本文介绍一种快速简便的实验方案，通过检测细胞裂解液中的发光强度，来测定表达NF-κB::荧光素酶报告基因构建体的细胞系中活化B细胞核因子κ轻链增强子（NF-κB）的激活水平。此外，通过RT-qPCR检测鼠伤寒沙门菌（Salmonella Typhimurium）感染细胞后分离得到的基因表达水平。
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摘要
摘要
二聚体转录因子 NF-κB 调控多种细胞应答通路，包括通过诱导多种细胞因子和趋化因子的表达来调节炎症通路。NF-κB 组成性表达，并由抑制性蛋白 B 细胞κ轻链多肽基因增强子的核因子抑制蛋白α（IκBα）在细胞质中隔离。NF-κB 的激活需要 IκBα 的降解，从而暴露 NF-κB 上的核定位信号，促进其向细胞核的转运。进入细胞核后，NF-κB 结合到其靶基因（如白细胞介素 6（IL-6）和 IL-23）的启动子区域，促进这些基因的表达。
NF-κB 的激活与转录或翻译过程无关。因此，必须通过特异性定量细胞核内的 NF-κB，或定量 NF-κB 靶基因的表达水平来检测其激活状态。在本实验方案中，采用体外组织培养技术，检测稳定转染了 NF-κB::luciferase 报告基因构建体的细胞中 NF-κB 的激活情况。这些细胞被鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）感染以激活 NF-κB，活化的 NF-κB 进入细胞核并结合到荧光素酶基因启动子区域的 κB 位点，从而诱导其表达。随后裂解细胞，并使用荧光素酶检测系统进行分析。细胞产生的荧光素酶量与发光信号强度成正比，该信号由酶标仪检测。本方法产生的发光信号提供了一种快速且高度敏感的手段，可用于在多种条件下评估 NF-κB 的激活水平。本方案还利用定量反转录 PCR（RT-qPCR）检测反映基因表达水平的相对 mRNA 含量。
引言
核因子-κB（NF-κB）蛋白家族是一类重要的转录激活因子，可调控多种生物通路中的基因表达。NF-κB的激活可诱导靶基因的转录，其中许多基因在免疫和炎症反应、细胞增殖、应激反应以及癌症进展中发挥重要作用1,2。NF-κB在介导病原体清除相关的早期炎症反应中起着关键作用。鉴于NF-κB激活参与调控多种生物学过程，其信号通路的异常可能对健康和疾病产生严重后果。NF-κB信号通路的功能缺失突变与多种免疫缺陷表型相关，而功能获得性突变则与多种癌症相关，包括B细胞淋巴瘤和乳腺癌3。此外，许多病原体已被证实可通过表达毒力因子直接调控NF-κB的活化状态4,5,6,7。
已知NF-κB的活化可由多种不同的刺激引发，包括细菌产物，如脂多糖（LPS）、鞭毛蛋白和肽聚糖，这些分子被称为病原体相关分子模式（PAMPs）。这些PAMPs可被模式识别受体（PRRs）识别，例如Toll样受体（TLRs）和Nod样受体（NLRs），从而导致NF-κB的活化，并继而诱导一系列NF-κB依赖性炎症基因的表达8。除了PAMPs对PRRs的激活作用外，其他细菌产物（如细菌效应蛋白）也可诱导NF-κB的活化。有趣的是，某些细菌还会表达能够主动抑制NF-κB信号通路的效应蛋白，从而增强其致病性，这进一步凸显了NF-κB作为免疫反应关键介质的重要性9。
组成 NF-κB 二聚体的亚基共有五种：p50、p52、RelA（p65）、RelB 和 cRel。其中最主要的两种 NF-κB 异源二聚体是 p50:RelA 和 p52:RelB 二聚体。活化的 NF-κB 二聚体会结合到多种靶基因启动子区和增强子区中的特定 DNA 位点，这些位点被称为 κB 位点。在正常的稳态条件下，NF-κB 通过与一类称为 IκB 蛋白的抑制蛋白相互作用而保持非活性状态。当受到刺激时，IκB 被 IκB 激酶（IKK）磷酸化，从而被标记进行泛素化修饰并随后降解。IκB 的降解使 NF-κB 暴露出核定位信号，从而被激活。随后，NF-κB 转位至细胞核，在靶基因的启动子区域结合 κB 位点，促进基因转录10。因此，NF-κB 的活化会提高其靶基因的 mRNA 表达水平，这种变化可通过 RNA 定量检测方法（如 RT-qPCR）进行测量11。
