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方法文章

一种基于定量荧光显微镜的单个脂质体检测方法用于分析单个脂质体之间的组分不均一性

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DOI：

10.3791/60538

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2019年12月13日

 ,  , 
1Center for Nanomedicine and Theranostics, Technical University of Denmark, 2Center for Intestinal Absorption and Transport of Biopharmaceuticals, Technical University of Denmark, 3Department of Health Technology, Technical University of Denmark

本文内容

摘要

本方案描述了脂质体的制备方法，以及如何将这些脂质体固定在表面，并通过荧光显微镜以大规模并行方式对单个脂质体进行成像。该方法可实现对群体中单个脂质体的尺寸和组成非均一性的定量分析。

摘要

大多数利用脂质体作为膜模型系统或药物递送载体的研究依赖于整体检测技术，因此本质上假设所有脂质体集合中的个体均是相同的。然而，新兴的实验平台能够实现对单个脂质体粒子的观测，从而可在单个脂质体上开展高度复杂且定量的蛋白质-膜相互作用或药物载体特性研究，避免了集合平均带来的误差。本文介绍了一种基于荧光显微镜检测技术的单个脂质体制备、检测与分析的实验方案，以支持此类单粒子测量。该系统可并行大规模成像单个脂质体，并用于揭示样品内部的尺寸和组成异质性。此外，本方案还阐述了在单个脂质体水平上研究脂质体的优势、该检测方法的局限性，以及在修改该方案以适用于其他研究问题时需要考虑的重要因素。

引言

脂质体是基于磷脂的球形囊泡，在基础研究和应用研究中均被广泛使用。由于其理化性质可通过改变构成脂质体的脂质组分而轻松调控，因此可作为优良的膜模型系统1,2。此外，脂质体也是应用最广泛的药物递送纳米载体系统，具有改善的药代动力学和药效学特性以及高度的生物相容性3。

多年来，脂质体主要通过整体性技术进行研究，仅能获得系综平均的读出值。这导致大多数研究假设系综中所有脂质体都是相同的。然而，这类系综平均值仅在数据集围绕均值均匀分布时才是准确的；如果数据集包含多个独立的子群，则可能得出错误且有偏倚的结论。此外，假设系综均值能够代表整个群体，可能会忽略脂质体之间非均一性所蕴含的重要信息。直到最近，才出现能够探测单个脂质体的定量分析方法，揭示了单个脂质体在诸如粒径4、脂质组成5,6以及包封效率7等关键理化性质方面存在显著的非均一性，凸显了在单脂质体水平上开展研究的重要性。

在研究脂质体尺寸依赖性的蛋白质-膜相互作用时，群体平均的脂质体特性已被证明会导致结果偏差8,9。传统上，研究人员通常受限于通过具有不同孔径的滤膜挤出法制备具有不同群体平均直径的脂质体9。然而，利用单个脂质体检测技术对单个脂质体直径进行测定后发现，不同群体之间存在显著重叠，例如使用100 nm和200 nm滤膜挤出的脂质体，其尺寸分布的重叠程度高达70%4。这可能会严重干扰基于群体测量的脂质体尺寸依赖性蛋白质-膜相互作用结果10。通过采用单个脂质体检测技术开展膜-蛋白质相互作用研究，研究人员反而利用了样品内部的尺寸多分散性，能够在每一次单一实验中研究广泛范围的脂质体直径，从而推动了关于膜曲率和膜组成如何影响蛋白质向膜募集的新发现4,11,12。单个脂质体检测技术发挥关键作用的另一个领域是蛋白质介导的膜融合机制研究13,14。对于此类动力学测量而言，能够研究单个融合事件，避免了对融合过程进行实验同步的需要，从而获得了在群体测量中因时空平均而无法捕捉到的新机制见解。此外，单个脂质体还被用作膜支架，实现了对单个蛋白质的测量，为跨膜蛋白质的结构动态提供了新的认知15,16。同时，基于蛋白脂质体的实验体系使得研究人员能够研究单个跨膜转运蛋白17和孔形成蛋白复合物18的功能，以及生物活性膜穿透肽的作用机制19。单个脂质体还被用作软物质纳米流体系统，其中表面固定的单个脂质体可作为体积为10-19 L的酶促反应腔室，在极低产物消耗的前提下显著提高了筛选实验的通量和复杂性20。

