淋巴结冷冻切片中肿瘤细胞黏附的定量分析

摘要

本文介绍一种简单且经济的方法，可用于定量分析肿瘤细胞在淋巴结（LN）冷冻切片上的黏附情况。通过光学显微镜可轻松识别黏附于淋巴结的肿瘤细胞，并采用基于荧光的方法进行确认，从而获得反映肿瘤细胞与淋巴结实质结合亲和力的黏附指数。

摘要

肿瘤引流淋巴结（LNs）不仅仅是过滤肿瘤代谢废物的结构，它们还是多种癌症患者体内播散性肿瘤细胞最常见的区域性暂居部位之一。检测这些驻留在淋巴结中的肿瘤细胞是与不良预后及辅助治疗决策相关的重要生物标志物。近期的小鼠模型研究表明，驻留于淋巴结中的肿瘤细胞可能是远端转移恶性细胞的重要来源。在聚焦于识别与淋巴道/转移性播散相关基因或信号通路的实验研究中，定量分析肿瘤细胞与淋巴结实质之间黏附能力是一项关键指标。由于淋巴结是复杂的三维结构，在组织切片中其形态和组成会因切面方向不同而呈现多样性，因此其基质在体外实验中难以以完全可控的方式被准确模拟。本文介绍一种简单且经济的方法，可用于定量分析肿瘤细胞对淋巴结冷冻切片的黏附性。通过使用同一淋巴结的连续切片，我们改进了Brodt建立的经典方法，采用非放射性标记物，并直接计数每单位淋巴结表面积上黏附的肿瘤细胞数量。通过光学显微镜可清晰识别黏附于淋巴结的肿瘤细胞，并通过基于荧光的方法加以确认，从而获得反映肿瘤细胞与淋巴结实质结合亲和力的黏附指数。该指数为整合素与其相应淋巴结配体之间结合亲和力发生分子水平改变提供了提示性证据。

引言

癌症转移是治疗失败的主要原因，也是癌症威胁生命的主要方面。正如130年前所提出的，转移扩散的发生是由于一群具有优势特性的播散性肿瘤细胞（DTCs，即“"种子"）获得了特定的生物学能力，使其能够逃离原发灶，并在远处器官（即“"土壤"）定植并形成恶性增殖¹。近年来，关于“"种子与土壤"”关系的一些新概念相继提出，例如前转移微环境的诱导（被概念化为“"肥沃的土壤"”，以支持“"种子"”的生长）、DTCs对原发肿瘤的自我播种、“"种子"”在继发器官中的休眠状态，以及转移的平行进展模型²。

对于大多数实体恶性肿瘤，播散性肿瘤细胞（DTCs）可在多种间充质器官中存活并被检测到，例如在有或无临床转移证据的患者中，其骨髓和淋巴结（LNs）均可能发现DTCs。由于肿瘤引流淋巴结是DTC局部区域扩散的首个部位，因此淋巴结状态是一项重要的预后指标，常与辅助治疗决策相关³。对于某些肿瘤类型，淋巴结状态与较差预后之间的关联尤为显著，包括头颈部^4,5、乳腺⁶、前列腺^7<....

方案

通过颈椎脱位处死健康的成年Wistar大鼠后，从新鲜尸体中获取淋巴结。我们遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物疼痛与痛苦的指导原则，所有操作均获得中国台湾叙利亚-黎巴嫩医院研究与教育研究所伦理委员会及动物研究委员会（CEUA P 2016-04）的批准。

注意：所有新鲜冷冻组织均被视为生物危害物，应采用适当的生物安全防护措施进行处理。

1. 淋巴结切除与冷冻切片

1. 将成年Wistar大鼠（180–220 g）的新鲜尸体置于室温下的清洁解剖板上，仰卧放置。
   注意：必须在安乐死后30分钟内采集淋巴结（LN）。
2. 用70%异丙醇喷洒大鼠尸体，并使用无菌器械进行淋巴结采集。
3. 借助镊子提起腹部皮肤，沿中线切开体腔，避免损伤下方组织，暴露腹腔内脏。拉出肠管后，胸腔和腹腔淋巴结即可见（图1）。
4. 使用钝头剪刀小心地从每只大鼠体内切除淋巴结，避免损伤其后方的肠系膜上动脉。
   注意：根据所切除淋巴结的位置，需清除附着在其上的其他组织，例如肠系膜组织。
5. 将采集的淋巴结放入含有5 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的15 mL锥形管中。
6. 妥善处理大鼠尸体。
7. 从PBS中取出新鲜淋巴结，在干燥滤纸上滚动并吸干。将其置于小培....

