用于体外人中性粒细胞趋化性及分子分析的生物微粒微阵列

摘要

该方案可生成生物微粒微阵列，实现对中性粒细胞群集迁移的时空控制。该方法便于获取中性粒细胞在迁移过程中释放的介质，并可用于定量成像分析。

摘要

中性粒细胞群集是一种协同过程，通过该过程，中性粒细胞封闭感染部位并促进组织重排。传统上，中性粒细胞群集在动物模型体内研究中被观察到，表现出特征性的细胞迁移模式。然而，体内模型存在若干局限性，包括难以获取和分析的细胞间介质，以及无法直接分析人源中性粒细胞。由于这些限制，亟需一种体外平台，用于研究人源中性粒细胞的群集行为，并便于获取群集过程中产生的分子信号。本文采用多步微压印技术，构建了一种生物微粒微阵列，通过模拟体内感染来诱导群集反应。该生物微粒微阵列可诱导中性粒细胞以可控且稳定的方式发生群集。在微阵列上，中性粒细胞运动速度增加，并在生物微粒簇周围形成稳定的群集结构。此外，对中性粒细胞产生的上清液进行分析，发现有16种蛋白质在群集过程中差异表达。该体外群集平台可实现对中性粒细胞迁移行为和蛋白质释放的直接、可重复且空间可控的分析。

引言

中性粒细胞是血液中最丰富的白细胞¹，由于其可能参与多种疾病过程，包括痛风⁴、脓毒症³、创伤^5,6、癌症^1,7,8以及各种自身免疫性疾病^5,9，正日益成为潜在的诊断和治疗靶点^2,3。中性粒细胞群集是一种多阶段、高度调控的复杂过程，这种复杂性使其成为特别值得关注的研究对象^5,10,11。在群集过程中，中性粒细胞将炎症部位与周围健康组织隔离^5,10,11。对中性粒细胞群集的恰当调控对于促进伤口愈合及最终实现炎症消退至关重要^5,12。中性粒细胞群集主要通过啮齿类动物^12,13,14,15和斑马鱼^10,11,12,15的体内模型进行研究。然而，这些体内动物模型本身存在局限性⁵。例如，中性粒细胞在群集过程中释放的介质难以被有效获取以进行分析⁵。此外，在体内某一特定介质可能存在多种来源，因此必须通过引入基因缺陷来抑制细胞的产生和/或相互作用，才能探究该介质在特定过程中的作用¹³。体外实验可通过排除其他细胞的干扰，直接观察中性粒细胞行为，从而规避上述复杂性。此外，目前关于人类中性粒细胞协调迁移的研究仍较为有限¹⁶。借助体外群集平台，可对人类中性粒细胞进行直接分析。体外群集平台有望弥补体内研究的不足，拓展从体内研究中获得的知识。

