本实验方案旨在详细介绍一种在生理和病理条件下评估胚胎斑马鱼节段性心脏功能的新方法。
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摘要
摘要
斑马鱼作为心肌病和再生研究的模式生物，其应用日益广泛。目前评估心脏功能的方法难以可靠地检测节段性心肌力学，且在斑马鱼中实施困难。本文介绍一种半自动、开源的四维（4D）节段性心脏功能定量评估方法：心肌机械形变位移分析法（DIAMOND）。利用配备4D心脏运动同步系统的光片荧光显微镜对转基因斑马鱼胚胎进行活体成像。在收缩末期和舒张末期重建获得的三维数字心脏，并对手动分割的二值化数据集进行心室划分。随后，将心脏沿真实短轴重新定向并各向同性重采样，并沿短轴方向将心室均匀划分为八个部分（I–VIII）。由于收缩末期与舒张末期的重采样平面和矩阵不同，需应用变换矩阵进行图像配准，以恢复重采样后的收缩期与舒张期图像矩阵之间的原始空间关系。图像配准后，基于三维（3D）质量质心的位移，计算每个节段从收缩末期到舒张末期的位移矢量。DIAMOND结果显示，靠近房室管的基底段心肌发生最大的机械形变，也最易受到阿霉素诱导的心脏损伤。总体而言，DIAMOND在生理和病理条件下，提供了超越传统射血分数（EF）的斑马鱼胚胎节段性心脏力学新见解。
引言
化疗引起的心脏毒性及其导致的心力衰竭是化疗中断的主要原因之一1。因此，心脏功能评估在识别心脏毒性方面发挥着关键作用，更重要的是可用于预测化疗后早期心脏损伤2。然而，目前的心脏功能评估方法存在局限性。例如左心室射血分数（LVEF）仅能提供损伤后整体且往往延迟的心脏力学信息3,4。组织多普勒成像可提供节段性心肌变形信息，但由于超声束角度依赖性，其结果存在显著的观察者内和观察者间变异5。二维（2D）斑点追踪技术利用超声心动图的B模式，理论上消除了角度依赖性，但其准确性受限于离面运动6。因此，在科研和临床实践中，仍缺乏一种严谨的节段性心脏功能量化方法。
在此背景下，我们开发了一种用于分析节段性心脏功能的四维定量方法，命名为心肌机械形变位移分析法（DIAMOND），用于确定心肌质量质心在三维空间中的位移矢量。我们应用DIAMOND方法对斑马鱼（Danio rerio）模型体内的心脏功能及阿霉素诱导的心脏毒性进行了评估，选择该动物模型是因为其心肌具有再生能力，且发育相关基因高度保守7。我们进一步将节段性DIAMOND位移分析结果与整体射血分数（EF）测定以及阿霉素处理后的二维应变分析进行了比较。通过将DIAMOND位移分析与胚胎斑马鱼心脏的四维光片荧光显微镜（LSFM）成像结果相整合，DIAMOND显示，邻近房室管的基底部心肌节段经历最大的机械形变，且对急性阿霉素心脏损伤最为敏感8。
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方案
本文所述所有方法均经加州大学洛杉矶分校机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，实验均依照加州大学洛杉矶分校动物研究办公室批准的方案进行。
1. 繁育Tg(cmlc2:mCherry)斑马鱼及胚胎采集
- 按照既往建立的饲养与繁殖操作规范进行饲养、繁殖及胚胎采集。具体细节参见 Messerschmidt 等人9。
- 受精后 18 小时，用含 0.003% 1-苯基-2-硫脲（PTU）的 E3 培养基处理收集的胚胎，以保持胚胎透明度，便于进行 LSFM 成像。
2. 使用阿霉素处理诱导心脏损伤
