本方案描述了脂质体的制备方法，以及如何将这些脂质体固定在表面，并通过荧光显微镜以大规模并行方式对单个脂质体进行成像。该方法可实现对群体中单个脂质体的尺寸和组成非均一性的定量分析。
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本文内容
摘要
摘要
大多数利用脂质体作为膜模型系统或药物递送载体的研究依赖于整体检测技术，因此本质上假设所有脂质体集合中的个体均是相同的。然而，新兴的实验平台能够实现对单个脂质体粒子的观测，从而可在单个脂质体上开展高度复杂且定量的蛋白质-膜相互作用或药物载体特性研究，避免了集合平均带来的误差。本文介绍了一种基于荧光显微镜检测技术的单个脂质体制备、检测与分析的实验方案，以支持此类单粒子测量。该系统可并行大规模成像单个脂质体，并用于揭示样品内部的尺寸和组成异质性。此外，本方案还阐述了在单个脂质体水平上研究脂质体的优势、该检测方法的局限性，以及在修改该方案以适用于其他研究问题时需要考虑的重要因素。
引言
脂质体是基于磷脂的球形囊泡，在基础研究和应用研究中均被广泛使用。由于其理化性质可通过改变构成脂质体的脂质组分而轻松调控，因此可作为优良的膜模型系统1,2。此外，脂质体也是应用最广泛的药物递送纳米载体系统，具有改善的药代动力学和药效学特性以及高度的生物相容性3。
多年来，脂质体主要通过整体性技术进行研究，仅能获得系综平均的读出值。这导致大多数研究假设系综中所有脂质体都是相同的。然而，这类系综平均值仅在数据集围绕均值均匀分布时才是准确的；如果数据集包含多个独立的子群，则可能得出错误且有偏倚的结论。此外，假设系综均值能够代表整个群体，可能会忽略脂质体之间非均一性所蕴含的重要信息。直到最近，才出现能够探测单个脂质体的定量分析方法，揭示了单个脂质体在诸如粒径4、脂质组成5,6以及包封效率7等关键理化性质方面存在显著的非均一性，凸显了在单脂质体水平上开展研究的重要性。
在研究脂质体尺寸依赖性的蛋白质-膜相互作用时，群体平均的脂质体特性已被证明会导致结果偏差
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方案
1. 脂质体的制备
注意：简而言之，脂质体的制备通常包括三个关键步骤：1）制备具有目标脂质组成的干燥脂质膜；2）水化脂质以形成脂质体；3）控制脂质体群体的粒径和层状结构。
- 称取脂质，并将其溶解于玻璃小瓶中的叔丁醇:水（9:1）混合液中。
- 将POPC（1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷脂酰胆碱；分子量 = 760 g/mol）溶解至50 mM。
- 将胆固醇（分子量 = 387 g/mol）溶解至25 mM。
- 将DOPE-Atto488（1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-Atto488；分子量 = 1,316 g/mol）溶解至0.1 mM。
- 将DOPE-Atto655（1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-Atto655；分子量 = 1,368 g/mol）溶解至0.1 mM。
- 将DSPE-PEG2000-生物素（1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[生物素基(聚乙二醇)-2000]；分子量 = 3,017 g/mol）溶解至0.1 mM。
注意：将脂质加热至55 °C，并使用磁力搅拌以确保脂质完全溶解。也可使用超声水浴。未使用的脂质储备液可在-20 °C下保存数月。
- 按POPC:胆固醇:DOPE-Atto488:DOPE-Atto655:DSPE....
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结果
按照所述方案操作，可实现对单个脂质体的大规模并行成像（图1）。当将脂质体溶液加入样品腔室时（方案中的步骤3.6），若脂质体成功固定于表面，图像中应立即出现受衍射极限限制的强度亮点，此现象可作为直观判断依据（图1B 和 图1C）。
为了获得良好的统计结果并充分利用该检测方法的高通量特性，应成像数千个脂质体。为了在合理数量的图像中完成此操作，建议固定足够数量的脂质体，使每帧图像中脂质体密度达到300−400个，这样可将每个样品所需的图像数量减少至约10张，从而降低需要采集和分析的图像总数。密度过低会使数据分析更加耗时，而密度过高则可能导致图像分析软件难以区分单个脂质体。为直观了解300−400个脂质体的分布情况，.......
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讨论
需要注意的是，尽管我们详细描述了如何利用单个脂质体检测方法研究单个脂质体之间的组成非均一性，但该平台具有很高的通用性。正如引言中先前展示和讨论的那样，该实验方案可轻松调整，用于研究膜-膜融合、蛋白质-膜相互作用或脂质体药物载体表征等方面。针对任何科学问题，单个脂质体检测方法的优势在于能够检测整体中各个组分，从而获得定量读数，避免受到整体平均效应的干扰。
单个脂质体检测法最适合用于表面成像模式，例如全内反射或共聚焦显微镜，其中Z方向的光学切片可消除脂质体层上方溶液中不必要的背景荧光。然而，这一特性在研究中尤为重要，即当荧光标记的化合物（如肽、蛋白质或其他脂质体）被加入溶液并在成像过程中持续存在于其中时。例如，如果该检测以本文详细描述的格式进行，其中荧光染料仅局限于固定的脂质体，则原则上可以使用更为常见的宽场显微镜进行检测，前提是检测系统具有足够的灵敏度。
原则上，制备检测所用脂质体的方法并无限制。本文详细描述了冻干技术的应用。然而，此前也曾采用基于氯仿的脂质再水化法或基于乙醇注射的技术来制备检测所用的脂质体
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由丹麦独立研究理事会资助［资助编号 5054-00165B］。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 8孔显微镜载玻片（µ slides） | Ibidi | 80827 | 带玻璃底的显微镜载玻片 |
| Avanti Mini 挤出试剂盒 | Avanti Polar Lipids | 610000 | 耗材（Whatman滤膜）可从GE Healthcare购买 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A9418 | |
| 生物素标记的牛血清白蛋白（BSA-Biotin） | Sigma | A8549 | |
| 胆固醇（Cholesterol） | Avanti Polar Lipids | 700000 | 通过Sigma销售 |
| 配备FIJI（Fiji Is Just ImageJ）软件的计算机 | 必须安装ComDet插件。此外，还需要能够加载.txt文件的数据处理软件（如Excel、MatLab、OpenOffice、GraphPad Prism等）用于绘图 | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | 通过Sigma销售 |
| D-山梨醇（D-Sorbitol） | Sigma | S-6021 | |
| 冷冻干燥机 | 例如Labogene的ScanVac Coolsafe | ||
| 玻璃小瓶 | Brown Chromatography | 150903 | 可耐受液氮速冻的玻璃小瓶。8 mL规格的小瓶尺寸也适合挤出试剂盒的注射器 |
| 盐酸（HCl） | Honeywell Fluka | 258148 | |
| 加热浴 | 能够加热至至少65 °C | ||
| 带磁力搅拌功能的加热板 | 能够加热至至少65 °C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| 液氮 | 包括储存容器，例如橡胶浴 | ||
| 磁力搅拌子 | VWR | 442-4520 (EU) | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| 显微镜 | 本实验方案中的图像使用了Leica SP5共聚焦显微镜 | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma | S9888 | |
| 氢氧化钠（NaOH） | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | 通过Sigma销售 |
| 链霉亲和素（Streptavidin） | Sigma | S4762 | |
| 叔丁醇（tert-Butanol，2-甲基-2-丙醇） | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| 超纯水 | 例如MilliQ |
参考文献
- Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Veatch, S. L., Keller, S. L. Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes. Biochimica Et Biop....
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重印与许可
