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通过大规模热成像筛选鉴定向日葵（Helianthus annuus）中植物蒸腾作用的新调控因子

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DOI：

10.3791/60535

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2020年1月30日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology and Program in Molecular Biology, Pomona College

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们提供了一种通过大规模筛选化合物文库来鉴定叶片蒸腾作用调节剂的方法。

摘要

植物对生物和非生物胁迫的适应受到多种因素调控，其中气孔开度在水分亏缺或病原体侵染下的调节起着关键作用。因此，鉴定能够调控气孔运动的小分子有助于揭示植物适应环境的生理基础。目前已用于筛选气孔运动调控因子的大规模筛选方法存在潜在局限性：一些方法高度依赖脱落酸（ABA）激素信号通路，因而无法发现不依赖ABA的调控机制；另一些方法则依赖对植物生长发育等间接、长期生理效应的观察。本文所介绍的筛选方法可实现对植物进行大规模化学物质处理，并结合热成像技术直接量化其蒸腾作用。由于蒸腾过程中水分的蒸发会导致叶片表面降温，热成像技术为无创监测气孔导度随时间的变化提供了有效手段。在本实验方案中，向日葵（Helianthus annuus）幼苗采用水培方式培养，随后通过根部饲喂法进行处理，即切断主根并将其浸入待测化学物质溶液中。通过热成像技术监测子叶温度随时间的变化，并进行统计分析，从而识别出可调节气孔开度的生物活性分子。我们的概念验证实验表明，化学物质可在10分钟内从被切断的根部运输至向日葵幼苗的子叶。此外，当以ABA作为阳性对照处理植物时，可在数分钟内检测到叶片表面温度的升高。因此，该方法可高效、快速地鉴定出调控气孔开度的新分子。

引言

植物的胁迫耐受性是一种受多种分子、细胞、发育和生理特征及机制影响的多基因性状1。在不断变化的环境中，植物需要持续调节气孔运动，以平衡光合作用对碳的需求，同时维持足够的水分并防止病原体侵入2；然而，这些权衡"决策"背后的机制尚不明确3。将生物活性分子引入植物可调节其生理状态，并有助于探索新的调控机制。

大规模筛选小分子是一种在抗癌药物发现和药理学检测中广泛使用且行之有效的策略，可在短时间内测试数百至数千种分子的生理效应4,5。在植物生物学领域，高通量筛选已展现出其有效性，例如成功鉴定了合成小分子吡啶脱落酸（pyrabactin）6，以及长期寻找的脱落酸（abscisic acid, ABA）受体7,8。自那以来，研究人员已鉴定出多种ABA受体的激动剂和拮抗剂，以及能够调控ABA诱导型报告基因表达的小分子9,10,11,12,13,14,15。目前用于筛选可调控气孔开度的小分子化合物的高通量筛选方法仍存在一些局限性：（i）围绕ABA信号通路设计的实验方案可能阻碍对新型ABA非依赖性机制的发现；（ii）用于鉴定生物活性小分子的体内策略主要依赖于这些分子对种子萌发或幼苗生长的生理影响，而非直接针对植物蒸腾作用本身的调控。

此外，尽管有多种方法可用于用生物活性分子处理植物，但大多数方法并不适用于大规模研究气孔运动。简而言之，最常见的三种技术是通过喷洒或浸润进行叶片施用、根系处理以及根部灌溉。由于液滴会残留在叶片表面，干扰大规模数据采集，因此叶片施用与最常用且快速的气孔开度检测方法不兼容。根部灌溉的主要局限性在于需要较大的样品体积、化合物可能被根际环境中的组分滞留，以及依赖根系主动吸收。

本文介绍一种大规模筛选调控植物蒸腾作用新化合物的方法，该方法不一定涉及脱落酸（ABA）或已知的抗旱响应机制，且能够对植物进行高效、可靠的处理。在此系统中，采用根部饲喂法处理向日葵（Helianthus annuus）植株，具体操作为：将水培生长的幼苗主根切断，然后将切口浸入待测样品溶液中。处理完成后，利用红外热成像相机测定每种化合物对植物蒸腾作用的影响。由于叶片表面温度的主要决定因素是叶片水分蒸发速率，因此热成像数据可直接关联到气孔导度。化学处理后叶片温度的相对变化 thus 为量化植物蒸腾作用提供了直接手段。

