淋巴结冷冻切片中肿瘤细胞黏附的定量分析

摘要

本文介绍一种简单且经济的方法，可用于定量分析肿瘤细胞在淋巴结（LN）冷冻切片上的黏附情况。通过光学显微镜可轻松识别黏附于淋巴结的肿瘤细胞，并采用基于荧光的方法进行确认，从而获得反映肿瘤细胞与淋巴结实质结合亲和力的黏附指数。

摘要

肿瘤引流淋巴结（LNs）不仅仅是过滤肿瘤代谢废物的结构，它们还是多种癌症患者体内播散性肿瘤细胞最常见的区域性暂居部位之一。检测这些驻留在淋巴结中的肿瘤细胞是与不良预后及辅助治疗决策相关的重要生物标志物。近期的小鼠模型研究表明，驻留于淋巴结中的肿瘤细胞可能是远端转移恶性细胞的重要来源。在聚焦于识别与淋巴道/转移性播散相关基因或信号通路的实验研究中，定量分析肿瘤细胞与淋巴结实质之间黏附能力是一项关键指标。由于淋巴结是复杂的三维结构，在组织切片中其形态和组成会因切面方向不同而呈现多样性，因此其基质在体外实验中难以以完全可控的方式被准确模拟。本文介绍一种简单且经济的方法，可用于定量分析肿瘤细胞对淋巴结冷冻切片的黏附性。通过使用同一淋巴结的连续切片，我们改进了Brodt建立的经典方法，采用非放射性标记物，并直接计数每单位淋巴结表面积上黏附的肿瘤细胞数量。通过光学显微镜可清晰识别黏附于淋巴结的肿瘤细胞，并通过基于荧光的方法加以确认，从而获得反映肿瘤细胞与淋巴结实质结合亲和力的黏附指数。该指数为整合素与其相应淋巴结配体之间结合亲和力发生分子水平改变提供了提示性证据。

引言

癌症转移是治疗失败的主要原因，也是癌症威胁生命的主要方面。正如130年前所提出的，转移扩散的发生是由于一群具有优势特性的播散性肿瘤细胞（DTCs，即“"种子"）获得了特定的生物学能力，使其能够逃离原发灶，并在远处器官（即“"土壤"）定植并形成恶性增殖¹。近年来，关于“"种子与土壤"”关系的一些新概念相继提出，例如前转移微环境的诱导（被概念化为“"肥沃的土壤"”，以支持“"种子"”的生长）、DTCs对原发肿瘤的自我播种、“"种子"”在继发器官中的休眠状态，以及转移的平行进展模型²。

对于大多数实体恶性肿瘤，播散性肿瘤细胞（DTCs）可在多种间充质器官中存活并被检测到，例如在有或无临床转移证据的患者中，其骨髓和淋巴结（LNs）均可能发现DTCs。由于肿瘤引流淋巴结是DTC局部区域扩散的首个部位，因此淋巴结状态是一项重要的预后指标，常与辅助治疗决策相关³。对于某些肿瘤类型，淋巴结状态与较差预后之间的关联尤为显著，包括头颈部^4,5、乳腺⁶、前列腺⁷、肺⁸、胃⁹、结直肠^10,11和甲状腺癌¹²。

淋巴结（LNs）是淋巴系统中的小型卵圆形器官，表面覆盖网状细胞，并由淋巴管包绕。这些器官对免疫系统的功能至关重要¹³。淋巴结作为免疫循环细胞的趋化平台，促使淋巴细胞与抗原呈递细胞聚集在一起¹⁴。然而，淋巴结也会吸引循环中的肿瘤细胞。数十年来，人们一直认为淋巴结只是转移性肿瘤细胞被动运输的通道。但近期研究表明，淋巴管内皮细胞分泌的趋化性（趋化因子）和/或黏附性（细胞外基质成分）信号可主动引导肿瘤细胞向淋巴结迁移¹⁵。例如，肿瘤细胞中CCR7受体的过表达有助于引导转移性黑色素瘤细胞向肿瘤引流淋巴结移动¹⁶。此外，淋巴结中的细胞外蛋白为循环肿瘤细胞的招募和存活提供了黏附性支架¹⁷。事实上，肿瘤引流淋巴结为播散性肿瘤细胞（DTCs）的定植提供了适宜的微环境，这些细胞可通过特定的淋巴结微环境信号维持在增殖状态或休眠状态¹⁸。这些驻留于淋巴结中的DTCs的最终命运尚存争议；一些研究认为这些细胞仅是转移进展的被动指标¹⁹，而另一些研究则提出它们更可能是耐药性的起源（通过自我回种原发灶），和/或作为转移的细胞储存库（播散"种子"以促进继发性癌症生长）^20,21。最近，利用临床前模型研究发现，部分驻留于淋巴结中的DTCs可主动侵入血管，进入血液循环并定植于肺部²¹。