目前存在多种常用方法用于检测NF-κB的激活，包括电泳迁移率变动分析（EMSA）、核转位检测以及基因报告子检测。EMSA用于检测蛋白质与核酸之间的复合物。经刺激的细胞被分馏以分离核蛋白，其中包括转位至核内的NF-κB，随后将这些核蛋白与含有NF-κB结合域的放射性标记核苷酸共同孵育。样品在凝胶中电泳，并通过32P标记核酸的自显影成像。如果蛋白组分中存在NF-κB，它将与核苷酸结合，导致其在凝胶中的迁移速度变慢，从而形成清晰的条带。而缺乏活化NF-κB的细胞核组分（例如未受刺激的对照细胞）则不会产生条带，因为核苷酸会快速迁移至凝胶末端。该方法的一个主要缺点是其定量能力有限，仅能以二元方式（即“有”或“无”）进行判断，无法充分反映NF-κB结合能力的有意义差异。此外，该方法未考虑对NF-κB靶基因功能上重要的染色质结构12，13。
与之前的方法类似，还有一种"非迁移"检测方法，即使用含有 NF-κB 结合序列的核苷酸包被多孔板。在将细胞核蛋白组分处理细胞后，NF-κB 会结合到固定在孔板上的核苷酸。随后加入抗 NF-κB 抗体，该抗体与已结合的 NF-κB 相互作用，产生与 NF-κB 含量成正比的比色信号，从而反映 NF-κB 的活化程度。与 EMSA 相比，该方法的优势在于无需使用放射性标记的核酸，且具有定量能力。然而，该方法的一个局限性在于，同样无法区分 NF-κB 靶基因的染色质状态14。
检测NF-κB激活的另一种方法是染色质免疫沉淀（ChIP），该方法通过甲醛将DNA与其相互作用的蛋白质交联，再使用特异性的抗NF-κB抗体进行免疫沉淀。随后通过PCR扩增或直接高通量测序来纯化并鉴定特定的核苷酸片段。该方法所得结果可提供NF-κB与靶基因结合活性的半定量数据。然而，结果在很大程度上依赖于每一步骤中的交联条件和纯化过程15。
在核转位检测中，细胞经刺激以诱导NF-κB活化，随后被固定。向固定后的细胞中加入抗p65抗体。或者，p65亚基本身可标记荧光肽，例如绿色荧光蛋白（GFP）。无论采用哪种方法，均可通过免疫荧光成像来观察p65的定位，从而确定其在细胞内的分布情况。通过测量胞质和细胞核中定位蛋白的比例，研究人员可判断NF-κB的相对活化状态。该方法的缺点是免疫荧光操作相对耗时，需要昂贵的抗体，并且对技术操作要求较高16。
报告基因是研究目的基因调控和表达模式的常用工具。通常，报告基因由目的基因的启动子序列与编码易于检测蛋白的基因融合构建而成。具有酶活性、荧光或发光特性的蛋白因其可被检测和定量，常被选为报告蛋白。因此，检测信号（如发光、荧光）可作为基因表达的指示。这些报告基因构建体随后可被导入不同类型的细胞中，例如上皮细胞或巨噬细胞。
本方案描述了一种克隆的HeLa细胞系（HeLa 57A）的使用方法，该细胞系稳定转染了含有免疫球蛋白κ链启动子区三个拷贝κB共识序列的荧光素酶报告基因17。荧光素酶的表达依赖于NF-κB的激活，而NF-κB的激活发生在细胞受到刺激之后。刺激后的细胞可使用荧光素酶检测试剂盒中提供的细胞裂解缓冲液轻松裂解。取部分细胞裂解液与含有荧光素的荧光素酶检测缓冲液混合。荧光素是荧光素酶的底物，在荧光素酶存在的情况下是产生光所必需的。将检测缓冲液与裂解液混合后，溶液会通过一种称为发光的过程发射光。所产生的光量以流明为单位，与裂解液中荧光素酶的含量成正比，因而可作为NF-κB激活程度的衡量指标。通过与未刺激的对照样本进行比较来解读流明读数，以校正基础水平的NF-κB活性；且该信号在数分钟内保持稳定，便于可靠测量。此外，HeLa 57A细胞系还稳定转染了NF-κB非依赖性的β-半乳糖苷酶报告基因。该β-半乳糖苷酶报告基因组成性表达，可通过检测β-半乳糖苷酶活性来校正细胞活力或细胞数量的差异17。随后可将荧光素酶的检测值归一化至β-半乳糖苷酶的检测值，并以相对于未刺激对照细胞的倍数变化形式报告结果。
