本文介绍了一种用于记录自由游动金鱼脑部细胞外神经信号的新型无线技术。记录装置由两个四极电极、一个微型驱动器、一个神经数据记录仪和一个防水外壳组成。除数据记录仪及其连接器外,所有部件均为定制。
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本文介绍了一种用于记录自由游动金鱼脑部细胞外神经信号的新型无线技术。记录装置由两个四极电极、一个微型驱动器、一个神经数据记录仪和一个防水外壳组成。除数据记录仪及其连接器外,所有部件均为定制。
尽管鱼类占所有脊椎动物的大多数,但调控鱼类行为的神经机制在很大程度上仍不清楚。能够记录自由游动鱼类的脑活动将极大推动鱼类行为神经基础的研究。此外,精确控制脑内记录位置对于研究鱼类大脑不同区域之间协调的神经活动至关重要。本文介绍了一种可在自由游动鱼类脑内进行无线记录并精确控制记录深度的技术。该系统基于一种神经记录仪,并结合一种新型的可与水环境兼容的植入装置,该装置可通过微驱动控制的四极电极调节记录位置。通过在金鱼端脑中的记录,展示了该系统的性能。
鱼类是种类最多、多样性最丰富的脊椎动物类群,与其他脊椎动物一样,它们表现出复杂的认知能力,例如导航、社交、睡眠、捕食等。然而,调控鱼类行为的神经机制在很大程度上仍不清楚。
在过去几十年中,对固定鱼类的细胞外记录主要用于研究行为神经基础的各个方面1,2。尽管该技术适用于某些感觉系统,但在固定动物中,要研究行为神经基础的完整谱系,即使并非完全不可能,也极为困难。早期进展包括对束缚状态下游泳鱼类的Mauthner细胞进行记录3,4。然而,Mauthner细胞异常巨大,所记录到的动作电位幅度可高达数毫伏(mV),这为记录提供了便利。随后,Canfield等人首次提出利用束缚动物记录鱼类端脑神经活动的概念验证5。另一种近期用于记录鱼类神经活动的技术是钙成像(参见Orger与de Polavieja6以及Vanwalleghem等人7的综述)。该技术最初是为斑马鱼幼体开发的,因为其皮肤和颅骨在幼体阶段具有透明性。然而,该技术无法用于研究发育后期阶段的复杂行为。
本文介绍了一种记录自由游动鱼类脑部细胞外神经活动的新技术。该技术是对 Vinepinsky 等人8所述方案的改进版本,主要创新在于增加了一个微型驱动装置,使得术后能够调节电极的位置。该技术旨在利用一组四极电极记录金鱼端脑的神经活动,电极通过微型驱动装置连接至神经数据记录仪。整个装置为无线设计,并固定在鱼的颅骨上。通过添加一个小浮子,使系统的比重与水的比重相匹配,从而使鱼能够自由游动。
该技术基于使用一种神经数据记录仪,可对信号进行放大、数字化,并将其存储在设备自带的存储器中。记录仪的遥测系统用于启动和停止记录,以及与摄像机进行同步。在本方案中,采用一个16通道神经记录仪,与微型驱动装置一同嵌入防水盒内。
微型驱动器组件由两个主要部分构成:微型驱动器本身和微型驱动器外壳(图1A,B)。外壳用于固定微型驱动器和四极记录电极,并作为颅骨与记录盒之间的锚定点(图1C)。PVC材质的记录盒通过机械加工制成,并使用O形圈进行密封(图1E-G,另见补充图1、补充图2和补充图3中的三维[3D]示意图)。在记录盒的一端附有一块聚苯乙烯泡沫,用于补偿植入物的重量,使鱼类获得中性浮力的植入装置。本方案中所述微型驱动器的构建方法基于Vandecasteele等9提出的方法,并对其进行了修改,以实现将微型驱动器固定于外壳的结构(图1A)。文中展示了所有主要步骤。