为了满足对模拟体内中性粒细胞群聚行为的体外平台的需求，我们开发了一种微印迹技术平台，能够以空间可控的方式构建可诱导中性粒细胞群聚的生物微粒微阵列。我们在玻片上通过两步法生成生物微粒微阵列。首先，利用微印迹技术在玻片上形成阳离子聚电解质（CP）微点阵列；其次，加入生物微粒溶液，使其通过静电相互作用吸附到CP微点上。通过预先构建CP图样，我们可选择性地将带负电荷的生物微粒定位排列，从而形成所需的中性粒细胞群聚模式。带正电荷的CP层能够在剧烈洗涤步骤中牢固地保留带负电荷的生物微粒，从而将未结合于CP区域的生物微粒从玻片表面彻底清除。此外，本研究中使用的CP是一种丙烯酰胺与季铵化阳离子单体的共聚物，具有良好的生物相容性，不会诱导中性粒细胞产生非特异性反应。该材料表面电荷密度极高，可将微米级生物微粒牢固固定于玻片表面，防止中性粒细胞将微粒从预设位置移除，最终形成有序排列的生物微粒簇。当我们将中性粒细胞加入该微阵列后，细胞在生物微粒簇周围形成了稳定的群聚结构。通过追踪中性粒细胞的迁移行为，我们发现群聚中的中性粒细胞会主动向生物微粒簇迁移。此外，我们利用该平台分析了中性粒细胞在群聚过程中释放的多种介质分子，共鉴定出16种在群聚过程中差异表达的介质分子。这些介质分子的浓度随时间变化呈现三种普遍趋势：持续升高、逐渐降低或短暂升高后回落。我们建立的体外中性粒细胞群聚平台不仅有助于研究空间可控的人源中性粒细胞群聚行为，还可实现对群聚过程中释放介质分子的收集与分析。在先前的一项研究中，我们已证明患有特定疾病（如创伤、自身免疫性疾病和脓毒症）的患者，其中性粒细胞功能与健康供体存在显著差异⁵。在未来的研究中，该平台可用于分析不同患者群体中中性粒细胞的功能特征。该平台能够对中性粒细胞群聚过程中复杂的协调行为进行定量分析，进一步研究可为特定患者群体的中性粒细胞功能或其对特定病原体的响应机制提供深入见解。

方案

作者感谢那些慷慨捐献血液的健康志愿者。血液样本的采集均在获得志愿者知情同意后进行，符合经俄亥俄州立大学生物医学科学委员会审查的机构审查委员会（IRB）方案 #2018H0268 的规定。

1. 生物微粒微阵列的微加工

1. 采用标准的光刻工艺，制备母版硅晶圆。
   1. 使用计算机辅助设计（CAD）软件生成所需设计的样稿，然后发送给光掩模制造商以制作铬光掩模。此处使用的设计为4 mm × 4 mm的矩形阵列，包含直径30 µm的实心圆，圆心间距为150 µm。该设计可根据不同应用需求进行修改。
   2. 在硅晶圆上旋涂一层40 µm厚的负性光刻胶。在65 °C下烘烤5分钟，然后在95 °C下烘烤10分钟。
   3. 通过铬光掩模以150–160 mJ/cm²的紫外线剂量照射晶圆（图1A）。
   4. 在65 °C下烘烤5分钟，95 °C下烘烤10分钟。将晶圆浸入光刻胶显影液中10分钟，并用异丙醇冲洗。此时，晶圆上应可见图案（图1B）。
2. 将聚二甲基硅氧烷预聚物与其固化剂按10:1的比例充分混合（例如，20 g预聚物与2 g固化剂），然后将未固化的聚二甲基硅氧烷（PDMS）混合物倒入培养皿中，覆盖在母版晶圆上（图1C）。
3. 对未固化的PDMS混合物进行真空处理，直至母版晶圆表面无气泡。在65 °C下固化过夜。
4. 使用手术刀沿晶圆上图案区域的外围切割，并缓慢剥离固化的PDMS块。将PDMS块放置在干净的砧板上，使图案面朝上（图1D）。
5. 使用8 mm活检打孔器从PDMS块上切下独立的印章。每张载玻片需要八个印章（图1E）。
6. 将每个印章的图案面朝下贴附在粘性胶带上，以去除任何碎屑。
7. 提前配制1.6 mg/mL的CP水溶液。
   1. 将适量CP粉末加入水中（例如，0.8 g加入500 mL水中）。
   2. 在室温下使用搅拌器搅拌过夜，或直至所有固体完全溶解。CP溶液可在室温下保存6个月。
   3. 如需，可通过添加荧光素异硫氰酸酯标记的聚-L-赖氨酸（PLL-FITC）使CP溶液具有荧光。
      1. 分装约10 mL CP溶液。向分装的溶液中加入少量PLL-FITC（0.05 mg）。可根据需要调整添加量，以调节荧光亮度。
      2. 将FITC标记的CP溶液涡旋振荡20秒，或直至溶液呈均匀的淡黄色。避光保存，在4 °C下最多可保存1个月。
8. 将印章图案面朝上放置，向每个印章上加入100 µL的1.6 mg/mL CP溶液，确保CP溶液与印章之间无气泡产生（图1F）。
9. 将印章翻转并浸入一层CP溶液中（图1G）。
10. 1小时后将印章从CP溶液中取出。
11. 将每个湿润的印章图案面朝下轻压在干净的载玻片上6–8次，以去除多余液体。
12. 对印章进行1–2分钟的真空处理。
13. 在干净的载玻片上粘附一个八孔、直径9 mm的成像间隔垫，作为印章定位的引导。使用此间隔垫，每张载玻片可容纳八个微阵列。
14. 将每个印章图案面朝下放置在成像间隔垫每个孔的中心位置（即总共使用八个印章）。
15. 在每个印章上方放置一个5.6 ± 0.1 g的平衡重物，保持10分钟以完成压印（图1H）。使用平衡重物可确保印章均匀地压在载玻片上，促进CP均匀转移至载玻片表面。
16. 从载玻片上移除重物和印章（图1I）。在添加生物颗粒前，让CP层在室温下干燥24小时，具体操作见步骤1.17。若CP标记了FITC，可在进行步骤1.17前使用荧光显微镜在488 nm波长下检查压印效果（图1M）。
17. 将一块空白PDMS块裁剪至成像间隔垫的尺寸，并使用8 mm活检打孔器在PDMS上打孔，使其孔位与成像间隔垫的孔位对齐。将PDMS块粘附在带有成像间隔垫的载玻片上（图1J）。
18. 解冻生物颗粒溶液（例如，E. coli 或酵母聚糖），并用水针剂（WFI）稀释至500 μg/mL。
    注：生物颗粒无需进行调理化处理。中性粒细胞表面受体可直接识别这些生物颗粒上的分子^19,20,21。
19. 向载玻片上每个PDMS孔中加入100 μL生物颗粒溶液（图1K）。
20. 将载玻片轻轻摇动30分钟。
21. 用清水彻底冲洗各孔。生物颗粒微阵列可在无尘环境中于4 °C保存最多3个月。此时，应在进行步骤2.1前使用荧光显微镜在594 nm波长下检查图案（图1N）。

