位移分析法揭示胚胎斑马鱼心脏功能的节段性异质性（DIAMOND）

摘要

本实验方案旨在详细介绍一种在生理和病理条件下评估胚胎斑马鱼节段性心脏功能的新方法。

摘要

斑马鱼作为心肌病和再生研究的模式生物，其应用日益广泛。目前评估心脏功能的方法难以可靠地检测节段性心肌力学，且在斑马鱼中实施困难。本文介绍一种半自动、开源的四维（4D）节段性心脏功能定量评估方法：心肌机械形变位移分析法（DIAMOND）。利用配备4D心脏运动同步系统的光片荧光显微镜对转基因斑马鱼胚胎进行活体成像。在收缩末期和舒张末期重建获得的三维数字心脏，并对手动分割的二值化数据集进行心室划分。随后，将心脏沿真实短轴重新定向并各向同性重采样，并沿短轴方向将心室均匀划分为八个部分（I–VIII）。由于收缩末期与舒张末期的重采样平面和矩阵不同，需应用变换矩阵进行图像配准，以恢复重采样后的收缩期与舒张期图像矩阵之间的原始空间关系。图像配准后，基于三维（3D）质量质心的位移，计算每个节段从收缩末期到舒张末期的位移矢量。DIAMOND结果显示，靠近房室管的基底段心肌发生最大的机械形变，也最易受到阿霉素诱导的心脏损伤。总体而言，DIAMOND在生理和病理条件下，提供了超越传统射血分数（EF）的斑马鱼胚胎节段性心脏力学新见解。

引言

化疗引起的心脏毒性及其导致的心力衰竭是化疗中断的主要原因之一¹。因此，心脏功能评估在识别心脏毒性方面发挥着关键作用，更重要的是可用于预测化疗后早期心脏损伤²。然而，目前的心脏功能评估方法存在局限性。例如左心室射血分数（LVEF）仅能提供损伤后整体且往往延迟的心脏力学信息^3,4。组织多普勒成像可提供节段性心肌变形信息，但由于超声束角度依赖性，其结果存在显著的观察者内和观察者间变异⁵。二维（2D）斑点追踪技术利用超声心动图的B模式，理论上消除了角度依赖性，但其准确性受限于离面运动⁶。因此，在科研和临床实践中，仍缺乏一种严谨的节段性心脏功能量化方法。

在此背景下，我们开发了一种用于分析节段性心脏功能的四维定量方法，命名为心肌机械形变位移分析法（DIAMOND），用于确定心肌质量质心在三维空间中的位移矢量。我们应用DIAMOND方法对斑马鱼（Danio rerio）模型体内的心脏功能及阿霉素诱导的心脏毒性进行了评估，选择该动物模型是因为其心肌具有再生能力，且发育相关基因高度保守⁷。我们进一步将节段性DIAMOND位....

方案

本文所述所有方法均经加州大学洛杉矶分校机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，实验均依照加州大学洛杉矶分校动物研究办公室批准的方案进行。

1. 繁育Tg(cmlc2:mCherry)斑马鱼及胚胎采集

1. 按照既往建立的饲养与繁殖操作规范进行饲养、繁殖及胚胎采集。具体细节参见 Messerschmidt 等人⁹。
2. 受精后 18 小时，用含 0.003% 1-苯基-2-硫脲（PTU）的 E3 培养基处理收集的胚胎，以保持胚胎透明度，便于进行 LSFM 成像。

2. 使用阿霉素处理诱导心脏损伤

1. 在受精后3天（dpf），用浓度为10 μM的阿霉素E3鱼水培养基处理胚胎。在4 dpf前进行24小时处理后，将含阿霉素的培养基更换为新鲜的E3培养基。
   注意：阿霉素是一种化疗药物，需佩戴适当个人防护装备（PPE），废弃物应置于生物危害废物容器中处理。

3. Notch 信号通路调控

1. 在3–6 dpf期间，使用浓度为10 μM的Notch通路抑制剂(2S)-N-[(3,5-二氟苯基)乙酰基]-L-丙氨酰-2-苯基]甘氨酸1,1-二甲基乙基酯（DAPT）处理斑马鱼胚胎，溶剂为E3鱼水培养基....

结果

DIAMOND 用于评估三维节段性心脏功能的开发过程如图1所示。在获取胚胎斑马鱼心脏的光片显微镜（LSFM）图像并完成三维重建后（图1A），通过多平面观察器确定垂直和水平长轴，并将垂直于这两个长轴的平面定义为真正的短轴平面（图1B）。随后，沿该短轴平面重新采样心脏图像（图1C），并根据一条虚拟分割线（红色虚线）将心脏均分为八个角度相等的节段，该分割线连接心室内膜腔中心与房室管中心（图1E）。所识别节段的三维表现以横截面视图展示（图1F），并与原始数据进行对比（图2

讨论

定量评估节段性心肌功能的严格策略对于超越传统射血分数（EF）来评价心脏力学至关重要，因为EF作为心肌损伤的指标已被认为不敏感且存在延迟^1,4,12。因此，人们对能够反映早期心肌变化的生物标志物日益关注，越来越多的研究文献支持将心肌形变参数作为预测心室功能障碍的早期指标^4,13。超声心动图对左心室（LV）应变的测量是评估心肌形变的一种成熟方法¹³。然而，基于组织多普勒的应变成像由于存在角度依赖性以及观察者内和观察者间的变异性而存在诸多局限性¹⁴。斑点追踪超声心动图（STE）可实现与角度无关的二维（2D）和三维（3D）组织形变分析，但二维斑点追踪的准确性会受到平面外运动的影响⁶，而三维斑点追踪则需要.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Amira6	FEI		图像分析软件
DAPT	Millipore Sigma	D5942-5MG
盐酸多柔比星	Millipore Sigma	D1515-10MG
氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐	Millipore Sigma	E10521-10G	三卡因
MATLAB	MathWorks		编程环境
MATLAB 图像处理工具箱	MathWorks		图像处理工具箱