由于NF-κB是一种转录因子，可促进NF-κB依赖性靶基因的表达上调，因此可通过定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）作为后续实验，以检测NF-κB依赖性的基因表达增加情况。RT-qPCR是一种高度敏感的方法，能够对多个数量级范围内的基因表达变化进行定量分析。经刺激和未刺激的细胞通过苯酚-氯仿提取法收集RNA。经过相分离后，RNA主要存在于水相中并被提取出来。随后通过沉淀和洗涤步骤获得纯净的RNA沉淀。该沉淀被重新溶解，并通过DNase处理进一步去除污染的DNA。纯化后的RNA再经逆转录生成互补DNA（cDNA）。随后可利用定量PCR技术对cDNA进行分析，通过定量特定mRNA序列的丰度来确定基因表达水平。该技术无法揭示翻译调控、翻译后修饰、蛋白质丰度或蛋白质活性信息。然而，许多基因（尤其是参与促炎过程的基因）受NF-κB调控，其mRNA丰度可反映其表达水平。
本文提出的方法通过一种快速且简便的方式，利用细胞裂解液的发光检测来检测NF-κB的激活。通过检测NF-κB靶基因的表达，RT-qPCR可用于定量特定基因的表达水平，并验证NF-κB激活的功能活性。该系统的主要优势在于其简便性和快速性，适用于对多种调控NF-κB激活的条件进行高通量筛选。本实验方案适用于表达NF-κB::luciferase报告系统的其他细胞系，已在稳定转染的RAW264.7细胞中得到验证18。从细胞裂解到产生发光信号的整个样品处理过程耗时极少，约需一小时。检测NF-κB仅需基本的实验设备，如不透光的微孔板、具备发光检测功能的酶标仪，以及简单的数据分析软件（如电子表格程序）。
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方案
1. 细胞传代与接种
- 在37 °C、5% CO2 培养箱中，将HeLa 57A细胞培养于含10 mL添加5%热灭活胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）的75 cm2培养瓶中。
- 吸除细胞培养液，加入1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液洗涤。吸除胰蛋白酶溶液后，再加入1 mL新鲜胰蛋白酶溶液，将培养瓶置于37 °C培养箱中孵育4–5分钟，使细胞从瓶壁脱落。
- 加入9 mL细胞培养液，轻轻吹打培养瓶底部数次，使细胞充分悬浮，形成均一的细胞悬液。
- 将HeLa 57A细胞按1:6或1:8比例用新鲜培养基稀释后接种至新的培养瓶中。当细胞融合度达到90%或每隔三天传代一次，并维持细胞融合度不低于25%。
- 在细胞刺激前一天，用胰蛋白酶消化HeLa 57A细胞，重悬于10 mL生长培养基中。使用血细胞计数板对细胞悬液进行计数，并用生长培养基将细胞稀释至最终浓度为2.5 × 105 个细胞/mL，置于50 mL锥形管中。
- 将250 µL细胞悬液（约6.25 × 104 个细胞）转移至48孔板的每个孔中。定期盖紧并翻转锥形管，确保细胞悬液均匀。轻轻敲击培养板侧面，使细胞在各孔中分布均匀。
- 将培养板转移至37 °C、5% CO2 培养箱中，过夜培养，使细胞贴壁并生长。
2. 细菌的制备
- 感染前两天，将冻存的沙门氏菌（Salmonella）菌种在LB琼脂平板上划线以获得单菌落。将平板放入37 °C的培养箱中，过夜培养。
- 感染前一天，在无菌的细菌培养管中加入3 mL溶菌肉汤（LB），并根据需要向培养基中添加适当的抗生素。
- 使用无菌接种环从划线培养的细菌平板上挑取单个菌落，并将接种环轻轻接触LB培养基。接种后盖好管盖，并丢弃接种环。
- 将培养管置于37 °C、180 rpm的摇床培养箱中，过夜培养。