2. 样品制备

1. 从所需供体采集至少 2 mL 新鲜血液至 K2-EDTA 管中。中性粒细胞的预期产量为每 1 mL 全血 1–2 × 10⁶ 个细胞。成像实验需要约 1.5 × 10⁵ 个中性粒细胞，上清液分析需要 1 × 10⁶ 个中性粒细胞。血液应在采集后 4 小时内使用。
2. 按 1:5 的比例向全血中加入红细胞聚集剂，以分离红细胞（RBCs）。静置 45 分钟，直至出现透明层（白膜层）与红细胞层分离。
3. 移取白膜层，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，按 1 mL 白膜层加 9 mL PBS 的比例进行。
4. 在 190 × g、20 °C 条件下离心 5 分钟。
5. 吸除上清液，将沉淀重悬于 5 × 10⁷ 个细胞/mL。
6. 使用阴性免疫磁珠分选试剂盒分离中性粒细胞。
   1. 每 1 mL 细胞悬液中加入 50 μL 抗体混合液。静置 10 分钟。
   2. 每 1 mL 细胞悬液中加入 100 μL 磁珠。静置 10 分钟。
   3. 将细胞悬液加入圆底管中，置于圆柱形磁铁上。静置 10 分钟。
7. 将上清液倒入离心管中，加入最多 10 mL PBS。在 190 × g、20 °C 条件下离心 5 分钟。
8. 吸除上清液。将白色沉淀重悬于含 0.4% 人血清白蛋白的 IMDM 培养基中。
9. 用 20 µg/mL Hoechst 33342 在 37 °C 染色细胞核 10 分钟。
10. 加入 5 mL 含 0.4% 人血清白蛋白的 IMDM 培养基冲洗。在 190 × g、20 °C 条件下离心 5 分钟。
11. 将细胞重悬于含 0.4% 人血清白蛋白的 IMDM 培养基中，浓度为 7.5 × 10⁵ 个细胞/mL。
12. 将 100 µL 细胞悬液加入含有生物颗粒微阵列的 PDMS 微孔中。确保细胞悬液在 PDMS 微孔表面呈凸面，且不含任何气泡。
13. 用直径 12 mm 的盖玻片密封。将直径 12 mm 的盖玻片覆盖在 PDMS 微孔开口上，用镊子轻轻按压盖玻片，使多余的细胞悬液挤至微孔边缘。用纸巾吸除多余细胞悬液。

