本方案描述了从人羊膜的不同解剖区域分离上皮细胞的方法，旨在确定这些细胞的异质性及其功能特性，以期应用于临床和病理生理学模型。
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本文内容
摘要
摘要
文献中已报道了多种人羊膜上皮细胞（HAEC）的分离与培养方案。然而，这些方案均假设羊膜上皮为均一的单层结构。人羊膜可分为三个解剖区域：反折部、胎盘部和脐带部。每个区域在生理功能上具有差异，例如在病理状态下的作用不同。本文介绍了一种将人羊膜组织分为三个部分进行解剖并进行体外培养的实验方案。在体外培养中，来源于反折部的细胞呈现立方形形态，而来自胎盘部和脐带部的细胞则呈扁平鳞状。尽管如此，所有获得的细胞均表现出上皮细胞表型，这一点通过E-钙黏蛋白（E-cadherin）的免疫检测得以证实。因此，由于胎盘部与反折部在体内具有不同的细胞组成和分子功能，在体外研究中应考虑这些差异，因为它们可能对HAEC在生物医学研究中的应用以及其在再生医学中的前景产生重要的生理学影响。
引言
人羊膜上皮 细胞 人羊膜上皮细胞（HAEC）起源于胚胎发育早期，约在受精后第8天。它们来源于羊膜最内层的外胚层中的一群扁平上皮细胞。1因此，HAEC 被认为是 来自上胚层的多能细胞残余，具有分化为胚胎三个胚层的潜能2. 在过去十年中，多种 研究团队已开发出分离的方法 从妊娠足月的羊膜中分离这些细胞，以在培养模型中表征其假定的多能性相关特性 体外3,4.
因此，它 已发现人羊水来源的胚胎样细胞（HAEC）具有人多能干细胞（HPSC）的特征性性状，例如表面抗原SSEA-3、SSEA-4、TRA 1-60、TRA 1-81；多能性核心转录因子OCT4、SOX2和NANOG；以及增殖标志物KI67，提示其具有自我更新能力5,6,7此外，这些细胞已通过分化方案进行验证，以获得表达三个胚层（外胚层、中胚层和内胚层）谱系特异性标志物的细胞4,
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方案
本方案已获得墨西哥城国家围产期研究所伦理委员会的批准（注册编号 212250-21041）。本研究中进行的所有操作均遵循国家围产期研究所的伦理标准、《赫尔辛基宣言》以及墨西哥卫生部颁布的官方墨西哥标准中的指导原则。
1. 准备
- 配制含EDTA的1×PBS溶液。向500 mL的1×PBS中加入500 μL的0.5 M EDTA储备液，终浓度为0.5 mM EDTA。
- 准备HAEC培养基。取450 mL高糖DMEM，加入5 mL丙酮酸钠（100 mM）、50 mL适用于干细胞的热灭活胎牛血清、5 mL非必需氨基酸（100×）、5 mL抗生素-抗真菌剂（100×）、5 mL L-谷氨酰胺（200 mM）和500 μL巯基乙醇（1,000×）。
- 对用于运输和处理组织的容器进行灭菌：带盖的不锈钢容器，用于将完整胎盘从手术室运送至实验室；托盘（20 cm × 30 cm × 8 cm），用于在分离羊膜前清洗胎盘并去除血液；塑料砧板，用于将羊膜分离为三个区域。
- 对手术器械（手术刀、剪刀、镊子和止血钳）、500 mL烧杯、棉质纱布和生理盐水进行灭菌。
2. 获取胎盘组织
注意：羊膜取自足月妊娠（37−40 周）因剖宫产指征接受手术且无任何临产迹象、无微生物学感染证据的女性。完整的分离与培养....
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结果
从羊膜的三个解剖区域分别分离出人羊膜上皮细胞（HAEC），并在体外分别进行培养。培养48小时后，具有上皮表型的细胞已贴附于培养板表面，尽管培养基中仍含有细胞碎片和悬浮细胞，这些杂质在更换培养基时被去除（图3）。
在原代培养（第零代，P0）的处理过程中，可能会出现一些干扰实验数据分析的问题（图4）：若在试剂污染或分离过程中发现细菌污染，建议弃去该培养物并重新处理另一张膜（图4A）；因膜洗涤不充分导致红细胞过多（图4B）；细胞贴壁不良或完全不贴壁（图4C）；或细胞呈现成纤维细胞形态（图4D），提示可能分离到的是人羊膜间充质细胞（HAMC）而非人羊膜上皮细胞（HAEC）。
人羊膜.......