鉴于淋巴结（LNs）中存在癌细胞是癌症侵袭性和侵袭行为的标志，本研究中，我们优化了Brodt建立的经典方法²²，以在体外定量测定肿瘤细胞与淋巴结的黏附能力。通过采用基于荧光的检测方法，我们开发出一种低成本、快速、灵敏且环境友好（非放射性）的方案，用于检测肿瘤细胞与淋巴结冷冻切片之间的黏附性变化。以表达不同水平NDRG4基因的MCF-7乳腺癌细胞和大鼠淋巴结冷冻切片为例，我们证明该方案能够实现体外肿瘤细胞对淋巴结的黏附能力与乳腺癌患者中观察到的淋巴结转移之间良好的相关性²⁴。

方案

通过颈椎脱位处死健康的成年Wistar大鼠后，从新鲜尸体中获取淋巴结。我们遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物疼痛与痛苦的指导原则，所有操作均获得中国台湾叙利亚-黎巴嫩医院研究与教育研究所伦理委员会及动物研究委员会（CEUA P 2016-04）的批准。

注意：所有新鲜冷冻组织均被视为生物危害物，应采用适当的生物安全防护措施进行处理。

1. 淋巴结切除与冷冻切片

1. 将成年Wistar大鼠（180–220 g）的新鲜尸体置于室温下的清洁解剖板上，仰卧放置。
   注意：必须在安乐死后30分钟内采集淋巴结（LN）。
2. 用70%异丙醇喷洒大鼠尸体，并使用无菌器械进行淋巴结采集。
3. 借助镊子提起腹部皮肤，沿中线切开体腔，避免损伤下方组织，暴露腹腔内脏。拉出肠管后，胸腔和腹腔淋巴结即可见（图1）。
4. 使用钝头剪刀小心地从每只大鼠体内切除淋巴结，避免损伤其后方的肠系膜上动脉。
   注意：根据所切除淋巴结的位置，需清除附着在其上的其他组织，例如肠系膜组织。
5. 将采集的淋巴结放入含有5 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的15 mL锥形管中。
6. 妥善处理大鼠尸体。
7. 从PBS中取出新鲜淋巴结，在干燥滤纸上滚动并吸干。将其置于小培养皿中，加入冷冻组织包埋剂（O.C.T.）处理2分钟。
8. 将淋巴结转移至冷冻模具底部，底面朝下，调整至所需位置，加入适量O.C.T.覆盖组织，避免组织周围产生气泡。切片面为冷冻模具的底面。
9. 立即在装有干冰的泡沫塑料冷藏箱中对冷冻模具进行速冻。当仍有少量O.C.T.未完全冻结时（约20–35秒），将样品转移至铝箔中，并放入含干冰的冷藏箱继续冷冻，同时处理其他样品。最后，将所有样品储存于-80 °C直至切片。
10. 使用冷冻切片机对淋巴结进行切片，调节切片厚度为5–8 µm。将冷冻切片转移至载玻片上。
    注意：切片前，将冷冻样品从-80 °C冰箱中取出，在冷冻切片机切片室（-22 °C）中平衡约30分钟。含淋巴结的载玻片可在-80 °C保存长达一个月。

2. 使用荧光染料进行细胞标记

注意：荧光染料在细胞生物学中被广泛使用。我们倾向于使用长链二烷基碳菁类染料标记（DiI(C₁₈)，激发波长 549 nm，发射波长 565 nm），因为这类染料荧光强、稳定性高，可直接加入培养基中，且不影响细胞活力或细胞黏附特性^25,26。

