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方法文章

微型藻类在小型光生物反应器中利用腐蚀性烟道气的培养及生物量定量

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⸱

DOI：

10.3791/60566

⸱

2019年12月19日

 ,  , 
1Department of Civil and Environmental Engineering, University of Iowa

本文内容

摘要

在小试规模下进行无菌培养，有助于在后续工艺放大之前对微藻进行表征并优化其生产效率。光生物反应器可提供必要的控制条件，以确保微藻实验的可靠性与可重复性，并可改造用于安全培养利用城市或工业燃烧排放的腐蚀性气体（CO2、SO2、NO2）作为营养源的微藻。

摘要

光生物反应器是一种用于光合微生物实验的光照培养系统。该系统可为微藻培养提供无菌环境，并实现对温度、pH、气体组成及流速的控制。在实验室规模下，光生物反应器有利于研究人员研究微藻的特性、生产率及生长优化；在工业规模下，光生物反应器可维持产物纯度并提高生产效率。本视频介绍了实验室规模光生物反应器用于微藻培养的准备与使用方法，包括腐蚀性气体输入的安全操作，以及相关的生物量测量和生物量生产率计算。具体而言，视频展示了微藻培养物的保存与接种前准备、光生物反应器的组装与灭菌、生物量浓度测定，以及包含最大和总体生物量生产率计算的微藻生物量生产率逻辑模型。此外，鉴于目前对利用模拟或真实废气排放进行微藻培养实验的兴趣日益增加，视频还将介绍为处理腐蚀性气体所需对光生物反应器设备进行的改造，并讨论此类情况下的安全取样方法。

引言

光生物反应器可用于受控实验，并培养出比开放池更纯净的微藻产品。在实验室规模的光生物反应器中培养微藻有助于建立基础科学知识，为后续工艺放大提供依据。环境条件的微小变化可能显著影响微生物实验结果并导致数据混淆1。采用无菌操作并控制温度、pH值和气体鼓泡的系统，有利于在不同条件下研究微藻的特性与性能。此外，通过精确调控进气浓度、温度、混合产生的剪切力以及培养基pH值，可支持多种难以培养的微藻物种生长。光生物反应器可采用连续供气和鼓泡的分批培养模式运行，也可采用连续流加式恒化器系统，后者除连续供气和鼓泡外，还包含进水和出水中的废水营养物质输入。本文将演示采用连续供气和鼓泡的分批培养过程。

光生物反应器的使用解决了微藻培养与生产中的多项挑战。该领域普遍面临其他微生物污染、底物利用效率（特别是在 CO2 减排或废水处理情况下尤为关键）2、pH 控制、光照变化性以及生物量生产力3 等问题。光生物反应器使研究人员能够在高度受控的分批系统中研究多种光合生物，其中即使生长缓慢的物种也能免受捕食者或竞争性微生物的侵害4。这些分批系统作为封闭系统，更易于与供给气体达到平衡，因而更有利于实现更高的 CO2 利用率和生物量生产力。光生物反应器技术还提供 pH 控制功能，而缺乏该功能曾是以往研究中限制高生物量生产力的主要因素5。在实验室规模下，光生物反应器所提供的控制水平对研究人员具有显著优势。在更大的工业规模下，光生物反应器可用于维持商业生物产品的纯度，并提升营养品、化妆品、食品或饲料应用中的生产效率6。

微藻因其能够快速将CO2固定为生物质碳，在CO2生物封存方面备受关注。然而，大多数人为来源的CO2通常含有其他腐蚀性和有毒气体或污染物（如NOx、SOx、CO、Hg），具体成分取决于燃烧过程所使用的燃料类型。随着对可持续CO2封存技术的兴趣日益增长，已推动了光生物反应器技术的发展，用于处理富含CO2的排放气体，例如燃煤电厂产生的废气（表1）。然而，在研究和放大过程中，存在人类和环境暴露于这些腐蚀性和有毒污染物的固有风险。因此，描述使用腐蚀性气体时生物反应器的安全组装与操作方法是必要且具有指导意义的。

