本方案描述了从人羊膜的不同解剖区域分离上皮细胞的方法，旨在确定这些细胞的异质性及其功能特性，以期应用于临床和病理生理学模型。
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本文内容
摘要
摘要
文献中已报道了多种人羊膜上皮细胞（HAEC）的分离与培养方案。然而，这些方案均假设羊膜上皮为均一的单层结构。人羊膜可分为三个解剖区域：反折部、胎盘部和脐带部。每个区域在生理功能上具有差异，例如在病理状态下的作用不同。本文介绍了一种将人羊膜组织分为三个部分进行解剖并进行体外培养的实验方案。在体外培养中，来源于反折部的细胞呈现立方形形态，而来自胎盘部和脐带部的细胞则呈扁平鳞状。尽管如此，所有获得的细胞均表现出上皮细胞表型，这一点通过E-钙黏蛋白（E-cadherin）的免疫检测得以证实。因此，由于胎盘部与反折部在体内具有不同的细胞组成和分子功能，在体外研究中应考虑这些差异，因为它们可能对HAEC在生物医学研究中的应用以及其在再生医学中的前景产生重要的生理学影响。
引言
人羊膜上皮 细胞 人羊膜上皮细胞（HAEC）起源于胚胎发育早期，约在受精后第8天。它们来源于羊膜最内层的外胚层中的一群扁平上皮细胞。1因此，HAEC 被认为是 来自上胚层的多能细胞残余，具有分化为胚胎三个胚层的潜能2. 在过去十年中，多种 研究团队已开发出分离的方法 从妊娠足月的羊膜中分离这些细胞，以在培养模型中表征其假定的多能性相关特性 体外3,4.
因此，它 已发现人羊水来源的胚胎样细胞（HAEC）具有人多能干细胞（HPSC）的特征性性状，例如表面抗原SSEA-3、SSEA-4、TRA 1-60、TRA 1-81；多能性核心转录因子OCT4、SOX2和NANOG；以及增殖标志物KI67，提示其具有自我更新能力5,6,7此外，这些细胞已通过分化方案进行验证，以获得表达三个胚层（外胚层、中胚层和内胚层）谱系特异性标志物的细胞4,5,8，以及在人类疾病动物模型中。最后，HAEC 表达 E-cadherin，表明它们保留了类似于 HPSC 的上皮特性5,9.
除了胚胎来源外，HAEC还具有其他内在特性，使其适用于不同的临床应用，例如分泌抗炎和抗菌分子10,11、释放生长因子和细胞因子12、在移植到免疫缺陷小鼠体内时不会形成畸胎瘤（与HPSC相比）2，以及具有免疫耐受性，因为它们表达HLA-G，可降低移植后的排斥风险13。
然而，以往的研究报告均假设人羊膜是一种均质的膜结构，未考虑到其在解剖学和生理学上可分为三个区域：胎盘部（覆盖底蜕膜的羊膜）、脐带部（包裹脐带的部分）和反折部（未与胎盘相连的其余膜组织）14。已有研究表明，羊膜的胎盘部与反折部在形态学、线粒体活性、活性氧物质的检测15、miRNA表达16以及信号通路的激活17等方面均存在差异。这些结果提示，人羊膜由具有不同功能特性的异质性细胞群体组成，在开展后续的原位或体外模型研究时应充分考虑这一特性。尽管其他实验室已设计出从整片羊膜中分离人羊膜上皮细胞（HAEC）的方案，本实验室则建立了一套可从不同解剖区域分离、培养并鉴定细胞的标准化操作流程。
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方案
本方案已获得墨西哥城国家围产期研究所伦理委员会的批准（注册编号 212250-21041）。本研究中进行的所有操作均遵循国家围产期研究所的伦理标准、《赫尔辛基宣言》以及墨西哥卫生部颁布的官方墨西哥标准中的指导原则。
1. 准备
- 配制含EDTA的1×PBS溶液。向500 mL的1×PBS中加入500 μL的0.5 M EDTA储备液，终浓度为0.5 mM EDTA。