3. 运行检测与图像分析

1. 将载有细胞的微颗粒阵列置于配备腔室培养箱的活细胞成像系统上，腔室培养箱设置为 37 °C、5% CO₂ 和 90% 相对湿度。
2. 使用延时荧光与明场显微镜，在 405 nm、594 nm 和明场条件下，以 10 倍放大倍数每 10 秒采集一次图像。在典型实验中，图像采集持续长达 2 小时。
3. 使用自动细胞追踪软件，追踪单个中性粒细胞向生物颗粒簇的迁移过程。
   1. 采用斑点检测细胞追踪软件的自回归模式。将斑点半径设为 5 µm（约为中性粒细胞核的大小），最小轨迹长度设为 120 秒，最大间隙帧数设为 1 帧。
   2. 从细胞追踪软件生成的数据中，提取包含中性粒细胞位置和速度的文件。这些文件可与绘图软件结合使用，分别生成中性粒细胞迁移轨迹图（图 2C）和速度-时间热图（图 2D）。
4. 使用 405 nm 荧光图像，在任意选定的图像分析软件中追踪群体规模随时间的变化。
   1. 在每个中性粒细胞将发生聚集的生物颗粒簇周围定义感兴趣区域（ROI）。保持每个生物颗粒簇分析时 ROI 大小一致。
   2. 分析各 ROI 内 405 nm 图像的平均荧光强度随时间的变化。
   3. 通过在不同群体规模（从 0 µm² 至最大群体规模）进行人工测量，建立平均荧光强度与群体规模之间的校准曲线。利用该校准曲线计算随时间变化的群体规模。