- 感染当天，从培养箱中取出过夜培养的细菌培养物。
- 通过向无菌培养管中加入3 mL含或不含抗生素的新鲜LB培养基，准备用于传代培养的试管。
- 将30 µL过夜培养的细菌培养物（1:100稀释）转移至新配制的培养基中。将试管置于37 °C的摇床培养箱中培养3小时。
- 3小时培养后，将1 mL无菌LB肉汤转移至一个塑料比色皿中作为空白对照。将900 µL LB转移至其他比色皿中，用于后续样品分析。
- 将100 µL细菌传代培养物加入含有900 µL LB的比色皿中，并用移液器反复吹打数次以充分混匀。对每个细菌悬液重复此操作。
- 打开分光光度计，设置波长为600 nm，用于测定细菌培养物的光密度（OD）（OD600）。
- 将空白比色皿放入分光光度计中。注意其方向，通常比色皿顶部有标记指示正确朝向。
- 关闭盖子，按下分光光度计上的空白按钮，以测定背景吸光度。
- 保持相同方向，将空白比色皿替换为样品比色皿，然后按下读数按钮。
- 记录各样品的OD600值。将测得数值乘以10，以校正稀释倍数。
- 用新鲜LB培养基稀释细菌传代培养物，使吸光度值达到约1.0，该值大致对应于1 × 109 cfu/mL。将此悬液在比色皿中进一步1:10稀释，并测定吸光度，预期结果约为0.1。
- 在新试管中，加入适量稀释后的传代培养物至新鲜LB培养基中，配制成浓度为1 × 108 cfu/mL的菌悬液，作为接种物。
- 通过将50 µL细菌悬液转移至含有450 µL无菌PBS的试管中（10倍稀释），依次进行系列稀释，直至获得最终稀释度约为102 cfu/mL的样品。
- 取两个最低稀释度（102和103，分别对应约10和100个菌落形成单位）的菌液各100 µL，接种于LB琼脂平板上，使用细胞涂布器均匀涂布，以获得单菌落。将平板置于37 °C培养箱中过夜培养。
- 次日计数菌落数量，并据此计算初始接种物的细菌浓度，以确定实际接种浓度。
3. 细胞感染
注意：此时细胞汇合度应约为90%。对于48孔板中的HeLa 57A细胞，每孔细胞数量约为1 × 105个。细胞感染复数（MOI）为10，即每孔106 cfu。
- 根据每个孔将使用的感染条件，在培养板的盖子上进行标记，每种条件设三个重复孔。
- 向相应的孔中加入 10 µL 接种物。向未感染的对照孔中加入 10 µL 无菌 LB 培养基。
- 为同步感染时间，将培养板放入台式离心机，于 500 x g 离心 5 分钟，并确保培养板保持平衡。
- 将感染后的细胞转移至 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 1 小时。
- 将一份细胞培养基置于 37 °C 水浴中，用于下一步操作。
- 感染后 1 小时，从水浴中取出细胞培养基，用 70% 乙醇擦拭外表面，并将细胞培养板转移至生物安全柜中。
- 采用无菌操作技术，吸去各孔中的培养基，并更换为 250 µL 新鲜的温热细胞培养基。
- 将培养板放回 37 °C、5% CO2 培养箱中继续孵育 4 小时。
- 从 CO2 培养箱中取出培养板，吸去孔内培养基。如需进行荧光素酶分析，请继续执行步骤 4.1；如需进行 RNA 提取，请进入步骤 5.1。
4. 荧光素酶分析
- 向孔中加入 100 µL 的 1x 细胞裂解缓冲液。根据试剂的不同，缓冲液可能需要先稀释至工作浓度。
- 将板放入 -80 °C 超低温冰箱中，孵育至少 30 分钟，以确保细胞充分裂解。
- 将含有冷冻细胞裂解物的板置于实验台上解冻，并根据制造商的建议配制荧光素酶底物试剂。
- 使荧光素酶底物试剂平衡至室温。
- 打开酶标仪并启动相应的读板程序，设置仪器以检测发光信号。
- 用多通道移液器将每个样品的 10 µL 转移至不透光的 96 孔板的孔中。
- 使用多通道移液器向不透光板的每个孔中加入 50 µL 荧光素酶检测试剂。
- 轻轻侧向敲击板以混匀各孔，确保孔底完全被液体覆盖。将板放入酶标仪中并开始读数。