本方案中所述制备鱼颅骨的步骤与Vinepinsky等人8所报道的方法类似,方案中对此进行了简要描述。手术后一天,鱼通常已完全从麻醉效应中恢复,可进行行为学实验。请注意,可通过旋转微型驱动器螺丝来调整四极电极的位置。该螺丝每完整旋转一圈前进300 µm,建议每次推进75 µm,直至到达目标脑区。应参考合适的脑图谱以准确定位特定感兴趣脑区。每次因更换电池或存储卡对鱼进行麻醉时,建议检测电极的阻抗。
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所有手术操作必须经过动物福利本地伦理委员会(例如 IACUC)批准。
1. 微驱动装置外壳的构建
2. 微驱动装置的构建
3. 准备四极电极阵列
4. 植入物的组装
5. 麻醉剂配制——1% MS-222 储存液
注意:麻醉剂配制过程中使用了粉末状 MS-222,该物质为致癌物。因此,步骤 5.2 和 5.3 必须在化学通风橱中佩戴手套操作。
6. 准备鱼类头骨
注意: 此时,鱼已准备好进行植入手术。手术前,需确保所有组件和用品均已通过适当程序灭菌。此步骤需要使用一个离水的U形鱼固定装置。在本方案中,使用一个可容纳体长(头至尾)15 cm的金鱼的铝制固定器。该系统可在将鱼体保持在水面之外的同时,向其鳃部灌注含氧水。详见Vinepinsky等8。
7. 植入探针
注意:为完成本方案的最后一步,需要使用一种操纵器,以便在将植入物插入大脑时固定其位置。
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在记录过程中,金鱼在一个方形水族箱中自由游动,同时记录其端脑的神经活动。这些实验的目的是研究单个细胞的神经活动如何决定鱼的行为。为此,需要在记录的数据中识别出放电活动。记录过程中,脑活动信号由数据记录仪以 31,250 Hz 的频率进行数字化,并通过 300 Hz 的高通滤波。随后,在离线分析中对信号施加带通滤波(300−5,000 Hz),并将预分类的原始数据按每个四极电极的通道和参考通道进行分离(图 4A)。接着,使用常规的 spike 分类算法12来表征单个细胞的活动。首先,根据每个通道的噪声水平,手动设定最小 spike 幅值阈值对各通道进行筛选。其次,由于四极电极的尖端不在同一位置,且参考电极位于脑外,因此出现在多个四极电极或参考通道中的 spike 也被过滤掉。然后,对过滤后的数据通过 spike 形态、持续时间、峰间间隔(连续动作电位之间的时间必须符合神经元的不应期)以及主成分分析(PCA)进行人工聚类和进一步筛选。单...
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本方案详细介绍了将四极电极阵列植入自由游动的金鱼端脑的步骤。该技术采用一种神经记录仪,可放大并记录来自最多16个通道的信号,同时结合一个可调节脑内电极位置的微型驱动装置。微型驱动装置使得能够在脑内调整电极位置,以优化记录效果。
该方案可轻松修改,用于记录其他脑区(参见Vinepinsky等人的研究8,其中使用类似技术记录视顶盖的活动)或任何体长15 cm及以上(约相当于一条金鱼从头到尾的长度,体重约100克)的水生动物。此外,只要数据记录仪的通信频率能够穿透水体,该方案即可适配于任何类型的数据记录仪。本研究中使用的记录仪采用900 MHz的射频进行通信,可穿透约20 cm深的水层。2.4 GHz的射频也可穿透约15 cm的淡水。更低的频率或其他替代方案可能获得更优的效果13,14,15。本方案采用了一个包含八个记录通道的双四极子电极阵列。此外,该方案...
