基于明胶甲基丙烯酰胺水凝胶生物墨水的3D生物打印方案

摘要

本文介绍了一种明胶甲基丙烯酰胺的3D生物打印方法。

摘要

明胶甲基丙烯酰化物（GelMA）已成为生物打印领域中一种广受欢迎的生物材料。该材料来源于明胶，而明胶是由哺乳动物胶原蛋白水解得到的。因此，其分子链上保留了精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列以及基质金属蛋白酶（MMP）的作用靶点基序，有助于实现细胞黏附与材料降解。此外，GelMA具有多样的成形特性。其甲基丙烯酰胺基团可在光引发剂存在下，通过光照迅速发生交联反应。因此，建立适用于该前景广阔材料的三维（3D）结构制备方法具有重要意义。然而，GelMA黏度较低，限制了其可打印性。本文介绍了几种实现GelMA水凝胶3D生物打印的方法，包括GelMA微球、GelMA纤维、GelMA复杂结构以及基于GelMA的微流控芯片的制备。文中讨论了所获得结构的形貌特征、材料的生物相容性以及打印方法的特点。本方案有望成为连接传统生物材料与GelMA应用之间的桥梁，并推动基于GelMA的三维结构在生物医学领域的构建与应用。

引言

水凝胶被认为是生物制造领域的一种理想材料^1,2,3,4。其中，甲基丙烯酰化明胶（GelMA）自2000年由Van Den Bulcke等人首次提出以来，已成为最具多功能性的生物材料之一⁵。GelMA通过明胶与甲基丙烯酸酐（MA）的直接反应合成。明胶由哺乳动物胶原蛋白水解而来，含有基质金属蛋白酶（MMP）的作用靶序列。因此，利用GelMA构建的体外三维（3D）组织模型能够理想地模拟细胞与细胞外基质（ECM）在体内的相互作用。此外，一些其他水凝胶（如海藻酸盐）中缺乏的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列，在GelMA的分子链上得以保留。这使得包埋在水凝胶网络内的细胞能够实现有效黏附⁶。另外，GelMA具有良好的成形能力。其分子链上的甲基丙烯酰胺基团在温和反应条件下可与光引发剂发生反应，并在光照下形成共价键。因此，打印结构可通过简单的光照迅速交联，以维持预设的形态。

基于这些特性，一系列领域利用 GelMA 开展多种应用，如组织工程、基础细胞学分析、药物筛选和生物传感。因此，已有多种制备策略被报道^{7,8,9,10,11,12,13,14}。然而，基于 GelMA 实现 3D 生物打印仍具挑战性，这源于其固有特性。GelMA 是一种温度敏感性材料。在打印过程中，必须严格控制打印环境的温度，以维持生物墨水的物理状态。此外，GelMA 的黏度通常低于其他常见水凝胶（如海藻酸钠、壳聚糖、透明质酸等）。然而，在利用该材料构建 3D 结构时还会面临其他障碍¹⁵。

本文总结了本实验室提出的多种 GelMA 3D 生物打印方法，并描述了所打印的样品（即 GelMA 微球、GelMA 纤维、GelMA 复杂结构以及基于 GelMA 的微流控芯片）。每种方法具有特定功能，可根据不同需求在不同情境下采用。GelMA 微球通过电辅助模块生成，该模块施加额外的外部电场力以缩小液滴尺寸。GelMA 纤维则借助黏性海藻酸钠，通过同轴生物打印喷嘴挤出成型。此外，复杂三维结构的构建采用数字光处理（DLP）生物打印机实现。最后，提出了一种双重交联策略，将 GelMA 水凝胶与传统微流控芯片相结合，用于制备基于 GelMA 的微流控芯片。本文认为，该方案系统总结了本实验室所使用的 GelMA 生物打印策略，可为相关领域的研究人员提供重要参考和启发。

