具有腐蚀性烟气的台式光生物反应器中的微藻培养和生物量定量

Summary

台式轴栽培有助于在后续工艺扩展之前实现微藻特性和生产力优化。光生物反应器为可靠和可重复的微藻实验提供必要的控制，并可适应从市政或工业燃烧排放中安全培育具有腐蚀性气体_{（CO2、SO2、NO2）}的微藻。

Abstract

光生物反应器是用于光营养微生物实验的照明培养系统。这些系统为微藻种植提供了无菌环境，包括温度、pH、气体成分和流速控制。在台面尺度上，光生物反应器有利于研究人员研究微藻特性、生产力和生长优化。在工业规模上，光生物反应器可以保持产品纯度，提高生产效率。该视频描述了用于微藻种植的台式光生物反应器的制备和使用，包括腐蚀性气体输入的安全使用，并详细介绍了相关的生物量测量和生物量生产率计算。具体来说，该视频演示了微藻培养物的储存和接种准备、光生物反应器组装和灭菌、生物量浓度测量以及具有速率的微藻生物生产力的物流模型计算，包括最大和总体生物量产品量。此外，由于人们越来越有兴趣使用模拟或真实废气排放来培育微藻，视频将介绍光生物反应器设备适应处理腐蚀性气体所需的情况，并讨论安全取样。这种情况。

Introduction

光生物反应器可用于控制实验和培育比开放池塘更纯净的微藻产品。台式光生物反应器的微藻种植支持发展可用于过程扩大的基本知识。环境条件的轻微变化可以显著改变微生物实验，使结果混淆^1。具有温度、pH 和气体分离控制的无菌过程有利于研究不同条件下的微藻特性和性能。此外，对输入气体浓度、温度、混合剪切力和中等pH的控制可以支持其他难以培育的多种物种。光生物反应器可作为具有连续气体进给和压用的批处理过程运行，或作为具有连续气体进给和压载以及进水废水营养输入的切mostat流通系统运行。在这里，我们演示了连续气体进给和分离的批处理过程。

光生物反应器的使用解决了一些微藻种植和生产难题。该油田一般会与其他微生物的污染、高效基材利用（在_CO2缓解或废水处理中尤为重要^）2、pH控制、照明可变性和生物量生产率³作斗争。光生物反应器使研究人员能够研究严格控制的批量系统中的各种光动体，即使生长缓慢的物种也受到保护，免受掠食者或相互竞争的微生物^的侵害。这些批量系统还更有利于提高_CO2利用率和生物量生产率，因为它们是封闭的系统，更有可能与供应的气体保持平衡。光生物反应器技术也提供pH控制，缺乏它阻碍了高生物量生产力在过去的研究^5。在台面尺度上，光生物反应器提供的控制水平对研究人员有利。在较大的工业规模下，光生物反应器可用于保持商业生物产品的纯度，并提高营养、化妆品、食品或饲料应用的生产效率⁶。

微藻对_CO2的生物封存非常感兴趣，因为它们能迅速将_CO2固定为生物质碳。然而，大多数人为的_CO2来源被其他腐蚀性和有毒气体或污染物（NO_x，SOx，CO，Hg）污染，这取决于燃烧过程的燃料来源。对可持续_CO2封存的兴趣日益浓厚，促使光生物反应器技术的发展，以_{处理二氧化碳}富集的排放，如燃煤发电厂的排放（表1）。不幸的是，在研究和放大过程中，存在人类和环境接触腐蚀性和有毒污染物的固有风险。因此，使用腐蚀性气体描述生物反应器的安全组装和运行是必要和有益的。

该方法用于在严格控制的实验条件下使用2L台式光生物反应器进行微藻生长。该协议描述了微藻储存、接种制备以及光生物反应器的安装和灭菌。除了基本操作外，这项工作还描述了微藻生物量测量和生物量生产率计算，以及用于腐蚀性气体的微藻种植设备的改造。下面描述的方案适用于寻求施加更大实验控制、优化微藻生长条件或异种培养一系列光营养微生物的研究人员。该方法不描述用于培养产生或消耗易燃气体的微生物（例如CH_4、H2等）的适当材料。⁷.