- 将发光值复制到电子表格程序中，并绘制结果图表。
5. RNA 提取
- 向每个孔中加入 500 µL 硫氰酸胍，并反复吹打数次，以确保细胞完全裂解。
- 将内容物转移至已标记的微量离心管中。尽可能将样品保持在冰上，以维持 RNA 质量。
- 将台式离心机预设为 4 °C，并在整个实验过程中保持该温度。
- 向每个样品管中加入 100 µL 氯仿，盖紧管盖，剧烈振荡 15 秒。室温孵育 10 分钟。
- 在 4 °C 条件下以 12,000 x g 离心 15 分钟。在此期间，通过标记新管为下一步 RNA 纯化做好准备。
- 将上层水相转移至含有 250 µL 异丙醇的新管中，注意不要扰动中间层或下层有机相。
- 将未使用的产物储存于 -80 °C 冰箱中，该产物也可用于蛋白质分析。残留的水相层在后续需要 RNA 时可作为备用来源。
- 涡旋水相层与异丙醇的混合物，室温静置 10 分钟。
- 在 4 °C 条件下以 12,000 x g 离心 10 分钟。
- 从离心机中取出管子。RNA 沉淀在管壁和管底形成白色小颗粒。打开管盖，小心倾倒上清液至废液容器中，避免触及沉淀。
- 加入 500 µL 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀，并进行涡旋。
- 在 4 °C 条件下以 8,000 x g 离心 5 分钟。
- 倾倒去除上清液，再次用 75% 乙醇洗涤沉淀。
- 在 4 °C 条件下以 8,000 x g 离心 5 分钟。
- 使用小体积移液器（例如 10–200 µL），尽可能吸除上清液，注意不要将液体重新压入管中，也不要让移液器吸头触碰或冲散沉淀。若沉淀脱落，可短暂离心后再次尝试去除上清液。
- 将 RNA 沉淀在空气中干燥。若某些样品的沉淀可见，应定期（每 5 分钟）观察其是否由白色变为透明，此变化表明沉淀已干燥。一旦沉淀开始变透明，立即加入 20 µL 超纯、无 RNase 的水以溶解 RNA。
- 若某些样品的沉淀最初不可见，则在去除上清液后 5 分钟直接加入超纯水。
- 为提高溶解度，可将溶液反复通过移液器吸头数次，并在 55–60 °C 孵育 10 分钟。
6. RNA 的 DNase 处理
- 为保持RNA完整性，除非另有说明，RNA样品应置于冰上保存。此时可将10x DNase缓冲液从冷冻箱中取出，并在冰上解冻。
- 使用无绒布清洁所有样品分析表面，以准备分光光度计进行样品分析。
- 在分析前进行背景测量。操作时，在传感器上加载1.5 µL用于溶解RNA沉淀的相同超纯水，然后按下读取空白按钮以获取背景读数。
- 使用无绒布擦拭仪器的样品加载表面。每次样品读数后均需重复此步骤。
- 将1.5 µL重悬的RNA加入样品槽中，并选择读取样品。重复此操作直至所有样品均完成读数。
- 按每份样品在1.5 mL微量离心管中加入2.4 µL 10x DNase缓冲液和1 µL DNase，配制DNase主混合液。主混合液需额外多配制两份体积。
- 通过轻弹管壁数次混匀主混合液，短暂离心使管内液体沉降至管底。向20 µL RNA样品中加入3.4 µL主混合液，通过轻弹混匀内容物，并如前所述短暂离心。
- 将样品转移至设定为37 °C的加热块中孵育20分钟。同时将DNase失活试剂从冷冻箱中取出，在室温下解冻。
- 将样品放入加热块20分钟后，将其转移至放置在实验台上的试管架中。
- 轻轻涡旋DNase失活试剂管内内容物。向含有RNA的各管中加入2.6 µL DNase失活试剂，然后轻弹管壁以形成均一混合物。
- 以12,000 x g 离心1分钟。
- 小心吸取上清液至新的、已标记的试管中。
7. 将 mRNA 逆转录为 cDNA
- 根据样本数量另加两个额外样本量来配制主混合液，以补偿移液过程中的损失（表1）。每份使用1 µg RNA，并用H2O补至总体积为50 µL。
| 试剂 | 体积 (μL) | 终浓度 |