方案

1. 细胞培养

1. 准备添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），用于培养人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）系和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）系。
2. 准备含L-谷氨酰胺的DMEM/F-12培养基，添加10% FBS和1%青霉素/链霉素，用于培养骨髓间充质干细胞（BMSC）系。
3. 将培养环境设置为37 °C和5% CO₂。培养MDA-MB-231、HUVEC和BMSC细胞，当细胞融合度达到90%时，按1:2比例传代。

2. GelMA 微球的制备

1. 使用熔融沉积成型（FDM）打印机以聚乳酸（PLA）材料打印如图1A所示的夹具。将两个金属环电极放入夹具中。
2. 将两个金属环电极分别连接至接地端和正极端。将连接高压的金属板置于环电极下方，并在金属板上放置盛有硅油的培养皿作为液滴接收器。
3. 将冻干的 GelMA（5% w/v）和锂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸盐（LAP，0.5% w/v）溶解于杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中，配制成10 mL生物墨水。使用0.22 μm滤膜过滤生物墨水以确保无菌，并在37 °C水浴中加热15分钟。
4. 用3 mL 0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA溶液在37 °C下消化MDA-MB-231细胞3分钟。将细胞转移至15 mL离心管中，在100 × g条件下离心5分钟，获得细胞沉淀。
5. 弃去上清液。通过缓慢吹打，将细胞沉淀与1 mL预热的生物墨水混合，避免产生气泡。
6. 将1 mL生物墨水（含MDA-MB-231细胞）装入3 mL无菌注射器中。利用压缩空气（约0.5 kPa）推动生物墨水。将注射器安装至夹具上。
   注意：打印环境应严格控制在温度30 °C、湿度50%的条件下。
7. 开启高压电源，设置电压为0–4 kV。同时打开波长为405 nm的光源，以在5 mL硅油中交联GelMA微滴。
8. 通过倾倒方式倒出大部分硅油。用勺子将残留的硅油和GelMA微球转移至15 mL离心管中。
9. 加入5 mL DPBS，充分振荡混匀。在100 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。
10. 重复步骤2.9三次。
11. 用勺子取出GelMA微球，将其转移至培养皿中，加入DMEM培养基，在37 °C、5% CO₂条件下培养3天。
12. 弃去培养基，用DPBS洗涤微球。加入2 mL 4%多聚甲醛（PFA），室温（RT）固定30分钟。
13. 弃去PFA，用DPBS洗涤微球。加入2 mL 0.5%非离子型表面活性剂（如Triton X-100），室温透膜5分钟。
14. 弃去非离子型表面活性剂，用DPBS洗涤微球。加入2 mL 四甲基罗丹明（TRITC）标记的鬼笔环肽，在室温避光条件下染色30分钟。
15. 弃去TRITC染液，用DPBS洗涤微球。加入2 mL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），在室温避光条件下染色10分钟。
16. 弃去DAPI染液，用DPBS洗涤微球。使用共聚焦荧光显微镜观察并采集微球形态图像。

3. GelMA 纤维的制备

1. 如图2A所示，制备一个同轴喷嘴。使用焊料固定内喷嘴（25 G，外径 = 510 μm，内径 = 250 μm）和外喷嘴（18 G，外径 = 1200 μm，内径 = 900 μm）。将一根玻璃管（长度 = 50 mm，内径 = 1.2 mm）连接至同轴喷嘴末端。
2. 将经紫外光（UV）照射灭菌30分钟的海藻酸钠（Na-Alg）粉末溶于去离子水中，配制成2%（w/v）的溶液。
3. 按照步骤2.3制备无菌生物墨水溶液。将GelMA生物墨水和Na-Alg溶液置于37 °C水浴中加热15分钟。
4. 用3 mL含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的溶液在37 °C下消化BMSCs细胞3分钟。将细胞转移至15 mL离心管中，在100 × g条件下离心5分钟，获得细胞沉淀。
5. 弃去上清液。用移液器缓慢吸取2 mL预热的GelMA生物墨水与细胞沉淀混合，避免产生气泡。
6. 将2 mL生物墨水（含BMSCs）装入一支10 mL注射器中，另取2 mL Na-Alg溶液装入另一支10 mL注射器中。分别通过两台注射泵输送（此处，生物墨水流速为50 μm/min，Na-Alg溶液流速为350 μm/min）。
   注意：打印环境应严格控制在温度30 °C、湿度50%的条件下。
7. 开启波长为405 nm的光源，照射透明管以交联GelMA纤维。使用含有DPBS的培养皿收集纤维。
8. 用勺子从DPBS中取出GelMA纤维，并将其置于预先准备的DMEM/F-12培养基中，在37 °C、5% CO₂条件下培养3天。
9. 按照步骤2.12−2.16处理GelMA纤维，用于共聚焦荧光显微镜下的形态学观察。

