本方案提供了一种易于操作的方法，用于培养来自海参Apostichopus japonicus的肠细胞，并且适用于多种海洋生物组织样本，包括棘皮动物门、软体动物门和甲壳动物门。
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本文内容
摘要
摘要
原代培养细胞作为评估生物物质功能或表征特定生物活性的重要工具，被广泛应用于多种科学研究领域。然而，由于缺乏普适性的细胞培养基和标准化的培养方案，目前针对海洋生物的细胞培养方法仍较为有限。同时，海洋无脊椎动物细胞常出现的微生物污染问题及其多向分化特性，进一步阻碍了海洋无脊椎动物有效细胞培养策略的建立。本文介绍了一种易于操作的海参Apostichopus japonicus肠道细胞的培养方法，并提供了原代培养肠道细胞体外诱导与检测凋亡的实例。此外，本实验详细说明了适宜的培养基配方和细胞收集方法。该方案适用于多种常见海洋生物组织样本，包括棘皮动物门、软体动物门和甲壳动物亚门，可为多种体外实验应用提供足量细胞。该技术将有助于研究人员高效地操控海洋无脊椎动物原代细胞，进而促进对靶向生物材料在细胞水平上的功能评估。
引言
在人工控制条件下而非自然环境中培养细胞，可为生物学研究提供均一的实验材料，尤其适用于难以在实验室环境中培养的物种。海洋无脊椎动物占所有动物物种的30%以上1，并为研究特定生物学过程（如再生2,3、应激反应4和环境适应5,6）的调控机制提供了丰富的生物材料。
海参Apostichopus japonicus 是北太平洋沿岸温带水域中研究最为广泛的棘皮动物物种之一。该物种是重要的经济物种，在东亚地区，尤其是中国，已实现大规模海水养殖7。关于A. japonicus 的众多科学问题，包括自溶后肠道再生的调控机制8、夏眠过程中的退化机制9、代谢调控10,11，以及在热应激或病原体胁迫条件下的免疫应答12,
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方案
1. 细胞培养基制备
- 体腔液制备
- 体腔液采集：在无菌条件下解剖一只健康的海参（湿重85–105 g），收集体腔液，并将其储存在无菌玻璃瓶中。
- 体腔细胞去除：将体腔液分装至50 mL离心管中，在1,700 × g 条件下离心5分钟，将上清液转移至新的无菌玻璃瓶中；随后获得无细胞的海参体腔液。
- 补体成分灭活：将含有海参体腔液的无菌玻璃瓶置于40–50 °C水浴中孵育20–40分钟，以获得补体成分灭活的体腔液。
- 微生物去除：通过0.22 μm膜过滤器过滤去除细菌和衣原体；接着使用0.1 μm膜过滤器过滤以去除支原体及其他微小颗粒，从而获得体腔液预处理液。
- 盐度调节：通过添加20%高浓度预灭菌过滤NaCl溶液（用预处理体腔液稀释）或双蒸水（DDW），将体腔液预处理液的盐度调节至30‰（用盐度计测定）。将海参体腔液转移至无菌瓶中，密封后于4 °C保存，用于后续实验。
- Leibovitz's L-15细胞培养基优化
- 称取5.05 g NaCl、0.135 g KCl、0.15 g CaC....