- 准备HAEC培养基。取450 mL高糖DMEM，加入5 mL丙酮酸钠（100 mM）、50 mL适用于干细胞的热灭活胎牛血清、5 mL非必需氨基酸（100×）、5 mL抗生素-抗真菌剂（100×）、5 mL L-谷氨酰胺（200 mM）和500 μL巯基乙醇（1,000×）。
- 对用于运输和处理组织的容器进行灭菌：带盖的不锈钢容器，用于将完整胎盘从手术室运送至实验室；托盘（20 cm × 30 cm × 8 cm），用于在分离羊膜前清洗胎盘并去除血液；塑料砧板，用于将羊膜分离为三个区域。
- 对手术器械（手术刀、剪刀、镊子和止血钳）、500 mL烧杯、棉质纱布和生理盐水进行灭菌。
2. 获取胎盘组织
注意：羊膜取自足月妊娠（37−40 周）因剖宫产指征接受手术且无任何临产迹象、无微生物学感染证据的女性。完整的分离与培养操作均在生物安全柜内的无菌条件下进行。
- 在手术室中，夹闭脐带以阻止血液流向其他组织。将整个胎盘连同已夹闭的脐带一起收集至无菌容器中。
- 向容器中加入 500 mL 生理盐水，以保持胎盘湿润。
- 封闭容器，并在室温下将组织运送至实验室。
- 将装有胎盘的容器放入生物安全柜中。
注意：若在胎盘采集后 15 分钟内无法立即进行解剖操作，应将装有胎盘的容器置于冰上保存，直至处理。从获取胎盘到开始解剖的时间间隔应避免超过 1 小时。
3. 羊膜按区域的机械分离
注意：该操作必须在生物安全柜内无菌条件下于室温进行。
- 从容器中取出整个胎盘，放置于托盘上，使脐带朝上。
- 使用无菌棉纱布，清除覆盖胎盘的绒毛膜羊膜表面的血凝块。
- 识别羊膜的三个区域：包裹脐带的脐带羊膜、覆盖底蜕膜的胎盘羊膜，以及未与胎盘相连的其余羊膜部分，即反射区（图1）。
- 分离脐带羊膜区域（图2A）。
- 使用解剖镊夹住覆盖胎盘与脐带连接处的羊膜部分。
- 用手术刀在脐带周围进行解剖，同时牵拉以将其与绒毛膜分离。
- 将分离的组织放入一个已标记的烧杯中，加入100 mL生理盐水溶液。
- 分离胎盘羊膜区域（图2B）。
- 使用无菌棉纱布，清除覆盖胎盘的绒毛膜羊膜表面的血凝块。
- 用解剖镊夹住胎盘与反射区交界处的膜组织。
- 沿胎盘边缘用手术刀环形切割。
- 将胎盘羊膜与绒毛膜分离，注意避免切断胎盘中的任何血管。
- 将分离的组织放入另一个已标记的烧杯中，加入300 mL生理盐水溶液。
- 将未与胎盘相连的其余羊膜部分（即反射区）从绒毛膜上分离（图2C）。
- 将反射区收集至另一个已标记的烧杯中，加入300 mL生理盐水溶液。
注：解剖过程中需持续添加生理盐水，防止组织干燥。
- 将反射区收集至另一个已标记的烧杯中，加入300 mL生理盐水溶液。
4. 膜的洗涤
注意：该操作必须在室温下的生物安全柜内无菌条件下进行。
- 分别弃去各膜区域的生理盐水溶液。
- 向脐带区域加入 100 mL 新鲜生理盐水溶液。
- 分别向胎盘区域和反折区域各加入 300 mL 新鲜生理盐水溶液。
- 借助解剖镊轻轻搅动 膜组织，以去除残留的血液。
- 弃去生理盐水溶液。
- 重复洗涤和搅动至少 3 次，直至膜组织呈半透明状。
- 将膜组织平铺并展开于板上，用无菌纱布擦去未被洗涤去除的血凝块。
注意：尽可能去除红细胞非常重要，因为红细胞的存在会影响胰蛋白酶的功能以及后续细胞培养的存活率。
5. 不同区域膜的酶消化
注意：该操作必须在生物安全柜内的无菌条件下进行。
- 将反向膜和胎盘区域切成两到三个碎片。
- 不要切割脐带区域。
- 将每个区域的碎片分别放入离心管中。向反向膜和胎盘区域各加入 20 mL 的 0.5% 胰蛋白酶/EDTA，向脐带区域加入 5 mL 的 0.5% 胰蛋白酶/EDTA。
注意：将反向膜和胎盘区域切为较小碎片非常重要，因为它们需要完全浸没在胰蛋白酶溶液中。 - 轻轻摇动离心管约 30 秒，随后弃去胰蛋白酶溶液。