4. 复杂三维 GelMA 结构的制备

注意：图3A 展示了复杂的三维 GelMA 结构的制备示意图。

1. 用75%酒精擦拭DLP生物打印机（图3E），并进行30分钟紫外照射以实现灭菌。
2. 将冻干的GelMA（10% w/v）和LAP（0.5% w/v）溶解于DPBS中。向溶液中加入品红色食用色素（3% v/v），以提高打印精度。
3. 使用0.22 μm滤膜过滤溶液以确保无菌，并在37 °C水浴中加热15分钟。
4. 使用计算机辅助设计（CAD）软件构建3D模型。将模型文件导入所用DLP生物打印机的上位软件（EFL）中。
5. 将10 mL制备好的生物墨水加入DLP生物打印机的槽中。
6. 在上位软件中设置打印参数如下：光强 = 12 mW/cm²，照射时间 = 30 s，切片高度 = 100 μm。开始打印。
7. 将打印出的结构从生物打印机中取出，并浸入培养皿中的DPBS中。
8. 用3 mL 0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA溶液在37 °C下消化MDA-MB-231细胞3分钟。在15 mL离心管中以100 × g离心5分钟，收集细胞沉淀。
9. 弃去上清液，将细胞沉淀与2 mL DMEM混合。
10. 在打印结构上加入100 μL细胞悬液。在37 °C、5% CO₂条件下，使用预热的DMEM培养3天。
11. 按照步骤2.12−2.16制备复杂的3D结构，用于共聚焦荧光显微镜下的形态学观察。

5. GelMA 基微流控芯片的制备

注意：图4A 展示了基于 GelMA 的微流控芯片的制备示意图。

1. 将冻干的 GelMA（10% w/v）和 LAP（0.5% w/v）溶解于 DPBS 中。使用 0.22 μm 滤膜过滤 GelMA 溶液以确保无菌。
2. 将明胶粉末在紫外线下灭菌 30 分钟，然后加入第 5.1 步制备的 GelMA-LAP 溶液中，使明胶终浓度为 5%（w/v）。将混合物置于 37 °C 水浴中加热 15 分钟。
3. 使用 CAD 软件设计一组模具（图 4B,C），并通过 DLP 打印机使用光敏树脂制造模具。
4. 用制备好的生物墨水完全填充模具。
5. 将模具放入 4 °C 冰箱中，使明胶交联 30 分钟。
6. 取出模具，用刀片将部分（物理）交联的水凝胶片从模具中脱出。
7. 将两个脱模后的水凝胶片结合，并在 GelMA 的辅助下通过 405 nm 光照 1 分钟使其键合。
8. 在 37 °C 下，使用 3 mL 0.25% 胰蛋白酶-0.02% EDTA 溶液处理 HUVECs 细胞 3 分钟以使其脱离。将细胞转移至 15 mL 离心管中，在 100 × g 条件下离心 5 分钟，收集细胞沉淀。
9. 弃去上清液，将细胞沉淀与 2 mL DMEM 混合。
10. 使用喷嘴和注射器将细胞悬液注入微通道，使其完全充满。
11. 在接下来的 3 小时内，每 15 分钟将芯片翻转一次，以实现均匀且完全的细胞接种。将芯片置于培养皿中，在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下，使用预热的 DMEM 培养 3 天。
12. 按照步骤 2.12−2.16 的操作，准备微流控芯片用于共聚焦荧光显微镜下的形态学观察。