近年来，单个脂质体检测技术已被用于在前所未有的精细程度上表征药物递送脂质体。研究人员能够量化单个脂质体表面所连接聚合物数量的显著非均一性21。单个脂质体检测技术还实现了在复杂介质（如血液血浆）中对药物递送脂质体的测量，揭示了通过脂质锚定在脂质体表面的组分在暴露于模拟体内循环条件时可能发生解离的现象22。总体而言，单个脂质体检测技术的多功能性和实用性已通过其被应用于解决大量不同科学问题而得到证实，我们预计该方法将继续发展，并在新的科学研究领域中得到广泛应用。

本文介绍了一种基于荧光显微镜的单个脂质体检测方法，可实现对单个脂质体的高通量研究（图1）。为说明该方法的应用，我们利用它来量化同一群体中各个脂质体之间的尺寸和组分不均一性。该检测方法通过荧光显微镜对固定在钝化玻璃表面的单个脂质体进行成像。我们首先描述脂质体制备过程中的关键步骤，以确保脂质体能够被正确地荧光标记并有效固定；随后介绍为促进脂质体固定所需的表面处理方法，并阐述如何控制脂质体在表面的密度至合适水平。我们讨论了获取高质量图像所需的重要显微镜参数，并详细说明如何进行简单的数据分析，从而提取脂质体的尺寸和组分不均一性信息。本通用实验方案可为有兴趣的研究人员进一步开发适用于其特定研究需求的检测方法提供良好基础。

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方案

1. 脂质体的制备

注意：简而言之，脂质体的制备通常包括三个关键步骤：1）制备具有目标脂质组成的干燥脂质膜；2）水化脂质以形成脂质体；3）控制脂质体群体的粒径和层状结构。

  1. 称取脂质，并将其溶解于玻璃小瓶中的叔丁醇:水（9:1）混合液中。
    1. 将POPC（1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷脂酰胆碱；分子量 = 760 g/mol）溶解至50 mM。
    2. 将胆固醇（分子量 = 387 g/mol）溶解至25 mM。
    3. 将DOPE-Atto488（1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-Atto488；分子量 = 1,316 g/mol）溶解至0.1 mM。
    4. 将DOPE-Atto655（1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-Atto655；分子量 = 1,368 g/mol）溶解至0.1 mM。
    5. 将DSPE-PEG2000-生物素（1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[生物素基(聚乙二醇)-2000]；分子量 = 3,017 g/mol）溶解至0.1 mM。
      注意：将脂质加热至55 °C，并使用磁力搅拌以确保脂质完全溶解。也可使用超声水浴。未使用的脂质储备液可在-20 °C下保存数月。
  2. 按POPC:胆固醇:DOPE-Atto488:DOPE-Atto655:DSPE-PEG-生物素的摩尔比68.95:30:0.5:0.5:0.05，将步骤1.1中配制的脂质储备液混合：向一个新的玻璃小瓶中加入138 µL POPC、120 µL 胆固醇、每种荧光标记脂质各500 µL，以及50 µL DSPE-PEG-生物素。
    注意：可根据具体研究问题灵活调整脂质体的确切组成。详见讨论部分。
  3. 松开玻璃小瓶的瓶盖，并将小瓶在液氮中快速冷冻。
  4. 将冻结的脂质混合物冷冻干燥过夜。
  5. 向干燥的脂质中加入1 mL 200 mM D-山梨醇缓冲液（山梨醇缓冲液）。
  6. 将混合物加热至45 °C，并持续磁力搅拌至少1小时。
    注意：缓冲液的选择应根据具体研究问题而定（例如，研究膜蛋白相互作用时采用生理条件，或研究药物递送脂质体时采用特定的临床批准缓冲液）。然而，若研究无需特定缓冲液，则可使用无离子缓冲液进行水化，以降低脂质体的多层性。
  7. 将脂质悬液通过浸入液氮中的方式冷冻，并等待悬液完全冻结。
  8. 将冻结的悬液浸入55 °C的加热浴中，直至混合物完全解冻。
  9. 重复步骤1.7和1.8，使脂质体悬液总共经历11次冻融循环。
    注意：反复冻融循环已被证明可降低脂质体的多层性23，这对于单个脂质体检测的准确性至关重要，因为多层脂质体会扭曲脂质体荧光强度与尺寸之间的比例关系。当配方中包含超过0.5%的聚乙二醇化脂质时（如药物递送脂质体中常见情况），多层性通常天然较低24。
  10. 使用微型挤出装置将脂质体悬液通过800 nm聚碳酸酯滤膜挤出一次。按照制造商说明组装挤出装置（见材料表）。
  11. 将脂质体在4 °C下保存过夜。

