本文介绍了三种评估中性粒细胞在体内和体外迁移与浸润的方法。这些方法可用于发现靶向中性粒细胞迁移的潜在治疗药物。
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本文内容
摘要
摘要
中性粒细胞是先天免疫系统的主要成员，在宿主防御病原体以及病理性炎症反应中发挥关键作用。细胞因子和趋化因子可引导中性粒细胞募集至炎症部位。中性粒细胞过度浸润可导致非特异性组织损伤，例如类风湿关节炎（RA）中的情况。从腹腔渗出液中分离的中性粒细胞可在体外通过Transwell或Zigmond小室实验中对确定的趋化因子N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP）产生响应。气囊实验可用于评估中性粒细胞在体内向脂多糖（LPS）趋化的现象。佐剂诱导性关节炎（AA）小鼠模型常用于类风湿关节炎研究，利用抗髓过氧化物酶（MPO）或抗中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）抗体对关节组织切片进行免疫组织化学染色，是检测中性粒细胞浸润的成熟方法。这些技术可用于发现靶向中性粒细胞迁移的潜在治疗策略。
引言
中性粒细胞是最丰富的白细胞，在人类全部白细胞群体中占50−70%1。在急性炎症过程中，中性粒细胞是主要的早期应答细胞之一。组织驻留细胞释放的细胞因子和趋化因子可引导中性粒细胞迁移至炎症部位2,3,4，该过程由中性粒细胞与血管内皮细胞表面的细胞黏附分子相互作用介导5。中性粒细胞在宿主防御中具有基础性作用，同时因其可通过释放活性氧（ROS）及其他损伤组织的分子而造成组织损伤，也参与了病理性炎症反应3,6。
既往研究已描述了多种从小鼠或人类中分离中性粒细胞的方案。Oh 等人展示了利用密度梯度离心法从全人血中分离人中性粒细胞的方法7。然而，由于小鼠血液体积较小，从小鼠血液中分离出足够数量的中性粒细胞较为困难。另一种方法是从小鼠腹腔液中诱导获取大量纯度高且具有活性的小鼠中性粒细胞，这些经纯化的中性粒细胞可用于体外实验，以检测多种细胞功能，包括中性粒细胞浸润、迁移、趋化性、氧化爆发、细胞因子以及中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的产生
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方案
所有实验程序均经北京中医药大学动物护理与使用委员会审查并批准。
注意：使用 C57BL/6 小鼠（7-8 周龄）。
1. 中性粒细胞分离
- 腹腔渗出细胞的获取
- 用去离子水（ddH2O）新鲜配制10%蛋白胨溶液。根据小鼠数量计算所需体积。
注意：设小鼠数量为N，需预先溶解并过滤(2N+1) mL溶液。 - 用70%乙醇喷洒操作区域。使用胰岛素注射器吸取1 mL蛋白胨溶液，并排出气泡。
- 对每只小鼠进行第一次腹腔注射，注射量为1 mL蛋白胨溶液。
- 用一只手将小鼠抓握成头朝下的姿势，用蘸有酒精的棉球对注射部位进行消毒。
注意：推荐的注射部位位于腹部左下或右下象限的侧面。 - 快速注入试剂。使用胰岛素注射器将1 mL溶液注入每只小鼠的腹腔内。
注意：针头与皮肤之间的角度应约为15−30°，以避免损伤肠道或其他器官。
- 用一只手将小鼠抓握成头朝下的姿势，用蘸有酒精的棉球对注射部位进行消毒。
- 让炎症反应过夜发展。12小时后，以与第一次注射相同的方式进行第二次注射。
- 第二次注射后3小时，将小鼠置于流速为2 L/min的气体麻醉室中，用5%异氟烷麻醉5分钟，直至完全麻醉。将麻醉后的小鼠从麻醉室中取出，并通过颈椎脱位法处死。
- 用去离子水（ddH2O）新鲜配制10%蛋白胨溶液。根据小鼠数量计算所需体积。
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结果
从小鼠腹腔灌洗液中收集腹腔渗出细胞。将细胞重悬于1 mL RPMI-1640完全培养基中，铺在两步不连续密度梯度（54.8%/70.2%）上（图1A），在1,500 × g 条件下离心30分钟。中性粒细胞（纯度≥95%，每只小鼠约1 × 107个中性粒细胞）从下层界面回收（图1B）。
通过气囊实验研究体内脂多糖（LPS）刺激中性粒细胞募集的情况（图2A）。检测了气囊渗出液中白细胞亚群的组成（图2B）。