Protocol

1. 使用和取样带有腐蚀性气体的光生物反应器

注:此方法没有描述对产生或消耗高度易燃气体的微藻培养物进行安全取样的适当程序。

1. 管理有毒气体，以免危害人类健康。
   注:根据爱荷华大学的化学卫生计划，作者与大学消防安全协调员和大学环境健康与安全工业卫生官员合作，制定了处理有毒气体的安全规程。
2. 建立一个有毒气体监测系统，该系统带有传感器，用于每种有毒气体。根据制造商的说明校准传感器。根据制造商说明，经常进行凹凸测试（检查传感器和报警功能，以及校准气体）。找到烟机罩外的气体监视器。
3. 在开始任何腐蚀性气体实验之前，请通知附近人员风险和报警系统。此外，还通知相应的当地应急响应人员。在实验室入口张贴告示，说明正在使用哪些有害气体。
   1. 一经发现有毒气体，指示附近所有人员撤离。通知实验室主管和应急人员。
      注:在停电时，气体调节塔在断电时将停止气体流动。但是，如果房间供暖、通风和空调 （HVAC） 系统或烟气罩在没有停电的情况下停机，则会导致有毒气体泄漏。
4. 如果美国工业卫生协会 （AIHA） 的数学建模电子表格 IH MOD⁸对每种气体进行烟雾罩故障，则对室内有毒气体的可能累积浓度进行建模。
   1. 从楼宇 HVAC 维护人员或 HVAC 技术人员处获取房间供应/排气率Q，以 m³分钟^-1的方式进行。计算实验室（L x W x H）的体积（V，以m³表示。使用根据理想气体定律改编的公式 1 计算每种有毒气体的污染物排放速率 G（mg 最小^-1）:
      (1)
      其中P是有毒气体在 1 atm （ppm 气体/10⁶ ppm） 时施加的压力的一部分，Q_气体是 L^min-1中的气体流速，R是通用气体常数 （0.082057 L_atm_mol^-1|^K-1 ），T表示 K 的温度，MW是气体的分子量在 g mol^-1中。
   2. 在 IH MOD 电子表格中的"混合室模型与停止生成和模型房间净化选项"算法中，对每种气体使用V、Q和G的值，以计算在 1440 分钟（24 小时）模拟周期内每个气体的累积室气体浓度。 将这些值与暴露限制进行比较（表 2）⁹。

2. 微藻接种的准备

1. 在实验开始之前，通过从储存中转移，无论是冷冻保存还是用琼脂介质培养，准备Scenedesmus体液接种，或其他为光生物反应器选择的微藻物种。
   1. 将30~50 mL无菌微藻生长介质（三氮Bold的基础介质[3N-BBM]，表3）添加到无菌（150~250 mL）摇瓶中，并加盖泡沫塞。
      注:除非烧瓶被烧空，否则只有五分之一的摇瓶体积应被液体介质占用。
   2. 将细胞转移到倾斜或摇动烧瓶时，使用生物安全柜保持无菌。对于琼脂上的培养物，使用无菌回路将微藻从琼脂板或斜向摇瓶转移。对于冷冻保存的培养物，逐渐解冻冷冻保存的样品，并根据所选的协议¹⁰冲洗冷冻保护剂，然后将细胞添加到摇瓶中。
   3. 在 20~25 °C 下培养 3N-BBM 的培养细胞在 16 h:8 h 光度下:黑暗，在 115–130 rpm 下摇动。
   4. 使用光学密度 （OD） 测量跟踪随时间的微藻生长（如第 5 节和第 6 节所示）。在将细胞转移到光生物反应器之前，允许微藻达到其指数生长阶段（2⁄4天）。
      注:根据实验的目标，在生物反应器接种之前，细胞可以冲洗培养基（本研究）和/或浓缩多个离心步骤。