- 向反向膜和胎盘区域分别加入 30 mL 新配制的 0.5% 胰蛋白酶/EDTA，向脐带区域加入 15 mL 新配制的 0.5% 胰蛋白酶/EDTA。
- 将离心管放入培养箱内的旋转混匀仪中。
- 在 37 °C 条件下以 20 rpm 旋转孵育 40 分钟。
注意：若无旋转混匀仪，可每 10 分钟手动轻轻摇动一次离心管。 - 将各区域的胰蛋白酶/细胞悬液转移至新的离心管中。
- 每管加入两倍体积、预热至 37 °C 的 HAEC 培养基以中和酶活性。
- 将第一次消化所得样品置于冰上保存。
- 重复步骤 5.6−5.8，进行第二次消化。
- 对于每个区域，用解剖镊夹住羊膜部分的一端，再用另一对镊子沿组织轻轻挤压，以去除在前期孵育过程中未完全脱落的成排上皮细胞。
- 将第二次消化液收集至另一组离心管中，并加入两倍体积的 HAEC 培养基以中和酶活性。
- 将已消化的膜组织弃入生物危害容器中。
6. HAEC 的分离
注意：该操作必须在生物安全柜内的无菌条件下进行。
- 在 4 °C 条件下，以 200 x g 离心所有离心管 10 分钟。
- 弃去上清液，每管加入 10 mL 预热至 37 °C 的 HAEC 培养基，轻轻吹打以重悬并分散沉淀中的细胞。
- 将两个消化步骤所得的细胞悬液按每种膜区域分别合并至单独的离心管中。
- 使用 100 μm 细胞滤网过滤细胞悬液，以去除细胞外基质碎片，获得单细胞悬液。
- 在微量离心管中准备三份，每份含 90 µL 台盼蓝溶液。
- 将每个膜区域的细胞悬液各取 10 μL 加入微量离心管中，并混匀。
- 在光学显微镜下使用血细胞计数板对细胞进行计数。
7. 人主动脉内皮细胞的培养
- 将来自三个区域的 HAEC 分别以 3 × 104 个细胞/cm2 的密度接种于预热的 HAEC 培养基中，培养基中添加 10 ng/mL 人表皮生长因子（EGF）。
- 将细胞接种于 100 mm 培养皿中以进行体外培养，或接种于 24 孔板中用于免疫化学分析。
- 将培养皿置于湿润的培养箱中，在 37 °C、常氧条件（5% CO2）下培养。
- 每天添加 EGF，并每三天更换一次培养基。
注意：细胞在 4−6 天后将达到融合状态。 - 可用于常规免疫组织化学、细胞分选分析、冷冻保存、RNA 和蛋白质提取，或继续传代培养。
8. 人支气管上皮细胞的传代
- 移除HAEC培养基，并用0.01 M PBS/EDTA溶液洗涤2次。
- 加入0.01 M PBS/EDTA溶液，在37 °C孵育15分钟。
- 移除PBS/EDTA溶液，加入1.5 mL 0.5%胰蛋白酶/EDTA溶液。
- 在37 °C孵育5−8分钟。
- 用两倍体积的HAEC培养基终止酶反应。
- 收集混合液，于200 × g 离心5分钟。
- 计数细胞，并继续后续传代或用于进一步分析。
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结果
从羊膜的三个解剖区域分别分离出人羊膜上皮细胞（HAEC），并在体外分别进行培养。培养48小时后，具有上皮表型的细胞已贴附于培养板表面，尽管培养基中仍含有细胞碎片和悬浮细胞，这些杂质在更换培养基时被去除（图3）。
在原代培养（第零代，P0）的处理过程中，可能会出现一些干扰实验数据分析的问题（图4）：若在试剂污染或分离过程中发现细菌污染，建议弃去该培养物并重新处理另一张膜（图4A）；因膜洗涤不充分导致红细胞过多（图4B）；细胞贴壁不良或完全不贴壁（图4C）；或细胞呈现成纤维细胞形态（图4D），提示可能分离到的是人羊膜间充质细胞（HAMC）而非人羊膜上皮细胞（HAEC）。
人羊膜...