H. annuus 是全球五大最重要的油料作物之一16，直接在该植物上取得的研究发现可能有助于未来技术的转化应用。此外，H. annuus 幼苗具有宽大而扁平的子叶以及粗壮的初生根，非常适于本实验方案的建立。然而，该方法也可轻松适用于其他植物及多种化合物。

该方案可用于有效鉴定能够触发气孔关闭或促进气孔开放的分子，这对于理解调控气孔导度及植物对环境胁迫适应性的信号具有重要意义。

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方案

1. 植物的培养

  1. 在无孔的标准 10 英寸 × 20 英寸（254 mm × 501 mm）植物托盘中加入一层 4 cm 厚的细蛭石。
  2. 将种子承载器（见材料表）以 2 cm 间距放置于植物托盘中。
  3. 用蛭石填满种子承载器。
  4. 将向日葵种子尖端朝下放入每个种子承载器中，轻轻下压，使种子的一半仍暴露在外。
    注意：向日葵种子为不对称结构，将来胚根将从其尖端伸出，因此必须朝下放置。正确的种子朝向至关重要，因为在种子承载器内无法重新调整根和茎的方向。种子的圆端应伸出承载器顶部之外。
  5. 种子放置完毕后，再覆盖一层 2 cm 厚的细蛭石。从上方喷雾加水，确保一小时后表面仍保持湿润。若达到此状态，则用盖子盖住托盘。
  6. 在人工气候室或温室中培养植株。推荐条件为：光照强度 140 µmol photons·m-2·s-1，光周期为 16 小时光照（22 °C）和 9 小时黑暗（20 °C），持续 5 天。
    注意：除非表面明显变干，否则无需额外浇水。

2. 水培系统的设置

  1. 选择一个适合水培植物生长的适当尺寸容器。容器的大小应根据生长室或温室中的可用空间进行调整。建议容器最小深度为 15 cm。
  2. 用蒸馏水注满容器，并按照生产商说明添加通用型水培肥料。配制好的水培溶液应进行充氧并保持持续流动，可通过使用空气泵和水泵实现。
  3. 准备水培浮板。
    1. 将一张 2 cm 厚的挤塑聚苯乙烯泡沫板（见材料表）裁剪至与容器相匹配的尺寸。泡沫板应覆盖容器大部分表面，以减少藻类生长。使用电烙铁切割聚苯乙烯泡沫板效果良好，且适用于本实验方案。
      注意：高温切割聚苯乙烯泡沫板时释放的烟雾或蒸气对健康有严重危害。操作时应佩戴适当的呼吸防护设备。也可在通风橱内进行切割，以满足通风要求。
    2. 使用电烙铁在聚苯乙烯泡沫板上打孔（直径 1–2 cm）。两孔中心之间的距离可根据实验需求调整，但建议最小间距为 2.5 cm。

3. 将幼苗转移至水培系统及植物生长

  1. 轻轻将5天大的幼苗从蛭石中取出，立即转移到盛有水的容器中浸泡30分钟。此步骤可去除多余的蛭石，并软化残留的果皮。此时应能观察到初生根的萌出。
  2. 如有需要，可手动去除果皮壁，以促进子叶后续更好地展开。
  3. 将带有幼苗的种子托架转移至聚苯乙烯泡沫浮板上。在光照强度为140 µmol photons·m-2·s-1、相对湿度65%、光周期为16小时光照（22 °C）和9小时黑暗（20 °C）的条件下培养2天。

4. 治疗前准备

注意：本实验方案用于在含有100 µM ABA的10 mM MES-KOH（pH = 6.2）以及含有1%（v/v）二甲基亚砜（DMSO）的10 mM MES-KOH（pH = 6.2）中，对小型化合物库中的20种化学物质进行三复孔测试，前者作为阳性对照，后者作为阴性对照。

