我们提供了一种通过大规模筛选化合物文库来鉴定叶片蒸腾作用调节剂的方法。
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方法文章
通过大规模热成像筛选鉴定向日葵（Helianthus annuus）中植物蒸腾作用的新调控因子
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
植物对生物和非生物胁迫的适应受到多种因素调控，其中气孔开度在水分亏缺或病原体侵染下的调节起着关键作用。因此，鉴定能够调控气孔运动的小分子有助于揭示植物适应环境的生理基础。目前已用于筛选气孔运动调控因子的大规模筛选方法存在潜在局限性：一些方法高度依赖脱落酸（ABA）激素信号通路，因而无法发现不依赖ABA的调控机制；另一些方法则依赖对植物生长发育等间接、长期生理效应的观察。本文所介绍的筛选方法可实现对植物进行大规模化学物质处理，并结合热成像技术直接量化其蒸腾作用。由于蒸腾过程中水分的蒸发会导致叶片表面降温，热成像技术为无创监测气孔导度随时间的变化提供了有效手段。在本实验方案中，向日葵（Helianthus annuus）幼苗采用水培方式培养，随后通过根部饲喂法进行处理，即切断主根并将其浸入待测化学物质溶液中。通过热成像技术监测子叶温度随时间的变化，并进行统计分析，从而识别出可调节气孔开度的生物活性分子。我们的概念验证实验表明，化学物质可在10分钟内从被切断的根部运输至向日葵幼苗的子叶。此外，当以ABA作为阳性对照处理植物时，可在数分钟内检测到叶片表面温度的升高。因此，该方法可高效、快速地鉴定出调控气孔开度的新分子。
引言
植物的胁迫耐受性是一种受多种分子、细胞、发育和生理特征及机制影响的多基因性状1。在不断变化的环境中，植物需要持续调节气孔运动，以平衡光合作用对碳的需求，同时维持足够的水分并防止病原体侵入2；然而，这些权衡"决策"背后的机制尚不明确3。将生物活性分子引入植物可调节其生理状态，并有助于探索新的调控机制。
大规模筛选小分子是一种在抗癌药物发现和药理学检测中广泛使用且行之有效的策略，可在短时间内测试数百至数千种分子的生理效应4,5。在植物生物学领域，高通量筛选已展现出其有效性，例如成功鉴定了合成小分子吡啶脱落酸（pyrabactin）6，以及长期寻找的脱落酸（abscisic acid, ABA）受体7,8。自那以来，研究人员已鉴定出多种ABA受体的激动剂和拮抗剂，以及能够调控ABA诱导型报告基因表达的小分子9,10,
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方案
1. 植物的培养
- 在无孔的标准 10 英寸 × 20 英寸（254 mm × 501 mm）植物托盘中加入一层 4 cm 厚的细蛭石。
- 将种子承载器（见材料表）以 2 cm 间距放置于植物托盘中。
- 用蛭石填满种子承载器。
- 将向日葵种子尖端朝下放入每个种子承载器中，轻轻下压，使种子的一半仍暴露在外。
注意：向日葵种子为不对称结构，将来胚根将从其尖端伸出，因此必须朝下放置。正确的种子朝向至关重要，因为在种子承载器内无法重新调整根和茎的方向。种子的圆端应伸出承载器顶部之外。 - 种子放置完毕后，再覆盖一层 2 cm 厚的细蛭石。从上方喷雾加水，确保一小时后表面仍保持湿润。若达到此状态，则用盖子盖住托盘。
- 在人工气候室或温室中培养植株。推荐条件为：光照强度 140 µmol photons·m-2·s-1，光周期为 16 小时光照（22 °C）和 9 小时黑暗（20 °C），持续 5 天。
注意：除非表面明显变干，否则无需额外浇水。
2. 水培系统的设置
- 选择一个适合水培植物生长的适当尺寸容器。容器的大小应根据生长室或温室中的可用空间进行调整。建议容器最小深度为 15 cm。
- 用蒸馏水注满容器，并按照生产....