本方法用于在严格控制的实验条件下，利用2 L台式光生物反应器培养微藻。该方案描述了微藻的保藏、接种物制备以及光生物反应器的安装与灭菌过程。除基本操作外，本文还介绍了微藻生物量的测定方法、生物量生产力的计算，以及对设备进行改造以适应使用腐蚀性气体进行微藻培养的实验需求。下述方案适用于希望加强对实验条件控制、优化微藻生长参数，或进行多种光合微生物无菌培养的研究人员。本方法未涉及适用于培养产气或消耗可燃气体（如CH4、H2等）微生物的合适材料7。

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方案

1. 腐蚀性气体鼓泡的光生物反应器的安全使用与取样

注意：本方法未描述对产生或消耗高度易燃气体的微藻培养物进行安全取样的适当操作流程。

  1. 将有毒气体作为危害人类健康的风险进行管理。
    注意：根据爱荷华大学化学卫生计划，作者与大学消防安全协调员及大学环境健康部门合作 & 安全与工业卫生官员共同制定有毒气体操作的安全规程。
  2. 设置有毒气体监测系统，为每种正在使用的有毒气体配备相应的传感器。根据制造商说明校准传感器。按照制造商说明，定期使用校准气体进行快速功能测试（检查传感器和报警功能）。将气体监测仪置于通风柜外侧附近。
  3. 在开始任何腐蚀性气体实验之前，应告知周围人员相关风险和警报系统，并通知当地 appropriate 应急响应人员。在实验室入口处张贴标示，注明正在使用的危险气体种类。
    1. 一旦检测到有毒气体，立即指示附近所有人员撤离。通知实验室主管和应急响应人员。
      注意：在断电情况下，气体调节塔会因断电而停止气体流动。然而，若未发生断电，但房间的供暖、通风与空调（HVAC）系统或通风柜停止运行，则可能导致有毒气体泄漏。
  4. 使用美国工业卫生协会（AIHA）的数学建模电子表格 IH MOD，模拟通风橱失效时室内有毒气体可能累积的浓度8 每种气体。
    1. 获取房间的送风/排风风量， Q，单位为 m3 分钟-1 由建筑暖通空调维护人员或暖通空调技术人员计算体积， V实验室的尺寸（长 x 宽 x 高），单位为 m3. 计算污染物排放速率， G每种有毒气体的毫克·分钟（mg·min）-1，使用根据理想气体定律调整的公式1：
      figure-protocol-1 (1)
      其中 P 是在1 atm下有毒气体所施加压力的分数（ppm气体/106 ppm), Q气体 气体流速，单位为 L/min-1, R 是通用气体常数（0.082057 L·atm·mol-1·K-1), T 为开尔文温度，且 MW 是气体的分子量，单位为 g/mol-1.
    2. 使用以下数值 V, Q，以及 G 针对“具有停止生成并模拟房间净化功能的均匀混合房间模型”算法（IH MOD 电子表格中）的每种气体（在步骤 1.4.1 中计算得出），计算在 1440 分钟（24 小时）模拟期间内各气体在房间中的累积浓度。将这些数值与暴露限值进行比较表2)9.

2. 微藻接种物的制备

  1. 在实验开始前，将保存的Scenedesmus obliquus接种物或其他选定用于光生物反应器的微藻物种进行活化。
    1. 向一个无菌（150−250 mL）锥形瓶中加入30−50 mL无菌微藻培养基（三倍氮Bold基础培养基[3N-BBM]，表3），并用泡沫塞封口。
      注意：除非对锥形瓶进行通气，否则液体培养基体积应仅占锥形瓶总体积的五分之一。
    2. 在将细胞转移至斜面或摇瓶时，使用生物安全柜以维持无菌环境。对于琼脂培养物，使用无菌接种环将微藻从琼脂平板或斜面转移至摇瓶。对于冷冻保存的培养物，根据所选方案逐步解冻冷冻样品，并洗去冷冻保护剂10，然后将细胞加入摇瓶中。
    3. 在20−25 °C、16 h:8 h光暗周期条件下，以115−130 rpm振荡培养细胞于3N-BBM培养基中。
    4. 通过光密度（OD）测量（如第5和第6节所述）监测微藻随时间的生长情况。在将细胞转移至光生物反应器前，需等待微藻进入指数生长期（通常为2−4天）。
      注意：根据实验目的，可在接种反应器前对细胞进行培养基清洗（本研究采用）和/或通过多次离心步骤进行浓缩。