结果

我们通过检测表达不同水平NDRG4基因（即NDRG4阳性与NDRG4阴性细胞）的红色荧光MCF-7乳腺癌细胞在淋巴结（LN）中的黏附能力来展示该检测方法，其中NDRG4是细胞表面β1-整合素簇集的负向调节因子²⁴，通过分析大鼠LN中黏附的肿瘤细胞比例进行评估。本方案的原始图像示例如图2所示。如图2B所示，黏附细胞呈圆形，且在LN中呈异质性分布。NDRG4阴性MCF-7细胞的LN黏附指数（877 ± 124 个细胞/mm² LN）是NDRG4阳性MCF-7细胞（412 ± 76 个细胞/mm² LN，p = 0.03）的2倍（图2D）。

讨论

癌细胞通过淋巴系统扩散需要多种复杂的细胞驱动事件。这些事件始于癌细胞从原发肿瘤脱落以及细胞外基质（ECM）结构的重塑，并依赖于持续的趋化作用以及癌细胞主动迁移穿过传入淋巴管，最终到达前哨淋巴结。如果癌细胞在淋巴结中黏附并存活，就可能迅速扩散至其他继发器官。本文介绍一种简便、快速且低成本的方法，用于分析肿瘤细胞与冷冻淋巴结之间特异性黏附相互作用的功能。

从结构上看，淋巴结（LNs）是由致密且广泛的细胞外基质（ECM）纤维网络构成的独立海绵样组织，这些纤维常被称为"网状纤维"，可作为细胞迁移的路径，并在淋巴结实质内快速传递可溶性因子（如抗原和/或趋化因子）²⁷。本检测中冷冻淋巴结所保留的网状纤维可支持趋化性信号，并为肿瘤细胞在体外的黏附提供支架。这些纤维主要由结构性蛋白（如I型和III型胶原蛋白）以及次要的ECM成分（如纤连蛋白、腱生蛋白、层粘连蛋白、玻璃粘连蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖）构成^28,29。在细.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 离心管	康宁	352096
2-丙醇	默克	109634
台式层流罩	Esco 细胞培养
光盘收纳盒	Leica	14020139126
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9647-100
细胞培养瓶 T-25 cm2	康宁	430372
冷冻切片机	Leica	CM1860 UV
冷冻切片机-带磁铁的刷子	Leica	14018340426
DiIC18 细胞示踪染料	分子探针	V-22885
胎牛血清（FBS）	Life Technologies	12657-029
荧光显微镜	尼康 Eclipse 80
Forma Series II CO2 培养箱	赛默飞世尔科技
甲醛	Sigma-Aldrich	252549
高轮廓一次性剃须刀	Leica	14035838926
孵育立方体（IHC）	KASVI	K560030
倒置显微镜	奥林巴斯	CKX31
异氟烷 100 mL	克里斯特ália
液体封片笔 Super Pap Pen	Abcam，生命科学试剂	ab2601
最佳切割温度 "OCT" 化合物	樱花	4583
磷酸盐缓冲液（PBS）	Life Technologies	70011-044
聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P8920
RPMI	Gibco	31800-022
1 mL 血清移液管	Jet Biofil	GSP010001
10 mL 血清移液管	Jet Biofil	GSP010010
2 mL 血清移液管	Jet Biofil	GSP010002
5 mL 血清移液管	Jet Biofil	GSP010005
50 mL 血清移液管	Jet Biofil	GSP010050
血清移液器 Easypet 3	Eppendorf
Tissue-Tek 冷冻模具	樱花	4557
0.4% 台盼蓝	Invitrogen	T10282
胰蛋白酶	阿道夫·卢茨研究所	ATV