- 在受精后3天（dpf），用浓度为10 μM的阿霉素E3鱼水培养基处理胚胎。在4 dpf前进行24小时处理后，将含阿霉素的培养基更换为新鲜的E3培养基。
注意：阿霉素是一种化疗药物，需佩戴适当个人防护装备（PPE），废弃物应置于生物危害废物容器中处理。
3. Notch 信号通路调控
- 在3–6 dpf期间，使用浓度为10 μM的Notch通路抑制剂(2S)-N-[(3,5-二氟苯基)乙酰基]-L-丙氨酰-2-苯基]甘氨酸1,1-二甲基乙基酯（DAPT）处理斑马鱼胚胎，溶剂为E3鱼水培养基。
- 在1细胞期的斑马鱼胚胎中显微注射Notch下游效应因子Notch胞内结构域（NICD）和神经调节蛋白-1（Nrg-1）的mRNA，注射浓度分别为10 pg/nL和5 pg/nL8,10。
注意：显微注射在显微镜下进行，并借助气泵精确控制注射体积。mRNA应在受精卵处于第一细胞期时注入细胞内。有关mRNA制备及其序列的详细信息，请参见Chen等人的研究8；有关显微注射及注射针制备的详细信息，请参见Rosen等人的研究10。
4. LSFM 成像与成像后同步
- 关于光片荧光显微成像技术及成像后同步算法的详细信息，请参见先前发表的文献9,11。
注意：简而言之，我们的系统采用连续波激光器作为照明光源，用于对所有转基因斑马鱼品系进行成像。检测模块由两台科学级互补金属氧化物半导体（sCMOS）相机和两组滤光片组成，以实现双通道成像。检测模块垂直安装于照明平面。每个光片荧光显微镜帧的曝光时间为 20 毫秒，横截面分辨能力约为 0.65 μm，连续帧之间的步进距离约为 2 μm。使用 589 nm 激光激发 mCherry 荧光信号。
5. 三维收缩期与舒张期心脏的重建
- 打开由后期同步算法创建的文件夹，然后进入“Output”文件夹。选择心脏的中间层面，并将整个文件夹加载到 ImageJ 中。找到第一个舒张期和收缩期相位，并记录帧编号。
- 打开“Output/By State”文件夹，找到与刚刚记录的帧编号相同的文件夹。将文件夹中的图像转换为 3D TIFF（标记图像文件格式）文件，并将其命名为“diastole.tif”和“systole.tif”。
6. 心室的分割
- 打开图像分析软件（参见 材料表）。点击 文件 | 打开数据，加载“diastole.tif”和“systole.tif”。根据成像设置输入体素尺寸。
注意：对于所使用的 LSFM 系统，典型的体素尺寸为 0.65 µm × 0.65 µm × 2 µm。 - 点击“分割”面板，手动分割出心脏的心室部分。内置的“阈值”工具可选择高于某一强度的所有区域，有助于加快此过程。心室是较厚且荧光较强的腔室。
注意：确保从分割后的心室中去除房室管和流出道，因为这会影响位移分析。 - 完成分割后，点击“项目”面板。在控制台中右键单击“diastole.Labels.tif”和“systole.Labels.tif”标签页，然后点击“导出数据为”，将数据保存为 3D TIFF 文件。
7. 创建用于图像配准的矩形平行六面体
- 运行 "prepImage_1.m" 在编程环境中（参见 材料表）。打开 "prepImage_1.m", "ImPath" 第5行，使文件夹包含原始和分割后的TIFF文件，并更改 "切片" 第4行中的数值应与3D tif文件的切片数量一致。
- 运行代码后，将生成五个新的 3D TIFF 文件（"test.tif", "舒张期_200.tif", "systole_200.tif", "diaLabel.tif"，以及 "sysLabel200.tif"）以及两个新文件夹（"重采样直径" 和 "重采样系统").