3. 光生物反应器的设置与操作

  1. 使用光生物反应器（图1）控制温度、pH、搅拌速率、气体流速和输入溶液流速。
    注意：光生物反应器最多可控制四种不同输入溶液的流速，通常为酸液、碱液、消泡剂和底物。
    1. 分别配制100 mL的1 N NaOH和1 N HCl，并将其加入250 mL的输入溶液瓶中。这些溶液需使用二次 containment 容器。
    2. 将定量输入溶液储存于带有浸入管和通气管（配备无菌在线空气过滤器）的可高压灭菌带盖瓶中。使用可高压灭菌的管路将浸入管连接至光生物反应器的四个输入端口，并在光生物反应器运行期间将浸入管浸没于输入溶液中。将内径为1.6 mm的可高压灭菌管路穿过各个输入溶液与其端口之间的蠕动泵，这些泵可通过手动设定流速或根据pH及泡沫水平探头的反馈信号进行控制（适用于酸液、碱液和消泡剂溶液）。
  2. 在高压灭菌前校准光生物反应器的pH计。
    1. 将pH探头插入光生物反应器控制塔的连接管线中并旋转锁定。使用pH 4和pH 7的标准缓冲液校准pH计。在确认pH计读数前，需等待数值稳定。
    2. 断开连接探头与控制塔之间的pH计导线。
    3. 使用70%乙醇对探头表面进行消毒，或与反应器一同进行高压灭菌。若选择高压灭菌，请用铝箔紧密包裹pH探头。
      注意：若对探头进行高压灭菌，存在因蒸汽导致探头内部腐蚀的风险。此封包方法不能完全保证避免损坏。
    4. 向培养基中添加10 mM 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）缓冲液，以更好地控制pH。
  3. 将冷指管和排气冷凝器插入光生物反应器顶板并旋紧固定。
  4. 插入接种口并旋紧固定。在光生物反应器顶板上方的接种口部分连接一段可高压灭菌的管路。在对生物反应器进行高压灭菌前，使用可高压灭菌的管夹将该管路夹闭。
  5. 对任何未使用的光生物反应器端口，连接带有无菌过滤器的管路。
  6. 通过可高压灭菌的管路将酸液和碱液输入溶液连接至光生物反应器的输入端口。加入1.5 L培养基。
  7. 根据工作体积，在121 °C条件下对反应器及相关输入溶液进行30−45分钟的高压灭菌。
    注意：如果培养基成分因高压灭菌而受损，可在高压灭菌后于超净工作台内无菌条件下添加培养基。本方案在此处可暂停。
    警告：从高压灭菌器取出后，反应器温度较高。
  8. 将搅拌桨电机连接至搅拌轴，并拧紧连接件。
  9. 根据光照需求，将LED光源面板对称布置在生物反应器外部。
    1. 在高压灭菌前，使用光度计测量并记录光照强度。将照度传感器置于光生物反应器容器内部，并使传感器朝向光源。
  10. 连接最多两个气体钢瓶，向光生物反应器中的微藻提供模拟燃煤电厂排放气体（表1）。
    注意：本研究中使用的气体浓度近似于爱荷华大学电厂的排放水平。
    1. 组装气体钢瓶、气体调节塔与光生物反应器鼓泡环之间的连接。为气体钢瓶配备可输出20 psi压力的适当减压阀。将内径为6 mm的耐压管路连接至减压阀出口接头，并用管夹固定。将耐压管路另一端通过带管夹的快速接头（由接头转6 mm接杆）连接至气体调节塔的气体入口。使用另一个6 mm快速接头将内径为3.2 mm的管路连接至气体调节塔的气体出口，并将出口管路的另一端连接至光生物反应器顶板上的鼓泡环端口。
      注意：若需引入第二种输入气体，请重复步骤3.9.1，但使用T型管接头将两条输入气体管路合并为一条，再连接至鼓泡环端口。
    2. 将每个气体减压阀的出口压力设为20 psi，并通过生物反应器界面设定实验所需的气体流速。
      注意：应计算并报告标准条件下每分钟每单位液体体积的气体体积（vvm）；即用体积气体流速除以培养液体积。单位为每分钟­­­。
  11. 当使用多个气体钢瓶进行鼓泡时，需使用CO2传感器确认供给光生物反应器的CO2浓度。
    1. 将兼容软件（例如GasLab）的CO2传感器连接至计算机的USB端口。下载与该CO2传感器型号匹配的最新软件。打开软件，输入传感器型号、测量时间间隔以及数据记录持续时间。
    2. 将CO2传感器和混合气体流管（在连接至生物反应器之前）置于一个100−250 mL、带盖且通气的容器中（位于生物反应器外部）。
      注意：实验过程中，可从光生物反应器顶板上的一个排气管处测量顶空中的CO2浓度。
    3. 在用户界面上启动CO2浓度测量，并等待测量值达到平衡。
    4. 通过光生物反应器用户界面调节各气罐的气体流速，直至达到目标总流速（0.1 L min-1）和CO2浓度（12%）。
  12. 在光生物反应器用户界面上，使用STIRR功能设定搅拌桨的旋转速率。确保混合速率足够快，以使培养基充分吸收鼓泡气体。
    注意：某些微藻种类细胞结构较弱，可能因高剪切力而受损或破裂。