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讨论
我们建立了一种从足月胎膜中分离人羊膜上皮细胞（HAEC）的新方案。与以往报道不同的是，在分离前先将每份胎膜按其三个解剖区域进行分割，以便分别分析各区域来源的细胞。
该实验方案中最关键的步骤之一是清洗膜以彻底去除所有血凝块，因为血凝块可能在分离上皮细胞时干扰胰蛋白酶的活性。若此步骤操作不当，可能导致获得的原代培养物中含有大量红细胞而贴壁的上皮细胞数量稀少。若在细胞接种后的最初24−48小时内未观察到细胞贴壁，建议弃去该培养物。另一个关键环节是酶消化的孵育时间。若孵育时间过长，细胞活力可能下降，或获得呈现间充质样而非上皮样形态的细胞培养物（图4）。此外，若膜的消化过程中未进行适当的振荡，每片膜获得的细胞数量偏低的概率将增加。
在本实验方案中，我们可以在体外培养人羊膜上皮细胞（HAEC），同时保持其上皮表型，这通过大多数细胞在连续传代过程中表达特异性上皮细胞标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）得以证实（图6）.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究获得了墨西哥国家围产期研究所（21041 和 21081）以及 CONACYT（A1-S-8450 和 252756）基金的资助。我们感谢 Jessica González Norris 和 Lidia Yuriria Paredes Vivas 提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 培养试剂 | |||
| 2-巯基乙醇 | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21985023 | 55 mM |
| 无动物源性重组人表皮生长因子（EGF） | Peprotech | AF-100-15 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| 杜氏改良伊格尔培养基（DMEM） | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 12430054 | 添加高糖和HEPES |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9260G | 0.5 M |
| 胚胎干细胞专用胎牛血清（FBS），已鉴定 | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10439024 | |
| 非必需氨基酸 | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11140050 | 100X |
| 多聚甲醛 | 任意品牌 | ||
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| 生理盐水溶液（0.9% 氯化钠） | 任意品牌 | ||
| 丙酮酸钠 | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11360070 | 100 mM |
| 0.05% 胰蛋白酶/EDTA | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 25300054 | |
| 一次性耗材 | |||
| 100 µm 细胞筛 | Corning/Falcon | 352360 | |
| 100 mm 经组织培养处理的培养皿 | Corning | 430167 | |
| 24孔透明组织培养处理多孔板 | Corning/Costar | 3526 | |
| 6孔透明组织培养处理多孔板 | Corning/Costar | 3516 | |
| 无热原无菌离心管 | 任意品牌 | 带锥形底部 | |
| 1,000 µl、200 µl 和 10 µl 无热原无菌吸头 | |||
| 无菌棉纱布 | |||
| 5 mL、10 mL 和 25 mL 无菌移液管 | 任意品牌 | ||
| 无菌外科手套 | 任意品牌 | ||
| 设备 | |||
| 生物安全柜 | |||
| 离心机 | |||
| 微量移液器 | |||
| 电动移液器填充/分配装置 | |||
| 500 mL 无菌烧杯 | |||
| 无菌塑料切板 | |||
| 无菌手术刀、剪刀、镊子、夹子 | |||
| 无菌不锈钢容器 | |||
| 无菌托盘 | |||
| 试管旋转仪 | MaCSmix | ||
| 抗体与试剂盒 | 抗体编号 | ||
| 抗E-钙黏蛋白抗体 | BD Biosciences | 610181 | RRID:AB_3975 |
| 抗KI67抗体 | Santa Cruz | 23900 | RRID:AB_627859 |
| 抗NANOG抗体 | Peprotech | 500-P236 | RRID:AB_1268274 |
| 抗OCT4抗体 | Abcam | ab19857 | RRID:AB_44517 |
| 抗SOX2抗体 | Millipore | AB5603 | RRID:AB_2286686 |
| 抗SSEA-4抗体 | Cell Signaling | 4755 | RRID:AB_1264259 |
| 抗TRA-1-60抗体 | Cell Signaling | 4746 | RRID:AB_10563566 |
| 山羊抗小鼠Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| 山羊抗兔Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| TUNEL检测试剂盒 | Abcam | 66110 |
参考文献
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
- Garcia-Lopez, G., et al. Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem c....
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重印与许可