  1. 确保有足够数量的植株可供处理。用于处理的植株应发育至子叶完全展开，但侧根增殖仍处于最低水平。进行一次标准筛选需要69株此类植株。
  2. 从-80 °C冰箱中取出含有小分子化合物的96孔板，在室温下解冻。
  3. 配制80 mL 10 mM MES-KOH缓冲液，用1 M KOH调节pH至6.2。
  4. 标记无盖的2 mL微量离心管。准备至少6个管用于阴性对照处理（含1% (v/v) DMSO的10 mM MES-KOH缓冲液，pH = 6.2）。另准备3个管用于ABA处理（100 µM ABA溶于10 mM MES-KOH缓冲液，pH = 6.2），作为阳性对照。剩余的60个管用于三重复分析20种化学物质的效应。
  5. 将每种化学物质（10 mM DMSO溶液）各10 µL分别加入三个相应标记的管中。将10 µL溶于DMSO的10 mM ABA加入三个管中，将10 µL DMSO加入六个对照管中。
    注意：某些化合物可能具有严重健康危害，使用者必须采取适当的防护措施。
  6. 向69个管中各加入990 µL 10 mM MES-KOH缓冲液（pH = 6.2）。加入MES缓冲液时应施加足够力度以使化学物质与缓冲液充分混匀，但需格外小心，避免用力过大导致液体喷溅出管外。也可选择低速涡旋混匀。

5. 设置热成像相机

  1. 将热成像相机安装在拷贝架上，并将所有电缆连接至笔记本电脑。
    注意：录制应在与植物生长条件相似的温度（20 °C 至 25 °C）、湿度（50% 至 70%）和光照质量（110 至 140 µmol photons·m-2·s-1）下进行。
  2. 先开启相机，再打开笔记本电脑，并启动热成像分析软件。
    注意：后续的录制操作说明适用于特定软件（见材料表）。
  3. 调整录制设置。
    1. 将鼠标悬停在中央窗口顶部的录制红色按钮上，将出现一个下拉菜单，点击扳手图标录制设置。
    2. 选择合适的录制模式和选项。可选用周期录制模式，每分钟采集一帧图像，并手动停止。注意软件保存视频的文件路径。关闭录制设置窗口。

6. 植物材料的准备与处理

  1. 将装有化学试剂的无盖试管放入试管架中。或者，也可按照步骤 2.3 的描述，使用电烙铁在聚苯乙烯泡沫板上切割并打孔，以制作定制的试管架。每个孔的直径应与无盖试管的外径非常接近，以确保试管能够牢固固定。
    注意：在确定如何固定无盖试管时，应考虑相机视野的限制因素。
  2. 将阳性对照管、阴性对照管以及实验管均匀分布在试管架中，以消除因位置差异导致的偏差17。
  3. 在水培植物旁准备好以下材料：显微解剖剪刀、盛有水的浅盘、精细擦拭纸巾，以及装有不同化学试剂的 69 支无盖试管。
  4. 对每株待处理的植物重复以下步骤。向日葵幼苗应始终保留在种子固定器中。
    1. 小心提起种子固定器，并迅速将根部浸入盛有水的浅盘中。
    2. 在水下剪断主根，以防止产生气穴现象。切割位置应在种子固定器最底端下方 0.8–1 cm 处。
    3. 将刚剪切的植株插入含有化学试剂的试管之一中。
    4. 若子叶上有水滴，应用精细擦拭纸巾轻轻吸干。
      注意：这四个步骤必须尽快完成（10 分钟或更短），以避免影响动力学研究的一致性。
  5. 将植株移至热成像相机下方，并确保所有植株均位于相机视野范围内。根据需要调整相机高度和试管架位置。

7. 记录

  1. 通过按下 Ctrl + Alt + A 将相机对焦至子叶表面。
  2. 将鼠标悬停在红色按钮上，然后点击 Record a Movie 选项，此时应弹出一个确认录制的新窗口。
  3. 1-2 小时后停止录制。
    注意：本实验方案可在此处暂停。

8. 数据收集

  1. 转到 文件 | 打开 | 浏览，找到正确的 .SEQ 文件并打开。
  2. 停止播放视频。
  3. 在主窗口左侧，点击 添加测量光标 ROI（3×3 像素） 图标。ROI 是指感兴趣区域。
  4. 将鼠标移至第一株植物子叶的中心位置，单击左键一次。此时光标 1 已放置到位。重复此操作，标记第一株植物的第二个子叶。应记录标签的顺序。
  5. 重复上述操作，为所有植物分别添加两个光标标记。
  6. 点击 编辑 ROI 图标。在主窗口中，按住鼠标左键从左上角拖动至右下角，以选中所有 ROI。
  7. 将鼠标悬停在 统计查看器 图标上，然后选择 时间曲线图。此时将打开一个新窗口。
  8. 运行视频，图表中将自动填充数据。
  9. 在此窗口中，点击右上角的双箭头以打开新菜单。
  10. 点击 保存 图标，选择保存为 图表中的 X 和 Y 值（.csv 格式）。数据导出后，关闭软件。