2. 成像室表面准备

  1. 在10 mM HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）95 mM NaCl缓冲液（HEPES缓冲液）中配制牛血清白蛋白（BSA；1 mg/mL）、生物素化牛血清白蛋白（BSA-biotin；1 mg/mL）和链霉亲和素（streptavidin；0.025 mg/mL）。
    注意：为防止脂质体破裂，用于水化的山梨醇缓冲液和用于表面制备的HEPES缓冲液应保持等渗。因此，建议在实验前检测缓冲液的渗透压。
  2. 取1,200 µL BSA与120 µL BSA-biotin混合，将300 µL该混合液加入8孔显微镜载玻片的每个孔中。
    注意：此处我们使用一种市售的底部为玻璃的8孔显微镜载玻片（见材料表），但该方案可轻松适配于定制的显微镜腔室。
  3. 将载玻片在室温（RT）下孵育20分钟。
  4. 用300 µL HEPES缓冲液洗涤载玻片8次。
    注意：注意不要让孔中无缓冲液超过几秒钟，因为表面干燥会对其造成损伤。此外，注意不要用移液器吸头刮伤表面，否则也会造成损伤。因此，在从孔中吸取缓冲液时，应从边缘或角落吸取。
  5. 加入250 µL链霉亲和素，在室温下孵育10分钟。
  6. 重复步骤2.4中所述的8次洗涤步骤。
  7. 在每个孔中加入300 µL山梨醇缓冲液，将显微镜载玻片置于4 °C保存。溶剂蒸发会损伤表面，因此若制备好的载玻片不立即使用，应将其放入培养皿中并用封口膜密封。

3. 脂质体固定化

  1. 用山梨醇缓冲液将脂质体悬液稀释至总脂质浓度约为 20 µM。第 1 节中的操作将得到总脂质浓度约为 10 mM 的脂质体悬液。
  2. 将载玻片置于显微镜下，利用玻璃/缓冲液界面增强的激光反射信号作为参考，聚焦到样品池表面。
  3. 用 300 µL 新鲜 HEPES 缓冲液洗涤样品池 4 次。
  4. 取 10 µL 稀释后的脂质体储备液（总脂质浓度 20 µM）加入微量离心管中。
  5. 从样品池中取出 100 µL 缓冲液，加入步骤 3.4 准备好的微量离心管中，充分混匀后，将 110 µL 混合液重新加入样品池中。
  6. 将样品置于显微镜下，使用具备检测脂质体荧光团信号能力的基本显微镜设置，观察脂质体在表面的固定情况。
  7. 目标脂质体表面密度应同时满足两个条件：足够稀疏以便识别单个脂质体，又足够密集以支持高通量测量。通常使用 50 µm × 50 µm 的视野，每帧图像中 300−400 个脂质体为最佳（图 2）。此密度通常可在 5−10 分钟内达到。
    注意：若视野中仅检测到快速移动的荧光颗粒，可能是固定过程中的关键组分（如 BSA-生物素、链霉亲和素、DOPE-PEG-生物素）缺失或浓度过低所致。若未检测到脂质体，可能与脂质体浓度过低、荧光检测设置不当，或成像焦平面未对准玻璃表面有关。
  8. 当达到合适的脂质体表面密度后，用 200 µL HEPES 缓冲液洗涤样品池 3 次。
    注意：需注意脂质体的固定动力学也依赖于其自身性质（如粒径和电荷），因此应针对每种脂质体制剂进行优化。