1. 在理想条件下（即在完全培养基中）培养的细胞进行消化，并重悬于无血清培养基中，细胞密度为 10⁶ 个细胞/mL。
2. 取 1 mL 细胞悬液（含 10⁶ 个细胞）加入 15 mL 圆底离心管中，加入 Dil(C₁₈)（终浓度 2 µg/mL），在 37 °C 孵育 10 分钟。
   注意：5 分钟后轻轻振荡离心管，以避免细胞沉淀导致沉淀细胞染色不足。细胞密度较高时，需延长孵育时间以确保染色均匀。不同细胞系的最佳染色孵育时间可能不同，可通过常规 FL2 流式细胞术检测通道进行更准确的评估（图 2A）。
3. 将标记后的细胞悬液在 300 × g 离心 4 分钟。
4. 弃上清，用 10 mL 无血清培养基洗涤两次，收集呈红色的细胞沉淀。将细胞重悬于含 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）的无血清培养基中，调整细胞密度至 10⁶ 个细胞/mL。

3. 使用多聚赖氨酸溶液或牛血清白蛋白（BSA）预包被培养皿作为接种对照（可选步骤）

注意：我们使用预先包被多聚赖氨酸（PLL）的细胞培养皿作为阳性加载对照表面，以确保不同实验组的肿瘤细胞接种数量一致，同时使用牛血清白蛋白（BSA）包被的表面作为阴性对照。

1. 在无菌条件下，向24孔板中直接加入300 µL PLL（0.1% w/v，溶于H₂O）或BSA（用H₂O稀释至2.5% w/v），以制备PLL或BSA包被的孔板，4 °C孵育过夜。
2. 用抽吸法去除溶液，用无菌PBS轻轻冲洗孔板表面，然后在组织培养超净台中室温下晾干，再进行细胞接种。
   注意：PLL或BSA的最终体积需根据不同孔板的表面积进行调整。

4. 在淋巴结冰冻切片或PLL/BSA包被的孔板中接种荧光标记的肿瘤细胞

注意：作为实验对照，我们使用了（1）预先包被PLL或BSA的细胞培养皿，以及（2）每次实验中同一淋巴结（LN）的连续切片（详见图2D）。后者可最大限度减少各LN切片间细胞外基质（ECM）成分的区域差异，而这种差异可能影响细胞黏附率。在进行以下肿瘤细胞黏附实验时，请选择高质量且连续的LN冷冻切片。

1. 用 PBS 轻柔洗涤冷冻切片两次，并在室温下用 PBS 重悬 15 分钟。
2. 在 37 °C 下用 2.5% BSA 封闭冷冻切片以阻断非特异性黏附，持续 30 分钟。使用免疫组织化学洗涤槽和载片架，确保在洗涤和孵育过程中完全去除 O.C.T. 包埋剂。
3. 将多余的 BSA 溶液用干燥的纸巾吸干，用棉签擦干淋巴结切片周围的轮廓，并用 PAP 笔围绕切片画圈。
4. 进行肿瘤细胞黏附实验时，向每个画圈的淋巴结切片或 24 孔 PLL 包被板中的孔加入 100 µL 细胞悬液（来自步骤 2.4），然后将其置于常规细胞培养孵箱内的加湿孵育架中，在 37 °C 下孵育 1–2 小时。
   注意：细胞悬液的终体积需根据不同画圈淋巴结的面积进行调整。
5. 用 PBS 轻柔洗涤四次以去除未黏附的细胞，在室温下用含 3.7% 甲醛的 PBS 固定剩余的黏附荧光细胞 15 分钟。

5. 黏附指数的手动定量分析

注意：粘附指数（即肿瘤细胞数/淋巴结 mm²）通过使用 10 倍物镜，在多个独立视野的淋巴结区域（使用美国国立卫生研究院的 ImageJ/FIJI 软件获取）中，手动计数可在光学显微镜下清晰识别并经荧光显微镜确认的肿瘤细胞数量而获得（图 2D）。

1. 使用配备10倍物镜的荧光显微镜，分别在对应明场和红色荧光场的两个通道中采集独立的TIFF图像（图2D）。系统地命名并保存这些图像。
2. 启动 ImageJ/FIJI，打开图像并设置比例尺。必须使用校准标尺（例如，1 mm 的微米尺）图2C).
3. 打开微米尺（或镜台测微尺）的照片，选择 直线工具 并画一条直线，以定义已知距离。
4. 在 分析 菜单，选择 设定比例尺。该 像素距离 将根据第5.3步中绘制的线条长度（以像素为单位）进行填充。 已知距离 将用实际距离（在此情况下，单位为毫米）填充，并在“长度单位”字段中填入长度单位（在此情况下，单位为毫米）。
5. 点击 全球 （此校准适用于本次 ImageJ/FIJI 会话中打开的所有图像），然后按 好的.
6. 淋巴结区域定量：选择 Wand 工具 双击打开 魔棒工具 设置。将模式设为 8-连通单击图像并调整容差，直至选中图像中的所有淋巴结，然后按 好的. 要测量面积，打开 分析 | 测量（CTRL + M）该区域的面积以先前设定的单位表示。
7. 肿瘤细胞定量：在FIJI软件中打开明场显微镜/荧光图像。选择 插件 | 分析 | 细胞计数器 | 细胞计数器单击要量化的照片并按下 初始化 细胞计数器窗口中的按钮。选择计数类型（1-8），然后点击照片中的细胞。要初始化下一张照片，请按下 重置 在细胞计数器窗口中点击按钮，打开新照片并重复所有步骤。
   注：淋巴结粘附指数表示为每平方毫米淋巴结覆盖面积上的粘附肿瘤细胞数量（细胞/mm²）²).