3. 光生物反应器的设置和运行

1. 使用光生物反应器（图1）控制温度、pH、搅拌速率、气体流速和输入溶液流速。
   注:光生物反应器可用于控制多达四种不同的输入溶液的流动，通常是酸、碱、消泡剂和基板。
   1. 在 1 N NaOH 和 1 N HCl 中各制备 100 mL，并将每个添加到 250 mL 输入溶液瓶中。对这些解决方案使用辅助包含。
   2. 将计量输入溶液存放在装有浸管的可高压瓶和带无菌内联空气过滤器的排气管中。使用可高压灭菌管将浸管连接到光生物反应器的四个输入端口，并在光生物反应器操作期间将浸管浸入输入溶液中。通过单独的蠕动泵在输入溶液及其端口之间传递 1.6 mm 的计量 （ID） 可高压管，这些泵可通过手动选择的流量或来自 pH 和泡沫级探头的反馈进行控制（如果是酸，基和消泡溶液）。
2. 在高压灭菌之前校准光生物反应器 pH 计。
   1. 通过将探头安装到连接线并扭曲锁定，将 pH 探头连接到光生物反应器控制塔。使用 pH 4 和 pH 7 缓冲液校准 pH 计。在接受 pH 计值之前，请等待值稳定。
   2. 将 pH 探头与将探头连接到控制塔的 pH 计线断开。
   3. 表面消毒与70%乙醇或高压灭菌器与反应器。要进行高压灭菌，用铝箔将 pH 探头盖紧。
      注:如果探头被高压灭，则存在蒸汽损坏导致探头内部腐蚀的风险。这种封顶方法不能完全保证防损。
   4. 在培养基中加入10 mM 4-（2-羟基）烟碱-1-乙酸（HEPES）缓冲液，以更好地控制pH。
3. 插入并拧紧光生物反应器头板上的冷手指和排气冷凝器。
4. 插入接种口，拧紧到位。在光生物反应器头板上方的接种口部分添加一段可高压灭菌管。在对生物反应器进行高压灭菌之前，用可高压灭菌的软管夹紧关闭的管。
5. 将装有无菌过滤器的油管连接到任何未使用的光生物反应器端口。
6. 通过可高压灭菌管将酸和基输入溶液连接到光生物反应器输入端口。添加 1.5 L 的培养基。
7. 根据工作体积，在121°C下对反应器和相关输入溶液进行30-45分钟的高压灭菌。
   注:如果培养基因高压灭菌而受到不利影响，在层流罩无菌条件下进行高压灭菌后添加介质。可以在此处暂停该协议。
   注意:从高压灭菌器中取出后，反应器将很热。
8. 将叶轮电机连接到叶轮轴并拧紧接头。
9. 根据照明要求，在生物反应器外对称地排列 LED 光板。
   1. 在高压灭菌之前，使用光度计测量和记录光强度。将照度传感器放在光生物反应器容器内，并将传感器朝向光源。
10. 连接最多两个气瓶，为光生物反应器中的微藻提供模拟燃煤发电厂排放物（表1）。
    注:本研究使用的气体浓度与爱荷华大学发电厂的气体浓度近似。
    1. 组装气瓶、气体调节塔和光生物反应器分离环之间的连接。将适当的调节器连接到气瓶上，该调节器具有 20 psi 出口压力。将 6 mm ID 耐压管连接到调节器出口软管棒，并用软管夹固定。使用软管棒将耐压管的另一端连接到气体调节塔气入口，用软管夹固定到 6 mm 杆快速连接接头上。使用另一个 6 mm 快速连接接头将 3.2 mm ID 管连接到气体调节塔气出口，并将出口管的另一端连接到光生物反应器头板的贴片环端口。
       注:对于第二个输入气体，重复步骤 3.9.1，但使用 T 形软管棒将两条输入气体管路合并到连接到隔断环端口的管的单个部分。
    2. 在每个气体调节器上将出口压力设置为 20 psi，并使用生物反应器接口设置实验气体流速。
       注:计算并报告标准条件下每分钟液体体积（vvm）下的空气量;将体积气体流速除以培养体积。以每个小型单位为单位报告。
11. 当与多个气瓶发生压接时，使用 CO₂传感器将随附的_CO2浓度确认给光生物反应器。
    1. 将软件（例如 GasLab）兼容的_CO2传感器连接到计算机的 USB 端口。下载与 CO₂传感器型号对应的最新软件。打开软件并输入传感器模型、测量时间间隔和测量数据记录持续时间。
    2. 将 CO₂传感器和组合气体流管（在将管与生物反应器连接之前）放入 100–250 mL 的带盖的通风容器（生物反应器外部）。
       注:在实验期间，可以从光生物反应器头板上的一个排气管测量头空间_CO2浓度。
    3. 在用户界面上启动_CO2浓度测量值，并等待测量值平衡。
    4. 使用光生物反应器用户界面调整每个储罐的气体流速，直到达到所需的总流量（0.1 L^min-1）和 CO₂浓度 （12%）实现。
12. 在光生物反应器用户界面上，使用 STIRR 函数设置叶轮旋转速率。确保混合速度足够快，以便培养基吸收破裂的气泡。
    注:某些微藻物种具有弱细胞结构，会因高剪切力而受损或破裂。