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讨论
长期以来，已有从外周血7、骨髓和组织18中分离高纯度中性粒细胞的详细方案。本文采用从腹腔液19中分离中性粒细胞的方法，所获成熟中性粒细胞仍处于非活化状态，可用于后续抗炎和抗氧化研究。
我们采用气囊实验来探究脂多糖（LPS）诱导的中性粒细胞在体内的浸润情况。该方法被认为是一种在体内直接测量一般炎症环境中细胞浸润的潜在方法。
值得注意的是，气囊模型仅以非器官特异性的方式展示中性粒细胞的功能，并省略了白细胞募集级联反应中的多个步骤。由于中性粒细胞向特定器官的募集可能依赖于不同的器官特性、黏附分子和趋化因子，因此在器官特异性条件下探究中性粒细胞的功能状态，对于研究中性粒细胞在某些疾病中可能发挥的作用具有重要意义3。已有研究建议需要采用终点模型来研究中性粒细胞的浸润情况。因此，对佐剂性关节炎（AA）模型小鼠关节组织切片进行免疫组织化学染色，可为深入.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（资助号：81430099 和 31500704）、国际科技合作与交流项目（资助号：2014DFA32950）以及北京中医药大学科研项目（资助号：BUCM-2019-JCRC006 和 2019-JYB-TD013）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.1% 快绿溶液 | Solarbio | 8348b | 将一瓶中的 20 mg 快绿 FCF 转移至另一 100 mL 烧杯中。加入 20 mL H2O，搅拌溶解染料以制备 0.1% 快绿溶液，并使用 Nalgene PES 75 mm 滤器过滤 |
| 0.1% 沙黄 O 染色液 | Solarbio | 8348a | 将一瓶中的 20 mg 沙黄 O 染料转移至 100 mL 烧杯中。加入 20 mL H2O，搅拌溶解染料以制备 0.1% 沙黄 O 染色液，并使用 Nalgene PES 75 mm 滤器过滤 |
| 0.5 M 乙二胺四乙酸溶液（EDTA），pH 8.0 | Sigma | 324506 | 无菌 |
| 100% 乙醇 | 北京化学试剂厂 | ||
| 100% 甲醇 | 北京化学试剂厂 | ||
| 15 mL 圆锥形聚丙烯离心管 | Falcon | 14-959-53A | |
| 23 G × 1 1/4" 针头 | BD | 305120 | |
| 26 G × 3/8" 针头 | BD | 305110 | |
| 3% 牛血清白蛋白（BSA） | 将 0.3 g BSA 溶解于 10 mL PBS 中 | ||
| 3% H2O2 | 将 1 mL 30% H2O2 与 9 mL 甲醇混合 | ||
| 3,3'-二氨基联苯胺（DAB）试剂盒 | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 30 G × 1/2" 针头 | BD | 305106 | |
| 30% H2O2 | 北京化学试剂厂 | ||
| 5 mL 注射器 | BD | Z683574 | |
| 50 mL 圆锥形聚丙烯离心管 | Falcon | 14-432-22 | |
| 50% 乙醇 | 将 500 mL 100% 乙醇与 500 mL dH2O 混合 | ||
| 54.8% Percoll | 将 2.74 mL 等渗 Percoll（SIP）与 2.26 mL 1×PBS 混合，静置 | ||
| 70% 乙醇 | 将 700 mL 100% 乙醇与 300 mL dH2O 混合 | ||
| 70.2% Percoll | 将 3.51 mL SIP 与 1.49 mL 1×PBS 混合，静置 | ||
| 80% 乙醇 | 将 800 mL 100% 乙醇与 200 mL dH2O 混合 | ||
| 95% 乙醇 | 将 950 mL 100% 乙醇与 50 mL dH2O 混合 | ||
| 酸性乙醇超快分化液 | Beyotime | C0165S | |
| 抗体 | |||
| 抗髓过氧化物酶抗体 | Abcam | ab208670 | |