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讨论
我们建立了一种从足月胎膜中分离人羊膜上皮细胞（HAEC）的新方案。与以往报道不同的是，在分离前先将每份胎膜按其三个解剖区域进行分割，以便分别分析各区域来源的细胞。
该实验方案中最关键的步骤之一是清洗膜以彻底去除所有血凝块，因为血凝块可能在分离上皮细胞时干扰胰蛋白酶的活性。若此步骤操作不当，可能导致获得的原代培养物中含有大量红细胞而贴壁的上皮细胞数量稀少。若在细胞接种后的最初24−48小时内未观察到细胞贴壁，建议弃去该培养物。另一个关键环节是酶消化的孵育时间。若孵育时间过长，细胞活力可能下降，或获得呈现间充质样而非上皮样形态的细胞培养物（图4）。此外，若膜的消化过程中未进行适当的振荡，每片膜获得的细胞数量偏低的概率将增加。
在本实验方案中，我们可以在体外培养人羊膜上皮细胞（HAEC），同时保持其上皮表型，这通过大多数细胞在连续传代过程中表达特异性上皮细胞标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）得以证实（图6）...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究获得了墨西哥国家围产期研究所（21041 和 21081）以及 CONACYT（A1-S-8450 和 252756）基金的资助。我们感谢 Jessica González Norris 和 Lidia Yuriria Paredes Vivas 提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 培养试剂 | |||
| 2-巯基乙醇 | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| 无动物源性重组人表皮生长因子（EGF） | Peprotech | AF-100-15 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| 杜氏改良伊格尔培养基（DMEM） | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | 添加高糖和HEPES |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0.5 M |
| 胚胎干细胞专用胎牛血清（FBS），已鉴定 | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10439024 | |
| 非必需氨基酸 | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| 多聚甲醛 | 任意品牌 | ||
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| 生理盐水溶液（0.9% 氯化钠） | 任意品牌 | ||
| 丙酮酸钠 | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 | 100 mM |
| 0.05% 胰蛋白酶/EDTA | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| 一次性耗材 | |||
| 100 µm 细胞筛 | Corning/Falcon | 352360 | |
| 100 mm 经组织培养处理的培养皿 | Corning | 430167 | |
| 24孔透明组织培养处理多孔板 | Corning/Costar | 3526 | |
| 6孔透明组织培养处理多孔板 | Corning/Costar | 3516 | |
| 无热原无菌离心管 | 任意品牌 | 带锥形底部 | |
| 1,000 µl、200 µl 和 10 µl 无热原无菌吸头 | |||
| 无菌棉纱布 | |||
| 5 mL、10 mL 和 25 mL 无菌移液管 | 任意品牌 | ||
| 无菌外科手套 | 任意品牌 | ||
| 设备 | |||
| 生物安全柜 | |||
| 离心机 | |||
| 微量移液器 | |||
| 电动移液器填充/分配装置 | |||
| 500 mL 无菌烧杯 | |||
| 无菌塑料切板 | |||
| 无菌手术刀、剪刀、镊子、夹子 | |||
| 无菌不锈钢容器 | |||
| 无菌托盘 | |||
| 试管旋转仪 | MaCSmix | ||
| 抗体与试剂盒 | 抗体编号 | ||
| 抗E-钙黏蛋白抗体 | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| 抗KI67抗体 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859 |
| 抗NANOG抗体 | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| 抗OCT4抗体 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| 抗SOX2抗体 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| 抗SSEA-4抗体 | Cell Signaling | 4755 | RRID:AB_1264259 |
| 抗TRA-1-60抗体 | Cell Signaling | 4746 | RRID:AB_10563566 |
| 山羊抗小鼠Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| 山羊抗兔Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| TUNEL检测试剂盒 | Abcam | 66110 |
参考文献
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