8. 沿短轴平面重采样收缩期和舒张期的三维心脏
- 将全部五个 3D TIFF 文件导入图像分析软件（参见 材料表）。
注意：体素尺寸保持不变。 - 进入 多平面重建（MULTIPLANAR） 面板。选择“diastole_200.tif”作为主数据。将 X 轴（XY 平面中的绿色线）与心室的垂直长轴对齐，将 Z 轴（YZ 平面中的红色线）与心室的水平长轴对齐。
注意：垂直长轴通过在 XY 平面中寻找连接心尖与流出道的最长轴确定，水平长轴通过在 YZ 平面中寻找连接心尖与流出道的最长轴确定。通过将光标置于轴的末端旋转该轴。 - 从斜向 YZ 平面（短轴平面）中逆时针方向选择三个随机点，并记录其三维坐标位置。
注意：确保所选点为逆时针方向。 - 对“systole_200.tif”重复步骤 8.2 和 8.3。
- 点击“PROJECT”面板。通过右键点击“diastole_200.tif”并搜索“Slice”对象，为“diastole_200.tif”创建一个“Slice”对象。左键点击刚创建的 Slice 对象，在 属性面板 | 选项 中勾选“Set Plane”，并在“Plane Definition”中选择三个点。输入步骤 7.3 中记录的三个点的坐标。
- 对“systole_200.tif”重复步骤 8.5。
注意：所创建的 Slice 对象名称应为“Slice 2”。 - 右键点击“diastole_200.tif”，搜索“Resample Transformed Image”并创建该对象。在 属性 面板中，选择“Slice”作为“Reference”，然后点击 Apply。这将生成一个名为“diastole_200.transformed”的对象。
- 右键点击“diastole_200.transformed”，搜索“Resample”并创建该对象。在 属性 面板中选择“Voxel Size”作为“Mode”，并将“Voxel Size”设置为 x = 1，y = 1，z = 1。
- 点击“Apply”。这将生成一个名为“diastole_200.resampled”的对象。右键点击“diastole_200.resampled”并将其保存为 3D TIFF 文件。
- 对“diaLabel.tif”和“test.tif”执行相同操作，将“diaLabel.resampled”和“test.resampled”保存为 3D TIFF 文件。对“systole_200.tif”、“sysLabel.tif”和“test.tif”使用“Slice 2”作为参考重复相同步骤，并将“systole_200.resampled”、“sysLable.resampled”和“test2.resampled”保存为 3D TIFF 文件。
注意：确保本步骤共保存了六个 TIFF 文件。
9. 重采样心脏的分割
- 将第8步中的全部六个重采样文件导入 ImageJ。选择一个切片 "systole_200.resampled" 其中清晰显示房室管。记录该切片的编号。
- 使用 "图像 | 变换 | 旋转" 使用 ImageJ 的功能使房室管呈垂直状态。对所有文件应用相同的旋转。关闭所有窗口并保存所有更改。
- 移动 "舒张期_200.重采样", "diaLabel.resampled"，以及 "test.resampled" 到 "重采样直径" 文件夹，并移动 "systole_200.resampled", "重采样"，以及 "test2.resampled" 到 "重采样系统" 文件夹
- 开放 "divider_2_8_pieces.m". 变化 "ImPath" 第5行 "ImPath" 第395行，更改为图像目录。更改该变量 "中段" 在第22行和第411行，对应于房室管清晰可见的切片编号 "systole_200.resampled" 和 "舒张期_200.重采样".