4. 上清液收集与蛋白质检测

1. 将中性粒细胞在含有生物颗粒微阵列的孔中于 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 3 小时。在预定时间点取样。通常在 0、0.5、1 和 3 小时时取样。为克服蛋白微阵列检测方法的检测限，每个时间点使用单个孔的全部上清液体积（200 µL）。每个时间点设三个重复。
2. 使用明场显微镜确认微阵列上已形成中性粒细胞簇集。
3. 用 200 µL 移液器吸取上清液，并转移至 0.45 μm 离心过滤管中。
4. 在 190 x g 和 20 °C 条件下离心上清液 5 分钟，收集滤过液体积。
5. 将样品储存于 -80 °C，直至进行后续处理。
6. 使用可检测多种人源蛋白的微阵列试剂盒处理样品。
   1. 将每份样品各 200 μL 加入试剂盒提供的独立透析管中。
   2. 将透析管放入盛有至少 500 mL PBS（pH = 8.0）的烧杯中，在 4 °C 下于摇床上轻柔搅拌至少 3 小时。更换烧杯中的 PBS，重复此步骤一次。
   3. 将每份样品转移至洁净离心管中，在 9,000 x g 条件下离心 5 分钟以去除沉淀物，将上清液转移至新的洁净管中。
   4. 向每 180 µL 透析后的样品中加入试剂盒提供的 1x 标记试剂 36 µL（按每 1 mg 总蛋白计），进行生物素标记。在 20 °C 下孵育 30 分钟，每 5 分钟轻柔混匀一次。
   5. 向每管样品中加入试剂盒提供的终止液 3 µL。将每份样品转移至新的透析管中，重复步骤 4.6.2–4.6.3。此阶段样品可在 -20 °C 或 -80 °C 储存，直至准备继续实验。
   6. 试剂盒提供的玻璃载片储存于 -20 °C。取出后使其恢复至室温，并将组装好的玻璃载片置于超净台中于室温平衡 1–2 小时。
   7. 向组装好的玻璃载片的每个孔中加入试剂盒提供的封闭缓冲液 400 μL，在室温下孵育 30 分钟。
   8. 将制备好的样品在 9,000 x g 条件下离心 5 分钟，以去除沉淀或颗粒物，然后用封闭缓冲液稀释 5 倍。
   9. 吸除各孔中的封闭缓冲液，向相应孔中加入 400 μL 稀释后的样品，在室温下振荡孵育 2 小时。
   10. 倾去各孔中的样品液，用试剂盒提供的 1x 洗涤缓冲液 I 在室温下洗涤 3 次，每次 800 μL，振荡洗涤 5 分钟。
   11. 在洁净容器中将组装好的玻璃载片完全浸入 1x 洗涤缓冲液 I 中，在室温下振荡洗涤 2 次，每次 5 分钟。
   12. 向每个子阵列中加入 400 μL 1x Cy3 标记的链霉亲和素，用塑料粘性封口膜覆盖。后续步骤需避光操作。
   13. 在室温下振荡孵育 2 小时。
   14. 倾去溶液，将玻璃载片从样品室中拆下。
   15. 在试剂盒提供的 30 mL 离心管中，小心放入玻璃载片，并加入足量 1x 洗涤缓冲液 I 以完全覆盖载片，在室温下振荡洗涤 3 次，每次 10 分钟。
   16. 在 30 mL 离心管中，用 1x 洗涤缓冲液 II 在室温下振荡洗涤 2 次，每次 5 分钟。
   17. 用 30 mL 去离子水（ddH₂O）洗涤玻璃载片 5 分钟。将载片从离心管中取出，在超净台中干燥 20 分钟。制备好的玻璃载片可在 -20 °C 储存，直至准备扫描。
   18. 使用微阵列扫描仪在荧光发射波长 555 nm 下扫描玻璃载片。

结果

当将中性粒细胞加入生物颗粒微阵列时，接触生物颗粒簇的中性粒细胞会被激活并启动群集反应。通过延时荧光显微镜追踪中性粒细胞向生物颗粒簇的迁移，验证了该生物颗粒微阵列的有效性（视频 S1）。在迁移过程中，单个中性粒细胞核的运动轨迹被持续追踪。当中性粒细胞到达生物颗粒簇时，其细胞核会与簇内其他细胞核重叠，因此无法通过该方法准确追踪簇内单个中性粒细胞的运动。酵母多糖（zymosan）和E. coli生物颗粒簇均可诱导中性粒细胞形成群集。本研究中，图2B采用的是由E. coli颗粒诱导生成的中性粒细胞群集数据；图3及图2的其他图示则采用由酵母多糖颗粒诱导生成的中性粒细胞群集数据。实验结果表明，当中性粒细胞接触生物颗粒簇时，生物颗粒簇可刺激中性粒细胞活化，最终在30–60分钟内于每个簇周围形成稳定的中性粒细胞群集（图2