结果

在制备 GelMA 微球的过程中，GelMA 液滴通过外加电场力实现分离。当液滴落入接收相的硅油中时，保持了标准的球形结构，无拖尾现象。这是因为 GelMA 液滴处于水相，而硅油为油相，两相之间形成的表面张力促使 GelMA 液滴维持标准的球形形态。对于载细胞微球而言，细胞在此过程中经历了高压电场作用。通过对染色后的 MDA-MB-231 细胞形态观察（图 1B–E）发现，包封的 MDA-MB-231 细胞仍保持其铺展能力，验证了该电辅助制备方法的生物相容性。

在 GelMA 纤维的制备过程中，GelMA 和海藻酸钠溶液分别流经同轴喷头的内层和外层喷嘴。由于海藻酸钠的黏度高于 GelMA，GelMA 被限制在海藻酸钠溶液中并保持线性形态。通过光照（405 nm 波长）使内部的 GelMA 发生交联，从而形成 GelMA 纤维（图 2B）。此外，BMSCs 被包埋于 GelMA 纤维中（

讨论

本文介绍了几种制备 GelMA 三维结构的策略，包括 GelMA 微球、GelMA 纤维、GelMA 复杂结构以及基于 GelMA 的微流控芯片。GelMA 具有良好的生物相容性和成形能力，广泛应用于生物制造领域。微球结构适用于可控药物释放、组织培养以及注射入生物体内进行进一步治疗^{21,22,23,24,25}。由于 GelMA 溶液的黏度较低，其成形较为困难。因此，在制备 GelMA 微球时，采用电液动力学（EHD）原理来解决这一问题。所施加的电压相对较低，微液滴逐个生成。为了制备更小尺寸的微球，可以提高施加的电压，此时流体会进入另一种状态并形成泰勒锥（Taylor cone）²⁶。

由于库仑爆炸现象，带电液滴因...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 μm 滤膜	Millipore
2-(4-脒基苯基)-6-吲哚羧脒二盐酸盐（DAPI）	上海翊圣生物科技有限公司，中国上海
3D 生物打印机	苏州智能制造研究院，中国苏州
405 nm 波长光源	苏州智能制造研究院，中国苏州
同轴喷嘴	苏州智能制造研究院，中国苏州
共聚焦荧光显微镜	OLYMPUS FV3000
数字光处理（DLP）生物打印机	苏州智能制造研究院，中国苏州
DLP 打印机	苏州智能制造研究院，中国苏州
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）	杭州坦普生物技术有限公司，中国杭州
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）	杭州坦普生物技术有限公司，中国杭州
含 L-谷氨酰胺的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM/F-12）	杭州坦普生物技术有限公司，中国杭州
EFL 软件	苏州智能制造研究院，中国苏州
胎牛血清（FBS）	杭州坦普生物技术有限公司，中国杭州
明胶	Sigma-Aldrich，中国上海
甲基丙烯酰化明胶（GelMA）	苏州智能制造研究院，中国苏州
高压电源	苏州智能制造研究院，中国苏州
苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基二苯基氧化膦锂（LAP）	苏州智能制造研究院，中国苏州
多聚甲醛	杭州坦普生物技术有限公司，中国杭州
青霉素/链霉素	杭州坦普生物技术有限公司，中国杭州
海藻酸钠（Na-Alg）	Sigma-Aldrich，中国上海
TRITC 标记鬼笔环肽	上海翊圣生物科技有限公司，中国上海
吐温 X-100	北京索莱宝科技有限公司，中国上海