4. 调整光生物反应器和实验装置，用于有毒气体

注意:实烟或模拟烟气中的腐蚀性气体具有腐蚀性和毒性。如果吸入这些气体，则会带来严重的风险。
注:此方法不描述用于安全种植产生或消耗高度易燃气体（即甲烷、氢气等）的微生物的适当材料。

1. 用耐腐蚀材料替换黄铜、塑料和标准管组件。
   1. 使用不锈钢可靠地抵抗由 NO_x或 SO_x和水之间的反应形成的强酸的腐蚀。使用不锈钢快速连接接头更换气体调节塔上的气体入口和出口处的塑料快速连接接头。使用不锈钢调节器用于气瓶，包括出口软管棒，而不是黄铜。
   2. 使用聚四氟乙烯 （PTFE） 或天然乙基醋酸乙烯 （EVA） 管在气瓶与气体调节塔和气体调节塔到光生物反应器的连接上，分别抵抗 NO_x和 SO_x气体（分别）的腐蚀。
2. 高压灭菌后，将光生物反应器和气瓶组装在步入式烟气罩内。将光生物反应器放在二次密封内的桌子上，并将气瓶放在自由站立的气缸环或气缸架中。
3. 启动气体流量后，使用气泡式液体泄漏检测器检查气瓶和生物反应器之间所有连接中的气体泄漏。使用装满1:100（v:v）稀释洗碗皂的洗涤瓶:水用一小串肥皂溶液覆盖连接。
   注: 泄漏将通过连接冒泡来指示。
4. 启动微藻实验时，开始切合，然后在接种前调整pH值（如标准光生物反应器实验中所示）。
   注:强烈建议在腐蚀性气体实验中缓冲培养基，因为输入气体呈强酸性。
5. 通过将制备的微藻接种液吸入无菌注射器，将注射器安装到连接到接种口的管道上，打开接种管夹，并打压注射器，使光生物反应器接种。
6. 每天检查气体监测器、气瓶压力和光生物反应器两次（取样前），检查有毒气体水平升高或有泄漏迹象。
7. 将烟气罩窗框开口限制在允许达到生物反应器和气瓶调节器的宽度。为避免吸入暴露风险，请确保开口不会暴露躯干区域上方的人员。
8. 将气瓶调节器转向关闭位置，以停止流向反应器的气体流量。关闭烟机罩窗框，让发动机罩在取样光生物反应器培养液之前，5分钟排出腐蚀性气体。
9. 通过打开头板端口并使用无菌血清学移液或使用培养剂通过接种/取样口将培养液绘制到注射器中，在烟罩内取样。在打开气瓶和恢复实验之前，保护光生物反应器端口。