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作者无任何利益冲突需要披露。
我们感谢Nachum Ulanovsky及Ulanovsky实验室成员提供的所有帮助。此外,我们感谢Tal Novoplansky-Tzur在技术方面给予的有益协助。本研究获得了以色列科学基金会-FIRST项目(资助号:281/15)以及通过内盖夫本-古里安大学农业、生物与认知机器人计划由赫尔姆斯利慈善信托基金提供的财政支持,特此致谢。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.7 mm 圆形钻头 | 与钻机兼容。 | ||
| 15号刀片手术刀 | Sigma-Aldrich | ||
| 16 通道 PCB 板 | Neurlynx | EIB-16 | |
| 1x3M 菲利普斯平头螺丝 | 不锈钢。任意类型。 | ||
| 1x3M 菲利普斯圆头螺丝 | 不锈钢。任意类型。 | ||
| 27 cm × 19 cm × 1 mm 黄铜板 | 见图2 | ||
| 2个6M十字槽平头螺钉 | 不锈钢。任意类型。 | ||
| 3140 RTV 涂层 | 戴 crowning | 2767996 | |
| 75 µm 银丝 | A-M Systems | ||
| 黄铜机制螺钉 #00-90 | 947-1006 | ||
| 黄铜板 7.5 mm × 2.5 mm × 0.6 mm | 提供了一幅三维图。参见补充文件1 | ||
| 镀膜钨丝 25µm | 加州细丝公司 | 5000160 | 根据应用需求,可使用各种类型的导线制作四极电极。常用的导线为镍铬合金导线,可选用较小直径的型号(例如 A-M systems,762000)。 |
| 镀层钨丝 50 µm | A-M Systems | 795500 | 可用其他低阻抗导线替代 |
| 氰基丙烯酸酯胶水 | |||
| 牙科抛光器 | ComDent UK | 任何小型无菌不锈钢工具均可。 | |
| 牙科水泥 - GCFujiPLUS | GC | 431011 | 其他牙科水泥可能也适用,但我们从未尝试过其他种类。 |
| 牙科钻头或指甲打磨钻 | 牙科钻头价格昂贵,指甲打磨钻可作为廉价替代品。 | ||
| 钻头 #65 | 947-65 | ||
| 快速固化环氧树脂 | 任何5分钟固化的环氧树脂均可用于此处。 | ||
| 带O形圈密封的记录仪盒 | 提供了一幅三维示意图,参见补充文件1-3。该盒子应通过机械加工制造(不要使用3D打印机)。应使用透明材料,以便能够观察记录仪上的指示LED灯。 | ||
| 电动旋转装置 | 按所述定制制作 "Open Ephys" 网站。也可从 neurolynx 购买"Tetrode Spinner 2.0")或其他方式构建。 | ||
| Mouselog-16 神经记录仪 | Deuteron Technologies Ltd | 目前市场上有多种神经记录仪可供选择,包括:SpikeGadget(UH32,32通道)以及 Alexei Vyssotski 开发的 Neurologger 2/2A/2B。需要注意的是,重量并非主要限制因素,因其可通过浮力泡沫塑料进行配重平衡。 | |
| MS-222 | Sigma Aldrich | E10521 | Ethtl 3-氨基苯甲酸甲酯磺酸盐 98% |
| Nano-Z 镀膜 | White Matter LLC | 纳米Z可从多家供应商购买。可使用任何阻抗测量仪,例如 IMP-1 / 6662 / 2788,BAK Electronics。 | |
| PCB 引脚 | Neurlynx | Neuralynx EIB 针脚 | |
| 聚酰亚胺管 250 µm | A-M Systems | 822000 | |
| 可充电电池 | 3.7 V 锂聚合物电池,370 mAh。可支持约 6 小时的录制。可根据需要选用更小或更大的电池,以减轻重量或延长录制时间。 | ||
| 硅胶管 0.64 mm | A-M Systems | 806100 | |
| 不锈钢 1.5 mm | A-M Systems | 846000 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma Aldrich | S9625 | |
| 轻敲 #00-90 | 947-1301 | ||
| 凡士林 | 可使用任何类型的软性石油类皮肤保护剂。 |
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