4. 用于有毒气体的光生物反应器及实验装置的调整

警告：真实或模拟烟气中的腐蚀性气体具有腐蚀性和毒性，吸入后可能造成严重危害。
注意：本方法未描述用于安全培养产生或消耗易燃气体（如甲烷、氢气等）的微生物的合适材料。

  1. 将黄铜、塑料和标准管路组件替换为耐腐蚀材料。
    1. 使用不锈钢以可靠抵抗NOx或SOx与水反应生成的强酸所引起的腐蚀。将气体调节塔的气体进出口处的塑料快接接头替换为不锈钢快接接头。用于气瓶的减压阀（包括出口软管接头）应采用不锈钢材质，而非黄铜。
    2. 在气瓶与气体调节塔之间以及气体调节塔与光生物反应器之间的连接管路中，分别使用聚四氟乙烯（PTFE）或天然乙烯-醋酸乙烯酯（EVA）管路，以抵抗NOx和SOx气体的腐蚀。
  2. 高压灭菌后，在步入式通风橱内组装光生物反应器和气体钢瓶。将光生物反应器放置在二级 containment 内的台面上，并将气体钢瓶置于独立的钢瓶护套或钢瓶架中。
  3. 启动气体流动后，使用气泡型液体检漏剂检查气体钢瓶与生物反应器之间所有连接处是否存在气体泄漏。使用装有1:100（v:v）洗洁精:水稀释液的洗瓶，将少量皂液流覆盖连接部位。
    注意：泄漏处将出现气泡。
  4. 启动微藻实验时，先开始通气，然后在接种前调节pH值（与标准光生物反应器实验相同）。
    注意：由于输入气体具有强酸性，强烈建议在腐蚀性气体实验期间对培养基进行缓冲处理。
  5. 通过将制备好的微藻接种物吸入无菌注射器，将注射器连接至接种口的管路上，打开接种管路夹，推动注射器活塞，完成光生物反应器的接种。
  6. 每天两次（并在取样前）检查气体监测仪、气体钢瓶压力和光生物反应器，以确认是否有毒气体浓度升高或泄漏迹象。
  7. 限制通风橱窗扇的开启宽度，使其仅允许操作人员触及生物反应器和气体钢瓶减压阀。为避免吸入暴露风险，确保开启范围不会使人员胸部以上部位暴露于气流中。
  8. 将气体钢瓶减压阀调至关闭位置，停止向反应器供气。关闭通风橱窗扇，并等待5分钟，使通风橱排出腐蚀性气体后，再对光生物反应器培养物进行取样。
  9. 在通风橱内进行取样，可通过打开顶板端口并使用无菌刻度移液管，或通过接种/取样端口将培养液吸入注射器的方式完成。在重新打开气体钢瓶并恢复实验前，应确保光生物反应器各端口已密封牢固。