5. 测量微藻生物量生产率

1. 使用校准曲线将微藻培养 OD₇₅₀测量与干燥的微藻生物量浓度相关联。
   1. 准备几个（最小: 4 ，最小工作体积: 500 mL ）瓶与无菌微藻介质和接种与感兴趣的物种（例如， S .在本研究中）。
   2. 测量培养物 OD_750，直到增长呈指数化，并通过过滤已知体积（最小 100 mL）的已知体积（最小 100 mL），使用已知质量的 0.45 μm 滤膜，迅速对烧瓶进行取样。使用盖铝称重船或玻璃容器，以支持生物质和过滤器，因为它们燥。
   3. 在80~100°C的烤箱中干燥约18~24小时后，将生物质和过滤器进行质量。要验证完全干燥，请再次测量后，额外的 2⁄3 小时，以确定质量是否稳定。
   4. 从组合的生物量和过滤质量中减去过滤器质量以计算生物量质量。
   5. 根据生物量浓度（生物量质量除以过滤培养的体积）绘制测量的 OD₇₅₀校准曲线，并将数据与线性回归拟合。

6. 生物质生产率建模和速率计算

1. 使用校准曲线线性回归（在第 5 节中确定）从 OD₇₅₀测量中计算实验生物量浓度。
2. 在图形和统计软件中，使用逻辑回归（公式 2）拟合从滞后到指数到固定阶段的批次微藻生长数据（材料表）:
   (2)
   其中L是曲线的最大生物量浓度值，k是指数相 （time^-1）的相对陡度， x_o是 sigmoidal 曲线的中点的时间，x是时间。
   1. 手动输入上面的物流方程。在软件的"分析"选项卡上选择"拟合具有非线性回归的曲线"。在"参数:非线性回归"框的左侧，在"新建"下下选择"创建新方程"。使用默认显式方程作为方程类型，命名新函数，并将新函数定义为 Y = L/（1= exp（x-b）），其中b表示 x _o。
3. 通过将最终生物量浓度和初始生物量浓度之间的差值除以最终时间和初始时间之间的差值，计算微藻批次的总体生物量生产率。
4. 在sigmoid中点计算公式 2 （方程 3） 的导数中值，当 x = x_o时，微藻批次的最大生物量生产率。
   (3)

Results

以OD₇₅₀和干生物量浓度建立了在指数阶段收获的绿色微藻S.obliqus的校准曲线（图2）。线性回归的 R²值为 0.9996。

S. obliquus培养器是在 250 mL Erlenmeyer 烧瓶中从储存在冷藏的胶板上的培养物开始的。微藻在3N-BBM中接种，带10 mM HEPES缓冲液，在2L光生物反应器中用2.2%CO₂进行接种，工作体积为1.5升（0.07 vvm）（图1）。该批通过 OD₇₅₀进行跟踪;生物量浓度从校准曲线计算，然后用物流曲线建模（图3）。光生物反应器保持培养在pH 6.8，100cm^{3 min-1}总气体流速，连续280μmol^{m-2 s-1}照明，27°C。物流...

Discussion

具有调节pH值、温度、气体流速和气体浓度的批量、轴状光生物反应器实验通过消除非目标藻菌株的污染和培养条件的变异性，促进有意义的结果。即使在腐蚀性气体_{（CO2、SO2、NO2）}的情况下，也能获得精确的纯培养生长动力学，这些气体作为营养物质，将废气转化为动物饲料等有价值的产品。

在开始任何微藻实验之前，应从存储中取走选定的微藻培养物，并重新适应液体培养。将微藻生长成指数相，提高了实验具有等效初始条件以及接种后微藻在滞后阶段不停滞的可能性。