9. 数据分析

  1. 使用数据分析软件（例如 Microsoft Excel）打开 .csv 文件。请注意，前三个列（A 至 C）提供帧编号、绝对时间和相对时间的信息。其余列则提供每个 ROI 随时间变化的温度数据。
  2. 确定所用统计工具的类型；该决定取决于包括实验设计在内的多种因素。
    注意：在本示例中，基于总体均值和总体标准差，为每个样本计算标准分数（即 z 分数）。然后根据 z 分数为每个样本计算 p 值。该方法可用于验证阳性对照和阴性对照，同时识别出需要进一步测试的新化合物。

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结果

使用红色染料赤藓红B（0.8 kDa）进行的实验表明，化学物质可在10分钟内通过切根明显地被吸收并运输至向日葵幼苗的子叶中（图1）。

当植物用脱落酸（ABA）处理后，几分钟内即可检测到向日葵子叶的叶片温度升高。叶片温度的升高与气孔开度和气孔导度的下降相关。在施用10 µM ABA后15分钟（p值 = 0.02）以及施用5 µM ABA后20分钟（p值 = 0.003），均可观察到叶片温度显著升高（图2）。总体而言，这些结果表明，通过热成像法测量叶片温度是评估气孔开度和导度的一个良好替代指标。

图3展示了一项概念验证实验，该实验使用NatProd化合物库中的...

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讨论

每天能够测试的化合物数量主要取决于（i）用于种植植物和开展筛选实验的受控环境空间，以及（ii）可参与本方案第6步操作的人员数量。我们建议设置三个实验重复，以便在统计分析后更可靠地解释实验结果。在典型的工作日中，一至两名人员可在上午、中午和下午轻松完成60种化合物的三重复筛选，例如测试[60种化合物 + 6个阴性对照（DMSO）+ 3个阳性对照（ABA）]。

该方法依赖于具有完全发育子叶的健康幼苗。由于成像是从上方进行的，理想的幼苗下胚轴与子叶叶片之间应呈90°夹角，以尽可能获取最多的信息。该角度主要受光调控，因此应通过优化生长条件来调整。我们的结果表明，化学物质到达子叶约需10分钟，而对ABA等化学物质产生响应还需数分钟。这一观察结果使得步骤6.4成为本实验方案中最关键的时间敏感步骤。因此，必须在少于15分钟内完成对同一批次中所有植株的处理，以避免植株间响应差异。在被动影响叶片温度测量的外部因素中，通风可能引入与位置相关的偏差或导致重复样本间出现显著变异。使用者应谨慎控制通风气流，并在记录前随机分布样品以减少位置相关偏差。为排除其他潜在因素的影响，记录时的温度、湿度和光照条件应与植...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由Pomona学院启动资金和Hirsch研究启动基金（资助FJ）以及通过Stellar暑期研究助理项目（资助KG）的Pomona学院分子生物学项目提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1020 型无排水孔塑料育苗盘标准 10 x 20 英寸育苗盘
2.0 mL 无盖微量离心管Genesee Scientific22-283NC
脱落酸（ABA）Sigma-AldrichA1049
气泵Active AquaAAPA7.8L双出气口，3W，7.8 L/min
气石
化合物库MicroSource Discovery天然产物库
Creative Versa-Tool（电热雕刻笔）Nasco9724549
二甲基亚砜（DMSO），适用于植物细胞培养Sigma-AldrichD4540
矮生太阳斑点向日葵种子Outsidepride.com
赤藓红BSigma-Aldrich200964
水培营养液套装（FloraBloom、FloraGrow、FloraMicro）General HydroponicsGL51GH1421.31.11
Kimwipes 精细擦拭纸Kimberly-Clark Professional34155
笔记本电脑Dell
MES 水合物Sigma-AldrichM2933
显微解剖剪
Microsoft ExcelMicrosoft
氢氧化钾（KOH）Sigma-AldrichP5958
ResearchIR 软件FLIR
R-Tech 刚性聚苯乙烯泡沫板Insulfoam
种子固定夹AraponicsN/A
Super Tub（塑料工具箱）MaccourtST360836 x 24 x 8 英寸水培用箱
T450sc LWIR（长波红外）手持式热成像相机FLIRFLIR-T62101配备必需的充电线缆和用于连接笔记本电脑的 USB 线缆
蛭石
水过滤器SunSunHW-304B Pro Canister Filter

参考文献

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标签

ABA

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