5. 测量微藻生物量生产力

  1. 使用标准曲线将微藻培养物的 OD750 测定值与干燥微藻生物量浓度相关联。
    1. 准备多个（最少 4 个，每个最小工作体积：500 mL）含有无菌微藻培养基的锥形瓶，并接种目标微藻物种（例如，本研究中使用 S. obliquus）。
    2. 测定培养物的 OD750，直至其进入指数生长期，随后立即对锥形瓶进行终末取样：取已知体积（至少 100 mL）的培养液，用已知质量的 0.45 μm 滤膜进行过滤。使用带盖的铝制称量舟或玻璃容器承载过滤后的生物量和滤膜，以便后续干燥。
    3. 将滤膜与生物量在 80−100 °C 的烘箱中干燥约 18−24 小时后称重。为确认干燥完全，再额外干燥 2−3 小时后再次称重，以判断质量是否已稳定。
    4. 从干燥后生物量与滤膜的总质量中减去滤膜的初始质量，计算出生物量的净质量。
    5. 以测得的 OD750 为横坐标，生物量浓度（生物量质量除以过滤培养液体积）为纵坐标绘制标准曲线，并通过线性回归拟合数据。

6. 生物质产量建模与速率计算

  1. 根据第5节中确定的校准曲线线性回归，利用OD750测量值计算实验生物量浓度。
  2. 在图形与统计软件（材料表）中，使用逻辑回归（方程2）对微藻批次培养从延滞期到指数期再到稳定期的生长数据进行拟合：
    figure-protocol-2 （2）
    其中，L 为曲线的最大生物量浓度值，k 为指数期的相对陡度（时间-1），xo 为S形曲线中点对应的时间，x 为时间。
    1. 手动输入上述逻辑方程。在软件的分析选项卡中选择使用非线性回归拟合曲线。在参数：非线性回归对话框左侧的新建下拉菜单中选择创建新方程。选择默认的显式方程作为方程类型，为新函数命名，并将该函数定义为 Y = L/(1+ exp(-k*(x-b)))，其中 b 代表 xo。
  3. 通过将最终与初始生物量浓度之差除以最终与初始时间之差，计算微藻批次培养的总生物量生产力。
  4. 通过对方程2（方程3）求导，并在S形曲线中点（即当 x = xo 时）计算其值，获得微藻批次培养的最大生物量生产力。
    figure-protocol-3 （3）

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结果

以对数生长期收获的绿色微藻S. obliquus建立OD750与干重生物量浓度之间的标准曲线（图2）。线性回归的R2值为0.9996。

从保存在冷藏琼脂平板上的藻种开始，在250 mL锥形瓶中接种 S. obliquus 培养物。将微藻接种于3N-BBM培养基中，添加10 mM HEPES缓冲液，并在2 L光生物反应器（工作体积1.5 L，通气速率0.07 vvm）中通入2.2% CO2 进行培养（图1）。通过OD750监测分批培养过程；根据标准曲线计算生物量浓度，并采用逻辑斯蒂（logistic）模型进行拟合（图3）。光生物反应器将培养条件控制在pH 6.8，总气体流速100 cm3 min-1，持续光照强度280 μmol m...