在生物量生产力研究中，有关光密度和生物量浓度的校准曲线尤为重要。高微藻生物量生产率是微藻产业的主要目标之一，因此，它往往是研究成功的一个指标^。因此，从光学密度测量中准确计算生物量浓度必须基于物种特定、精确和精确的校准曲线数据。为了避免潜在的光学干扰，在等效的背景解决方案中测量校准曲线和实验期间进行测量非常重要。此外，校准曲线应该使用在生长阶段最具有代表性的微藻的测量进行。某些微藻类在...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biostat A 生物反应器	Sartorius Stedim		2 升生物反应器，用于微生物发酵;设计用于高压灭菌;pH、温度、气体流速控制
通气试验 NO2 气体	Grainger	GAS34L-112-5	用于 MultiRAE 气体检测器的校准气体
通气试验 O2， CO， LEL 气体	Grainger	GAS44ES-301A	校准气体MultiRAE 气体检测仪
通气试验 SO2 气体	Grainger	GAS34L-175-5	用于 MultiRAE 气体检测仪的校准气体
用于 NO2 气体的耐腐蚀管	Swagelok	SS-XT4TA4TA4-6	PTFE 芯管 光孔 X 系列—纤维编织层和 304 不锈钢编织层增强
用于 SO2 气体的耐腐蚀管	QC 供应	120325	增强编织天然 EVA 管 - 1/4" 内径
cozIR 100% CO2 米	Gas Sensing Solutions Ltd.	CM-0121 在	CO2meter.com CO2 测量仪上，浓度高达 100%
cozIR 20% CO2 测量仪	Gas Sensing Solutions Ltd.	CM-0123 在 CO2meter.com	CO2 计中，浓度高达 20%
Durapore 膜过滤器，0.45 &μ;m	Millipore Sigma	HVLP04700	亲水性，纯白色，直径 47 mm，0.45 &μ;m 孔径，PVFD 膜过滤器
气瓶调节器	普莱克斯	PRS 40221331-660	单级不锈钢调节器 配置为 0-15 psi 出口组件 隔膜阀，带 1/4" MNPT 螺纹，不锈钢，可抵抗 NOx 和 SOx
气瓶	普莱克斯	Ulta-zero 空气、高纯度 CO2 或定制气体成分	取决于研究目标
霍尼韦尔气体监测和泄漏检测系统	RAE Systems by Honeywell	MAB3000235E020	检测 O2、SO2、NO2、CO 和 LEL 的泵送型号
GasLab 软件	GasLab	v2.0.8.14	用于 CO2 仪表测量和数据记录的软件
软管倒钩	Grainger	项目 # 3DTN3	用于使调节器适应管道，不锈钢，以抵抗 NOx 和 SOx
K30 的腐蚀 1% CO2 测量仪	Senseair	CM-0024 CO2meter.com	CO2 测量仪，浓度低于 1%
LED生长板	Roleadro	HY-MD-D169-S	红色和蓝色LED灯板
Memosens 溶解氧探头	Endress+ Hauser	COS22D-19M6/0	高压灭菌（有预防措施） 生物反应器溶解氧探头
Memosens pH计	Endress+ Hauser	CPS71D-7TB41	可高压灭菌（有预防措施） 用于生物反应器的 pH 探头
烘箱，Isotemp 500 系列	Fisher Scientific	13246516GAQ	用于干燥的小型烘箱
Prism GraphPad 软件	GraphPad 软件	7.03 或 8.0.1 版	用于数据组织、数据分析和出版质量图表的绘图软件
阀杆到软管倒钩接头	世伟洛克	SS-4-HC-A-6MTA	不锈钢软管接头，6 mm 管接头，1/4 in.软管内径
管材，稀酸/稀碱输送	Allied Electronics and Automation 6678441		硅胶 TP 工艺管材;1.6mm 孔径;3000mm 长;食品级
管材，气体输送	相关电子和自动化	6678444	硅胶 TP 工艺管材;3.2mm 孔径;3000mm 长;食品级