4. 图像采集

注意：本节内容在很大程度上取决于进行实验的研究人员所使用的显微镜系统。因此，此处将描述成像操作的总体指导原则，但具体设置及其应用方法会因不同显微镜系统的配置而有所差异。例如，某些系统允许自由选择任意所需的发射滤光片组合，而其他显微镜则配备特定的预设滤光片。

  1. 设置显微镜以对单个脂质体进行成像。为确保最佳图像质量和后续数据分析，应使用高灰度分辨率和允许对单个脂质体进行过采样的像素设置。建议在50 µm × 50 µm区域内采用16位深度和至少1,024 × 1,024像素。如有条件，可应用线平均以减少噪声（例如，每行扫描3次）。
  2. 选择激发激光功率，既要确保帧间漂白可忽略不计，又要保证信号足够强，以便清晰区分单个脂质体与背景。最佳设置取决于所使用的具体显微镜型号以及荧光染料组合。确保探测器未饱和，否则将影响强度定量的准确性。
  3. 对脂质体中的DOPE-Atto488和DOPE-Atto655荧光染料进行成像需多通道采集。因此，务必依次单独成像各通道，以避免交叉激发。例如，首先在488 nm激发，并在495−560 nm范围内采集发射光；随后在633 nm激发，仅在660−710 nm范围内采集发射光。具体参数将取决于可用的显微镜系统（如激光器和滤光片配置）。
  4. 确保覆盖表面不同区域，至少采集10张样品图像，从而成像不少于3,000个单个脂质体。若表面密度低于每帧300个脂质体，则应采集更多图像。每次获取新图像时均需重新对焦。
    注意：对于双通道成像，应合理命名图像文件，以便在数据分析过程中能够轻松识别同一组脂质体在不同荧光通道中的图像对。
  5. 为量化与组分不均一性测量相关的实验不确定性，应在重新对焦前后对同一脂质体区域进行成像（参见图3及文中描述）。
  6. 将图像从显微镜软件导出为.tiff文件。同一脂质体的两个通道应分别单独导出。