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讨论

通过控制pH、温度、气体流速和气体浓度，进行批次式无菌光生物反应器实验，可消除非目标藻株污染及培养条件的变异性，从而获得有意义的结果。即使存在具有腐蚀性的气体（如作为营养源的CO2、SO2、NO2），也能准确获取纯培养的生长动力学数据，将废气转化为动物饲料等有价值的产品。

在开始任何微藻实验之前，应从保藏状态取出选定的微藻培养物，并重新适应液体培养环境。将微藻培养至指数生长期，有助于确保实验具备相同的初始条件，并避免接种后微藻停滞于延滞期。

光密度与生物量浓度之间的校准曲线在生物量生产力研究中尤为重要。高微藻生物量生产力是微藻产业的关键目标之一，因此常被用作衡量研究成功与否的指标12。因此，基于光密度测量值对生物量浓度进行准确计算，必须依赖于针对特定物种、精确且准确的校准曲线数据。为避免潜在的光学干扰，校准曲线的测量以及实验过程中的测量应在相同的背景溶液中进行。此外，校准曲线应基于实验中最具代表性的生长阶段的微藻测...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本材料基于美国国家科学基金会研究生研究奖学金（资助号：1546595）支持的工作。本材料中表达的任何观点、发现、结论或建议均为作者观点，不一定反映美国国家科学基金会的观点。本研究还得到了爱荷华大学研究生与专业学生政府研究基金以及爱荷华大学基金会艾伦·S·亨利捐赠基金的支持。研究在W. M. 凯克植物技术实验室进行。作者感谢爱荷华大学电厂工作人员，特别是Mark Maxwell，在模拟烟气方面提供的专业知识和资金支持。作者还要感谢Emily Moore在取样与分析方面的协助，以及Emily Greene在实验方案视频中的协助与参与。

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材料

本文使用的材料清单
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生物反应器赛多利斯斯泰迪姆2升微生物发酵用生物反应器；可高压灭菌；具备pH、温度和气体流速控制功能
碰撞测试 NO2 气体格雷格纳GAS34L-112-5MultiRAE 气体检测仪校准气体
撞击测试 O2，一氧化碳，爆炸下限气体格雷格纳GAS44ES-301AMultiRAE 气体检测仪校准气体
Bump test SO2 气体格雷格纳GAS34L-175-5MultiRAE 气体检测仪校准气体
用于一氧化氮的耐腐蚀管路2 气体SwagelokSS-XT4TA4TA4-6X系列聚四氟乙烯芯管光滑内径软管—纤维编织层与304不锈钢编织层增强
耐腐蚀SO管路2 气体QC 供应120325加筋编织天然EVA管 - 1/4" ID
cozIR 100% CO2 米Gas Sensing Solutions Ltd.CM-0121 在 CO2meter.comCO2 浓度计（测量范围高达 100%）
cozIR 20% CO2 米Gas Sensing Solutions Ltd.CM-0123 在 CO2meter.com用于测量最高20%浓度的CO2检测仪
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气体钢瓶普莱克斯超纯零级空气、高纯度CO2或定制气体组分根据研究目标而定
气体监测与泄漏检测系统霍尼韦尔 RAE SystemsMAB3000235E020可检测 O2、SO2、NO2、CO 和 LEL 的泵吸式检测仪
GasLab 软件GasLabv2.0.8.14CO2 测量仪的软件与数据记录
软管接头格雷格纳货号 # 3DTN3用于将调节器连接至管路，不锈钢材质可耐受氮氧化物（NOx）和硫氧化物（SOx）的腐蚀
K30 1% 二氧化碳检测仪SenseairCM-0024 在 CO2meter.com用于测量低于1%浓度的CO2检测仪
LED 植物生长面板RoleadroHY-MD-D169-S红色 &和蓝色LED灯板
梅默森斯溶解氧探头Endress+HauserCOS22D-19M6/0可高温灭菌（需谨慎操作）的生物反应器溶解氧探头
Memosens pH 探头Endress+HauserCPS71D-7TB41可高压灭菌（需谨慎操作）的生物反应器pH探针
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茎式软管接头SwagelokSS-4-HC-A-6MTA不锈钢软管接头，6 mm 管适配器，1/4 英寸软管内径
管路，稀酸/碱转移Allied Electronics and Automation6678441硅胶TP工艺管；内径1.6 mm；长度3000 mm；食品级
导管，气体转移Allied Electronics and Automation6678444硅胶TP工艺管；内径3.2 mm；长3000 mm；食品级

参考文献

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