结果

我们通过检测表达不同水平NDRG4基因（即NDRG4阳性与NDRG4阴性细胞）的红色荧光MCF-7乳腺癌细胞在淋巴结（LN）中的黏附能力来展示该检测方法，其中NDRG4是细胞表面β1-整合素簇集的负向调节因子²⁴，通过分析大鼠LN中黏附的肿瘤细胞比例进行评估。本方案的原始图像示例如图2所示。如图2B所示，黏附细胞呈圆形，且在LN中呈异质性分布。NDRG4阴性MCF-7细胞的LN黏附指数（877 ± 124 个细胞/mm² LN）是NDRG4阳性MCF-7细胞（412 ± 76 个细胞/mm² LN，p = 0.03）的2倍（图2D）。

讨论

癌细胞通过淋巴系统扩散需要多种复杂的细胞驱动事件。这些事件始于癌细胞从原发肿瘤脱落以及细胞外基质（ECM）结构的重塑，并依赖于持续的趋化作用以及癌细胞主动迁移穿过传入淋巴管，最终到达前哨淋巴结。如果癌细胞在淋巴结中黏附并存活，就可能迅速扩散至其他继发器官。本文介绍一种简便、快速且低成本的方法，用于分析肿瘤细胞与冷冻淋巴结之间特异性黏附相互作用的功能。

从结构上看，淋巴结（LNs）是由致密且广泛的细胞外基质（ECM）纤维网络构成的独立海绵样组织，这些纤维常被称为"网状纤维"，可作为细胞迁移的路径，并在淋巴结实质内快速传递可溶性因子（如抗原和/或趋化因子）²⁷。本检测中冷冻淋巴结所保留的网状纤维可支持趋化性信号，并为肿瘤细胞在体外的黏附提供支架。这些纤维主要由结构性蛋白（如I型和III型胶原蛋白）以及次要的ECM成分（如纤连蛋白、腱生蛋白、层粘连蛋白、玻璃粘连蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖）构成^28,29。在细...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 离心管	康宁	352096
2-丙醇	默克	109634
台式层流罩	Esco 细胞培养
光盘收纳盒	Leica	14020139126
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9647-100
细胞培养瓶 T-25 cm2	康宁	430372
冷冻切片机	Leica	CM1860 UV
冷冻切片机-带磁铁的刷子	Leica	14018340426
DiIC18 细胞示踪染料	分子探针	V-22885
胎牛血清（FBS）	Life Technologies	12657-029
荧光显微镜	尼康 Eclipse 80
Forma Series II CO2 培养箱	赛默飞世尔科技
甲醛	Sigma-Aldrich	252549
高轮廓一次性剃须刀	Leica	14035838926
孵育立方体（IHC）	KASVI	K560030
倒置显微镜	奥林巴斯	CKX31
异氟烷 100 mL	克里斯特ália
液体封片笔 Super Pap Pen	Abcam，生命科学试剂	ab2601
最佳切割温度 "OCT" 化合物	樱花	4583
磷酸盐缓冲液（PBS）	Life Technologies	70011-044
聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P8920
RPMI	Gibco	31800-022
1 mL 血清移液管	Jet Biofil	GSP010001
10 mL 血清移液管	Jet Biofil	GSP010010
2 mL 血清移液管	Jet Biofil	GSP010002
5 mL 血清移液管	Jet Biofil	GSP010005
50 mL 血清移液管	Jet Biofil	GSP010050
血清移液器 Easypet 3	Eppendorf
Tissue-Tek 冷冻模具	樱花	4557
0.4% 台盼蓝	Invitrogen	T10282
胰蛋白酶	阿道夫·卢茨研究所	ATV