5. 数据分析

注意：此前已采用专门开发的自动化二维高斯拟合程序6,11,12。然而，为了提高该方法的适用性，本文描述了一种可在所有实验室中轻松实施的数据分析流程。

  1. 在 FIJI（FIJI 即 ImageJ）软件中，加载同一成像视野下两个不同荧光通道对应的 .tiff 图像对。
  2. 在 图像 菜单中，选择 颜色，并使用 合并通道 功能创建两个通道的复合图像。
  3. 观察在两个不同通道中成像的脂质体是否表现出良好的共定位，或是否存在明显的漂移。
    注意：如果两个荧光通道之间出现漂移（表现为两个通道信号之间存在系统性且均匀的 X-Y 方向偏移），可使用 FIJI 软件 图像 菜单中的 变换 > 平移 功能对其中一个图像帧进行平移。然而，此类图像处理需谨慎操作。因此，建议在对脂质体成像时尽可能避免发生漂移。
  4. 确保已安装 ComDet 插件（版本 v.0.3.6.1 或更高），若未安装，请在 插件 菜单中进行安装。
  5. 通过进入 插件 菜单并选择 ComDet v.0.3.6.1 > 检测粒子，打开 ComDet 插件以检测颗粒。
  6. 在 ComDet 中，务必选择 分别在两个通道上检测粒子 功能。将 共定位斑点间最大距离 设置为与 粒子近似尺寸 相近的值。通常情况下，对于本文所述的实验设置，4 个像素较为合适。
  7. 信噪比应足以检测到荧光较弱的粒子。在 ComDet 中，将两个通道的 检测灵敏度 均设置为 极弱粒子（SNR = 3），以实现该信噪比。
    注意：尽管该 SNR 值通常适用，但在图像噪声较多（可能导致将噪声误识别为脂质体并产生假阳性）的情况下，可能需要将其设置得更高。
  8. 在点击 确定 前，确保勾选 计算共定位 和 在两个通道中绘制检测到的粒子 的复选框。
  9. 运行分析后，将弹出包含 结果 和 摘要 的两个窗口。将包含共定位数据（检测到的每个粒子的坐标及其积分强度）的 结果 数据表导出至所选的数据处理软件，方法是将该表格保存为 .txt 文件并导入相应软件中。
  10. 确保每个脂质体在数据集中仅被计入一次，而非同时包含 channel1/channel2 和 channel2/channel1 的比值。因此，在步骤 5.11 中，应筛选数据，仅绘制 Abs_frame = 1 的数据。
    注意：通过选择 共定位 = 1，可从分析中排除由图像噪声引起的假阳性结果。但这也同时会排除仅含有两种荧光组分之一的脂质体，从而可能丢失重要的数据点。
  11. 绘制包含每个检测到的脂质体的 强度比值 数据列的直方图。
  12. 所研究脂质体系统的组成非均一性程度由强度比值分布的宽度表示。为量化该非均一性，使用高斯函数拟合强度比值直方图，并提取均值（µ）和标准差（sigma）。参见代表性结果部分。
  13. 现在可通过变异系数计算非均一性程度（DI）的数值，定义为 DI = sigma / µ。

6. 脂质体尺寸校准

  1. 取出部分脂质体储备液，按照步骤1.10所述方法，通过50 nm聚碳酸酯滤膜挤出21次。
  2. 将10 µL脂质体悬液加入800 µL山梨醇缓冲液中，于微量离心管中稀释脂质体。
  3. 将稀释后的脂质体样品转移至聚丙烯一次性比色皿中。
  4. 使用动态光散射（DLS）测量粒径。至少进行三次独立测量，以确定脂质体悬液的粒径及多分散性。
    注意：如有必要，可使用浓度更高的脂质体悬液进行测量。除DLS外，也可采用其他方法（如纳米颗粒跟踪分析）测定脂质体粒径。此类粒径测定方法的具体操作说明不在本实验方案的范围内。
  5. 使用与步骤4.1和4.2中完全相同的实验设置，在显微镜下对校准用脂质体进行成像。
  6. 提取校准图像中每个校准脂质体的积分荧光强度：按照步骤5.1−5.10所述方法，提取包含脂质体荧光强度的滤过结果表；从结果表中提取"IntegratedInt"列。
  7. 由于膜标记脂质体的总积分荧光强度与其表面积成正比，因而与其直径的平方成正比，因此绘制校准脂质体荧光强度的平方根强度直方图。
  8. 使用对数正态分布拟合步骤6.7中生成的积分强度直方图，并提取校准脂质体的平均荧光强度。
  9. 为确定平方根强度（IntSqrt）与脂质体尺寸之间的关系，利用DLS测量得到的粒径数量加权平均值（Dia）计算校正因子（C）：Dia = C × IntSqrt 等价于 C = Dia / IntSqrt。
  10. 计算组分非均一性实验中脂质体的IntSqrt值，并通过乘以校正因子将其转换为直径。
  11. 绘制组分非均一性脂质体的强度比值随直径变化的关系图，从而获得在约50 nm−800 nm粒径范围内的脂质体群体中，非均一性随脂质体尺寸变化的分布情况。

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结果

按照所述方案操作，可实现对单个脂质体的大规模并行成像（图1）。当将脂质体溶液加入样品腔室时（方案中的步骤3.6），若脂质体成功固定于表面，图像中应立即出现受衍射极限限制的强度亮点，此现象可作为直观判断依据（图1B 和 图1C）。

为了获得良好的统计结果并充分利用该检测方法的高通量特性，应成像数千个脂质体。为了在合理数量的图像中完成此操作，建议固定足够数量的脂质体，使每帧图像中脂质体密度达到300−400个，这样可将每个样品所需的图像数量减少至约10张，从而降低需要采集和分析的图像总数。密度过低会使数据分析更加耗时，而密度过高则可能导致图像分析软件难以区分单个脂质体。为直观了解300−400个脂质体的分布情况，...