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结果
使用红色染料赤藓红B（0.8 kDa）进行的实验表明，化学物质可在10分钟内通过切根明显地被吸收，并进入向日葵幼苗的子叶中（图1）。
当植物用脱落酸（ABA）处理后，几分钟内即可检测到向日葵子叶的叶片温度升高。叶片温度的升高与气孔开度和气孔导度的下降相关。在施用10 µM ABA后15分钟（p值 = 0.02）和5 µM ABA后20分钟（p值 = 0.003）均观察到叶片温度升高（图2）。总体而言，这些结果表明，通过热成像法测量叶片温度是评估气孔开度和导度的一个良好替代指标。
图3展示了一项概念验证实验，该实验使用NatProd化合物库中的20种化合物子.......
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讨论
每天能够测试的化合物数量主要取决于（i）用于种植植物和开展筛选实验的受控环境空间，以及（ii）可参与本方案第6步操作的人员数量。我们建议设置三个实验重复，以便在统计分析后更可靠地解释实验结果。在典型的工作日中，一至两名人员可在上午、中午和下午轻松完成60种化合物的三重复筛选，例如测试[60种化合物 + 6个阴性对照（DMSO）+ 3个阳性对照（ABA）]。
该方法依赖于具有完全发育子叶的健康幼苗。由于成像是从上方进行的，理想的幼苗下胚轴与子叶叶片之间应呈90°夹角，以尽可能获取最多的信息。该角度主要受光调控，因此应通过优化生长条件来调整。我们的结果表明，化学物质到达子叶约需10分钟，而对ABA等化学物质产生响应还需数分钟。这一观察结果使得步骤6.4成为本实验方案中最关键的时间敏感步骤。因此，必须在少于15分钟内完成对同一批次中所有植株的处理，以避免植株间响应差异。在被动影响叶片温度测量的外部因素中，通风可能引入与位置相关的偏差或导致重复样本间出现显著变异。使用者应谨慎控制通风气流，并在记录前随机分布样品以减少位置相关偏差。为排除其他潜在因素的影响，记录时的温度、湿度和光照条件应与植.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由Pomona学院启动资金和Hirsch研究启动基金（资助FJ）以及通过Stellar暑期研究助理项目（资助KG）的Pomona学院分子生物学项目提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1020 型无排水孔塑料育苗盘 | 标准 10 x 20 英寸育苗盘 | ||
| 2.0 mL 无盖微量离心管 | Genesee Scientific | 22-283NC | |
| 脱落酸（ABA） | Sigma-Aldrich | A1049 | |
| 气泵 | Active Aqua | AAPA7.8L | 双出气口，3W，7.8 L/min |
| 气石 | |||
| 化合物库 | MicroSource Discovery | 天然产物库 | |
| Creative Versa-Tool（电热雕刻笔） | Nasco | 9724549 | |
| 二甲基亚砜（DMSO），适用于植物细胞培养 | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| 矮生太阳斑点向日葵种子 | Outsidepride.com | ||
| 赤藓红B | Sigma-Aldrich | 200964 | |
| 水培营养液套装（FloraBloom、FloraGrow、FloraMicro） | General Hydroponics | GL51GH1421.31.11 | |
| Kimwipes 精细擦拭纸 | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| 笔记本电脑 | Dell | ||
| MES 水合物 | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| 显微解剖剪 | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| 氢氧化钾（KOH） | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| ResearchIR 软件 | FLIR | ||
| R-Tech 刚性聚苯乙烯泡沫板 | Insulfoam | ||
| 种子固定夹 | Araponics | N/A | |
| Super Tub（塑料工具箱） | Maccourt | ST3608 | 36 x 24 x 8 英寸水培用箱 |
| T450sc LWIR（长波红外）手持式热成像相机 | FLIR | FLIR-T62101 | 配备必需的充电线缆和用于连接笔记本电脑的 USB 线缆 |
| 蛭石 | |||
| 水过滤器 | SunSun | HW-304B Pro Canister Filter |
参考文献
- Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. Plant adaptation to drought stress. F1000Research. 5, (2016).
- McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. Gate control: guard cell regulation by microbial stress. The New Phytologist. 203 (4), 1049-1063 (2014).
- Leung, J., Bazihiz....
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