讨论

我们开发了一种微图案化平台，用于生成生物颗粒的均匀阵列，以刺激体外中性粒细胞的聚集行为。该平台的体外特性使我们能够避免体内中性粒细胞聚集实验中出现的复杂情况，尤其是难以分析聚集中性粒细胞所释放的介质这一问题⁵此外，体内模型通常在啮齿类动物中进行^{11,12,13,15,22,23,} 或斑马鱼^11,12,15,23我们的平台使用...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
"“The Big Easy” EasySep 磁力架"	STEMCELL Technologies	18001	用于中性粒细胞分离试剂盒的磁力架
细胞培养箱	Okolab	777057437 / 77057343	Okolab 笼式培养箱，用于温度和 CO₂ 控制
EasySep 人中性粒细胞分离试剂盒	STEMCELL Technologies	17957	用于人中性粒细胞免疫磁珠负选的试剂盒
Eclipse Ti2	Nikon Instruments	MEA54010 / MEF55037	倒置研究级显微镜
大肠杆菌（K-12 菌株）生物颗粒 Texas Red 标记物	Invitrogen	E2863	生物颗粒粉末，使用前溶于水，再加入 Zetag® 阵列
Harris Uni-Core 8 mm 活检打孔器	Sigma Aldrich	Z708925	用于切割 PDMS 印模
HetaSep	STEMCELL Technologies	7906	红细胞聚集剂，用于从新鲜人血中分离白膜层与红细胞
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	细胞核荧光染料
人 L1000 蛋白芯片	Raybiotech Inc.	AAH-BLG-1000-4	高密度蛋白芯片，可检测 1000 种人源蛋白
人血清白蛋白（HSA）	Sigma Aldrich	A5843	低内毒素 HSA，用于在 IMDM 培养基中配制 2% 溶液，以培养分离的中性粒细胞
Iscove 改良杜尔贝科培养基（IMDM）	Thermo Fisher Scientific	12440053	用于重悬分离的中性粒细胞
K2-EDTA 采血管	Thermo Fisher Scientific	02-657-32	用于血液采集的试管
低反射铬光掩模	Front Range Photomask	N/A	尺寸为 5" × 5" × 0.09"（长 × 宽 × 厚）
微阵列扫描仪	Perkin Elmer	ASCNGX00	用于读取蛋白图案化微区的荧光信号
显微图像分析软件 - Imaris	Bitplane	9.3.0	用于自动细胞追踪分析的软件
NiS Elements 高级研究软件包	Nikon Instruments	MQS31100	用于自动活细胞成像及群体运动尺寸计算的软件
荧光素异硫氰酸酯标记的聚-L-赖氨酸（PLL-FITC）	Sigma Aldrich	P3069-10MG	分子量 30,000–70,000 的 FITC 标记 PLL，用于荧光标记 CP 溶液
SecureSeal 8 孔成像间隔片	Grace Bio-Labs	654008	8 孔，直径 9 mm，带粘性的成像间隔片
硅晶圆	University Wafer	590	硅片，100 mm，N/P (100) 晶向，0–100 欧姆·厘米，500 μm 单面抛光测试片
旋涂仪	Laurell	WS-650MZ-23NPPB	用于在硅晶圆上旋涂一层 40-µm 厚的光刻胶
SU-8 2025	MicroChem	2025	负性光刻胶，用于制备硅模板晶圆
SU-8 显影液	MicroChem	Y020100	光刻胶显影液，用于去除硅晶圆上未交联的 SU-8 2025
Sylgard 184（聚二甲基硅氧烷，PDMS）	Dow	1673921	双组分硅橡胶套件，用于制作微印模和 PDMS 微孔
紫外曝光掩模系统	Kloé	UV-KUB 2	通过铬掩模使用紫外光使硅晶圆上的光刻胶发生交联
水	Thermo Fisher Scientific	A1287303	高质量水，用于稀释生物颗粒
Zetag 8185	BASF	8185	阳离子聚电解质（CP）粉末，丙烯酰胺与季铵化阳离子单体的共聚物，溶于水后形成"“印墨溶液”"，用于微接触印刷
酿酒酵母 Zymosan A 生物颗粒 Texas Red 标记物	Invitrogen	Z2843	生物颗粒粉末，使用前溶于水，再加入 Zetag 阵列