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讨论

需要注意的是，尽管我们详细描述了如何利用单个脂质体检测方法研究单个脂质体之间的组成非均一性，但该平台具有很高的通用性。正如引言中先前展示和讨论的那样，该实验方案可轻松调整，用于研究膜-膜融合、蛋白质-膜相互作用或脂质体药物载体表征等方面。针对任何科学问题，单个脂质体检测方法的优势在于能够检测整体中各个组分，从而获得定量读数，避免受到整体平均效应的干扰。

单个脂质体检测法最适合用于表面成像模式，例如全内反射或共聚焦显微镜，其中Z方向的光学切片可消除脂质体层上方溶液中不必要的背景荧光。然而，这一特性在研究中尤为重要，即当荧光标记的化合物（如肽、蛋白质或其他脂质体）被加入溶液并在成像过程中持续存在于其中时。例如，如果该检测以本文详细描述的格式进行，其中荧光染料仅局限于固定的脂质体，则原则上可以使用更为常见的宽场显微镜进行检测，前提是检测系统具有足够的灵敏度。

原则上，制备检测所用脂质体的方法并无限制。本文详细描述了冻干技术的应用。然而，此前也曾采用基于氯仿的脂质再水化法或基于乙醇注射的技术来制备检测所用的脂质体

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由丹麦独立研究理事会资助［资助编号 5054-00165B］。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
8孔显微镜载玻片（µ slides）Ibidi80827带玻璃底的显微镜载玻片
Avanti Mini 挤出试剂盒Avanti Polar Lipids610000耗材（Whatman滤膜）可从GE Healthcare购买
牛血清白蛋白（BSA）SigmaA9418
生物素标记的牛血清白蛋白（BSA-Biotin）SigmaA8549
胆固醇（Cholesterol）Avanti Polar Lipids700000通过Sigma销售
配备FIJI（Fiji Is Just ImageJ）软件的计算机必须安装ComDet插件。此外，还需要能够加载.txt文件的数据处理软件（如Excel、MatLab、OpenOffice、GraphPad Prism等）用于绘图
DOPE-Atto488Atto-TechAD488-165
DOPE-Atto655Atto-TechAD655-165
DOPE-PEG-BiotinAvanti Polar Lipids880129通过Sigma销售
D-山梨醇（D-Sorbitol）SigmaS-6021
冷冻干燥机例如Labogene的ScanVac Coolsafe
玻璃小瓶Brown Chromatography150903可耐受液氮速冻的玻璃小瓶。8 mL规格的小瓶尺寸也适合挤出试剂盒的注射器
盐酸（HCl）Honeywell Fluka258148
加热浴能够加热至至少65 °C
带磁力搅拌功能的加热板能够加热至至少65 °C
HEPESSigmaH3375
液氮包括储存容器，例如橡胶浴
磁力搅拌子VWR442-4520 (EU)
1.5 mL 微量离心管Eppendorf0030 120.086 (EU)
显微镜本实验方案中的图像使用了Leica SP5共聚焦显微镜
Na HEPESSigmaH7006
氯化钠（NaCl）SigmaS9888
氢氧化钠（NaOH）Honeywell Fluka71686
POPCAvanti Polar Lipids850457通过Sigma销售
链霉亲和素（Streptavidin）SigmaS4762
叔丁醇（tert-Butanol，2-甲基-2-丙醇）Honeywell Riedel-de Haën24127
超纯水例如MilliQ

参考文献

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