| 抗中性粒细胞弹性蛋白酶抗体 | Abcam | ab21595 | |
| 全自动血液分析仪 | Sysmex | XS-800i | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | VWR | 0332-100G | |
| 完全弗氏佐剂，10 mg/mL | Sigma | 1002036152 | |
| 盖玻片 | CITOGLAS | 10212432C | |
| 表盘式厚度规 | Mitutoyo | 7301 | |
| Eppendorf 微量离心管，1.5 mL | Sigma | Z606340 | |
| 优质胎牛血清（FBS） | PAN | P30-1302 | |
| 气体麻醉系统 | ZS Dichuang | ZS-MV-IV | |
| 羊抗兔 IgG H&L（HRP） | PPLYGEN | C1309 | 该试剂为免疫组织化学染色中使用的二抗。 |
| Hank's 平衡盐溶液（HBSS） | 以色列 Beth HaEmek 生物工业公司 | 02-016-1A | 无菌 |
| 苏木精染色液 | ZSGB-BIO | ZLI-9609 | |
| 脂多糖（LPS） | Sigma | L3012 | |
| 培养基与添加剂 | |||
| 改良沙黄 O-快绿 FCF 软骨染色试剂盒 | Solarbio | G1371 | |
| N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP） | Sigma | 47729 | |
| 青霉素-链霉素溶液，100× | Invitrogen | 1514022 | |
| Percoll | GE Healthcare | 10245207 | 密度梯度介质 |
| 通透缓冲液 | 将 100 μL Triton X-100 与 1 L dH2O 混合，得到 0.01% Triton X-100 | ||
| 磷酸盐缓冲液（PBS），1× | 将 90% ddH2O 与 10%（v/v）10×PBS 混合，高压灭菌 | ||
| 磷酸盐缓冲液（PBS），10× | 将 16 g NaCl、0.4 g KCl、2.88 g Na2HPO4·2H2O、0.48 g KH2PO4（无水）溶于 200 mL ddH2O 中，调节 pH 至 7.4，高压灭菌 | ||
| 塑料器皿与设备 | |||
| 粉末 | |||
| 蛋白胨 | Oxoid | 1865317 | |
| 抗原修复缓冲液 | 将 18 mL 抗原修复缓冲液 A 与 82 mL 抗原修复缓冲液 B 混合，加 dH2O 至 1000 mL，调节 pH 至 6.0 | ||
| IHC 用抗原修复缓冲液 A 储存液 | 将 4.2 g 柠檬酸（C6H5O7·H2O）溶于 200 mL dH2O 中 | ||
| IHC 用抗原修复缓冲液 B 储存液 | 将 5.88 g 二水合柠檬酸三钠（C6H5Na3O7·2H20）溶于 200 mL dH2O 中 | ||
| 罗斯韦尔帕克纪念研究所（RPMI）-1640 培养基 | Sigma | R8758 | |
| RPMI-1640 完全培养基 | RPMI-1640 培养基中添加 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素 | ||
| 舒瑞 U40 一次性无菌胰岛素注射针头 1 mL | BD | 328421 | |
| 载玻片 | CITOGLAS | 10127105P-G | |
| 溶液 | |||
| 等渗 Percoll 储存液（SIP） | 将 90%（v/v）Percoll 与 10%（v/v）10×PBS 混合，静置 20 分钟 | ||
| 气囊实验洗涤缓冲液 | 将 0.5 M EDTA 用 HBSS 稀释至 10 mM | ||
| 二甲苯 | 北京化学试剂厂 |
参考文献
- Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. A....
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