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结果
本研究建立了A. japonicus的原代肠细胞培养体系并进行了细胞传代。图1展示了培养不同阶段的圆形细胞。EdU染色实验提供了直接证据，表明这些圆形细胞在培养后期具有增殖活性（图2）。我们还对实验方案进行了微调，改为培养剪碎的组织块而非过滤后的细胞；此外，成功培养出一种纺锤形细胞。该细胞类型出现在肠组织块周围，培养四天后即可观察到；然而，此类细胞未能成功传代（图3）。
培养的细胞可用于不同的生物学实验应用。我们用DXMS处理细胞不同时间，随后用Hoechst 33258染色检测凋亡细胞。图4显示了通过Hoechst 33258染色和荧光显微镜检测到的海参肠细胞中诱导产生的凋亡信号。图5展示了在DXMS刺激下，指定时间段内的细胞凋亡率。
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讨论
近几十年来，人们投入了大量研究努力以建立细胞系，然而，海洋无脊椎动物细胞的长期培养仍然难以取得进展14,22。已有报道称，来自再生海参组织的培养细胞可长期存活，并可在特定细胞中检测到较高的增殖活性17,23。然而，对于正常的海洋无脊椎动物细胞，目前尚未见任何实用的细胞培养方法被报道。本文所介绍的方案为来自海洋无脊椎动物物种 A. japonicus 的肠细胞的培养与传代提供了一种高效且易于理解的方法。该方法可轻松适用于多种不同海洋无脊椎动物（如乌贼和螃蟹）的原代细胞培养。
一系列关键因素影响着该实验方法的成功应用。在整个操作过程中，尤其是培养的第一周，防止微生物污染至关重要。水生动物通常会接触来自环境中的多种微生物，这些微生物会定植于其组织中，如鳃、肠道、鳍和皮肤。因此，在细胞培养开始前对组织样本进行彻底灭菌是不可行的。为了最大限度.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢浙江大学周乃明教授提供的技术指导及其实验室设备的使用许可。本工作受到国家自然科学基金（项目编号 41876154、41606150 和 41406137）以及浙江省高校和科研院所基本科研业务费专项资金［项目编号 2019JZ00007］的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.1 μm 滤膜 | Millipore | SLVV033RS | |
| 0.22 μm 滤膜 | Millipore | SLGP033RB | |
| 0.25% 胰蛋白酶 | Genom | GNM25200 | |
| 100 μm 滤膜 | Falcon | 352360 | |
| 4 cm 培养皿 | ExCell Bio | CS016-0124 | |
| 4% 多聚甲醛溶液 | 国药集团化学试剂 | 80096618 | 溶于 PBS |
| 台式离心机 | Beckman | Allegra X-30R | |
| BeyoClick EdU-488 试剂盒 | 碧云天 | C0071S | |
| CaCl2 | 国药集团化学试剂 | 10005817 | |
| 恒温培养箱 | Lucky Riptile | HN-3 | |
| 地塞米松 | 国药集团化学试剂 | XW00500221 | |
| 电热恒温水浴锅 | senxin17 | DK-S28 | |
| 乙醇 | 国药集团化学试剂 | 80176961 | 75% |
| 成纤维细胞生长因子（FGF） | PEPROTECH | 100-18B | |
| 荧光显微镜 | Leica DMI3000B | DMI3000B | |
| 加雷霉素 | 国药集团化学试剂 | XW14054101 | |
| 葡萄糖 | 国药集团化学试剂 | 63005518 | |
| Hoechst33258 染色液 | 碧云天 | C1017 | |
| 胰岛素 | 国药集团化学试剂 | XW1106168001 | |
| 胰岛素样生长因子（IGF） | PEPROTECH | 100-11 | |
| KCl | 国药集团化学试剂 | 10016308 | |
| Leibovitz's L-15 培养基 | Genom | GNM41300 | |
| L-谷氨酰胺（100 mg/mL） | Genom | GNM-21051 | |
| MgCl2 | 国药集团化学试剂 | XW77863031 | |
| Na2SO4 | 国药集团化学试剂 | 10020518 | |
| NaCl | 国药集团化学试剂 | 10019308 | |
| NaOH | 国药集团化学试剂 | 10019718 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | pH 7.2–7.4 |
| 青霉素-链霉素 | Genom | GNM15140 | |
| pH 计 | Bante | A120 | |
| 牛磺酸 | SIGMA | T0625 | |
| VE | Seebio | 185791 |
参考文献
- Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens. Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).
- Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G.
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重印与许可
