记录通道的双四极子电极阵列。此外，该方案.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.7 mm 圆形钻头			与钻机兼容。
15号刀片手术刀	Sigma-Aldrich
16 通道 PCB 板	Neurlynx	EIB-16
1x3M 菲利普斯平头螺丝			不锈钢。任意类型。
1x3M 菲利普斯圆头螺丝			不锈钢。任意类型。
27 cm × 19 cm × 1 mm 黄铜板			见图2
2个6M十字槽平头螺钉			不锈钢。任意类型。
3140 RTV 涂层	戴 crowning	2767996
75 µm 银丝	A-M Systems
黄铜机制螺钉 #00-90		947-1006
黄铜板 7.5 mm × 2.5 mm × 0.6 mm			提供了一幅三维图。参见补充文件1
镀膜钨丝 25µm	加州细丝公司	5000160	根据应用需求，可使用各种类型的导线制作四极电极。常用的导线为镍铬合金导线，可选用较小直径的型号（例如 A-M systems，762000）。
镀层钨丝 50 µm	A-M Systems	795500	可用其他低阻抗导线替代
氰基丙烯酸酯胶水
牙科抛光器	ComDent UK		任何小型无菌不锈钢工具均可。
牙科水泥 - GCFujiPLUS	GC	431011	其他牙科水泥可能也适用，但我们从未尝试过其他种类。
牙科钻头或指甲打磨钻			牙科钻头价格昂贵，指甲打磨钻可作为廉价替代品。
钻头 #65		947-65
快速固化环氧树脂			任何5分钟固化的环氧树脂均可用于此处。
带O形圈密封的记录仪盒			提供了一幅三维示意图，参见补充文件1-3。该盒子应通过机械加工制造（不要使用3D打印机）。应使用透明材料，以便能够观察记录仪上的指示LED灯。
电动旋转装置			按所述定制制作 "Open Ephys" 网站。也可从 neurolynx 购买"Tetrode Spinner 2.0"）或其他方式构建。
Mouselog-16 神经记录仪	Deuteron Technologies Ltd		目前市场上有多种神经记录仪可供选择，包括：SpikeGadget（UH32，32通道）以及 Alexei Vyssotski 开发的 Neurologger 2/2A/2B。需要注意的是，重量并非主要限制因素，因其可通过浮力泡沫塑料进行配重平衡。
MS-222	Sigma Aldrich	E10521	Ethtl 3-氨基苯甲酸甲酯磺酸盐 98%
Nano-Z 镀膜	White Matter LLC		纳米Z可从多家供应商购买。可使用任何阻抗测量仪，例如 IMP-1 / 6662 / 2788，BAK Electronics。
PCB 引脚	Neurlynx	Neuralynx EIB 针脚
聚酰亚胺管 250 µm	A-M Systems	822000
可充电电池			3.7 V 锂聚合物电池，370 mAh。可支持约 6 小时的录制。可根据需要选用更小或更大的电池，以减轻重量或延长录制时间。
硅胶管 0.64 mm	A-M Systems	806100
不锈钢 1.5 mm	A-M Systems	846000
碳酸氢钠	Sigma Aldrich	S9625
轻敲 #00-90		947-1301
凡士林			可使用任何类型的软性石油类皮肤保护剂。