- 运行代码，在弹出的窗口中，分别在心室中心点击一次，并在房室管中心点击一次。此操作需对收缩期和舒张期的图像各重复一次。
10. 收缩期和舒张期图像矩阵的注册
- 打开“register_3.m”文件，并将第4行中的“ImPath”修改为图像文件夹路径。运行此代码可能需要5–20分钟，具体时间取决于系统的计算能力。
注意：步骤7中人工创建的长方体用于三维刚性配准，该配准可保持两点间的距离以及由三点所构成的角度不变。当将舒张末期的长方体（红色）配准至收缩末期的长方体（绿色）时，由此产生的三维位置差异可用于推导出唯一的刚性变换矩阵，该矩阵包含从舒张末期到收缩末期的旋转和平移信息（图1H）。我们使用图像处理工具箱（见材料表）进行配准及变换后矩阵的正则化能量最小化去噪处理。有关详细的数学描述，请参见Chen等8。
11. 位移矢量的输出
- 开放 "位移_4.m" 并改变 "ImPath" 在第4行中输入图像文件夹路径。
- 运行 "位移_4.m"，可生成一个 "文件 vector8.txt 内容未提供，无法进行翻译。请提供具体文本内容以便继续。" 文件在 "载体" 文件夹。一旦 "请提供需要翻译的具体文本内容，当前文件“vector8.txt”未包含可翻译的源文本。" 文件打开后，会显示一个 8 x 4 的矩阵。该矩阵的每一行包含四个数值，分别代表心室某一特定节段位移矢量的 X 分量、Y 分量、Z 分量以及合矢量的幅值。
注意：通过计算每个节段在三维空间中质量重心的位移来获得位移矢量。我们计算各节段的三维质量重心（PS 和 PD）坐标
（其中 k 分别表示 X、Y 或 Z 坐标）在从收缩期到舒张期的分割数据集中的各段（I-VI）图1J）。我们定义质量质心 在三维空间中如下所示：
其中 Cx = X, Cy Y、和 Cz Z, Mi = 每个区段（I ≤ i ≤ VI）的质量，m = 每个区段的体素数量，以及 ρ = 分段区域的密度函数为1，其余部分为0。在心动周期中，计算沿X、Y和Z轴的子位移矢量的L2范数以及总位移矢量。该矩阵共有八行，第一行和第八行包含房室管，因此在分析中予以忽略。第二行至第七行分别代表I至VI段。
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结果
DIAMOND 用于评估三维节段性心脏功能的开发过程如图1所示。在获取胚胎斑马鱼心脏的光片显微镜（LSFM）图像并完成三维重建后（图1A），通过多平面观察器确定垂直和水平长轴，并将垂直于这两个长轴的平面定义为真正的短轴平面（图1B）。随后，沿该短轴平面重新采样心脏图像（图1C），并根据一条虚拟分割线（红色虚线）将心脏均分为八个角度相等的节段，该分割线连接心室内膜腔中心与房室管中心（图1E）。所识别节段的三维表现以横截面视图展示（图1F），并与原始数据进行对比（图2
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讨论
定量评估节段性心肌功能的严格策略对于超越传统射血分数（EF）来评价心脏力学至关重要，因为EF作为心肌损伤的指标已被认为不敏感且存在延迟1,4,12。因此，人们对能够反映早期心肌变化的生物标志物日益关注，越来越多的研究文献支持将心肌形变参数作为预测心室功能障碍的早期指标4,13。超声心动图对左心室（LV）应变的测量是评估心肌形变的一种成熟方法13。然而，基于组织多普勒的应变成像由于存在角度依赖性以及观察者内和观察者间的变异性而存在诸多局限性14。斑点追踪超声心动图（STE）可实现与角度无关的二维（2D）和三维（3D）组织形变分析，但二维斑点追踪的准确性会受到平面外运动的影响6，而三维斑点追踪则需要...
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本研究由美国心脏协会资助，资助项目编号为16SDG30910007和18CDA34110338，以及美国国立卫生研究院资助，资助项目编号为HL083015、HL111437、HL118650和HL129727。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Amira6 | FEI | 图像分析软件 | |
| DAPT | Millipore Sigma | D5942-5MG | |
| 盐酸多柔比星 | Millipore Sigma | D1515-10MG | |
| 氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐 | Millipore Sigma | E10521-10G | 三卡因 |
| MATLAB | MathWorks | 编程环境 | |
| MATLAB 图像处理工具箱 | MathWorks | 图像处理工具箱 |
参考文献
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