| MgCl2 (25mM) | 3.5 | 1.75 mM |
| 反转录缓冲液 (10x) | 5 | 1x |
| dNTP 混合液 (10 μM, 各) | 2.5 | 500 nm |
| 随机六聚体 (100 μM) | 1.25 | 2.5 μM |
| Multiscribe 反转录酶 (50 U/μL) | 1 | 1 U/μL |
| RNase 抑制剂 (20 U/μL) | 1.25 | 1.25 U/μL |
| RNA (1 μg) | 20 ng/μL | |
| H2O | 加至 50 |
表1：逆转录主混合液的组分与配制方案。
- 盖紧样品管，将PCR管侧壁贴上标签，避免标签贴在管盖上而因热盖加热导致脱落。使用涡旋振荡器混匀样品。
- 短暂离心PCR管，使样品完全沉降至管底。
- 将PCR管放入热循环仪中，并按照以下程序运行反应：
25 °C 反应10分钟，48 °C 反应30分钟，95 °C 反应5分钟，然后置于10 °C 保存。 - 将含有新合成cDNA的管子转移至-20 °C冰箱保存，或立即用于qPCR分析。
8. 准备和加载用于RT-qPCR分析的孔板
- 开始之前，规划好384孔qPCR板的样品分析设置。
- 将引物和cDNA置于冰上解冻。
- 配制预混液（见表2），并额外多准备约10%，以补偿移液过程中的损耗。
| 试剂 | 体积 (µL) |
| 10 µM F 引物 | 1 |
| 10 µM R 引物 | 1 |
| 超纯 H2O | 4 |
| 2x SYBR green | 10 |
表2：qPCR反应主混合液的组分与配制方案。
- 涡旋混匀主混合液，并使用重复移液器将 8 µL 分装至 384 孔板的各孔中。每个引物与 cDNA 样品组合需设置两个复孔进行分析。
- 使用 P10（或更小量程）移液器，将 2 µL cDNA 加入待分析的每对引物对应的两个复孔中。每次移液后更换吸头，以避免交叉污染。
- 将粘性封板膜小心地覆盖在板面上进行密封，确保所有孔均被覆盖。使用封板压板或滚轮按压膜表面，使其牢固密封。
- 将板放入离心机中，并用一块空板作为配平。在 500 x g 条件下离心 5 分钟。
9. 运行定量 PCR 分析的热循环仪
- 打开计算机和实时荧光定量 PCR 仪。
- 启动 RT-qPCR 软件，选择 新建实验。
- 在 设置 选项卡下，选择 实验属性，在此处可设定运行参数。
- 定义 实验名称，该名称将作为存储结果的文件名和配置依据。
- 在 仪器选择 中，选择当前连接并用于运行分析的仪器，并选择 相对 CT 法（ΔΔCt） 作为运行方法。
- 选择 SYBR Green 试剂 作为使用的荧光 DNA 染料，并选择 标准 作为升降温速率。
- 确保勾选 包含熔解曲线 旁边的复选框。
- 在 定义 选项卡下，指定目标基因（即待扩增的基因）和样本（即实验条件）。
- 选择 分配 选项卡，根据 384 孔板的加样方案，为各孔分配对应的目标基因和样本。
- 选择 运行方法，并使用（表 3）中列出的分析参数。
| 保持阶段 | PCR 阶段 | 熔解曲线阶段 | |||||
| 步骤 1 | 步骤 2 | 步骤 1 | 步骤 2 | 步骤 1 | 步骤 2 | 步骤 3 | |
| 温度 | 50 ℃ | 95 ℃ | 95 ℃ | 60 ℃ | 95 ℃ | 60 ℃ | 95 ℃ |
| 时间 | 2:00 | 10:00 | 0:15 | 1:00 | 0:15 | 1:00 | 0:15 |
| 数据采集 | 是 | 是 | |||||
| 循环次数 | 1x | 40x | 1x | ||||
表3：PCR仪的循环参数。
- 将384孔板放入PCR仪中，并开始分析。
10. 使用ΔΔCt法（2-ΔΔCt）分析qPCR结果
- 分析qPCR反应产生的结果，查找可能影响下游分析的错误。许多错误将由系统自动标记。
- 对于设计正确的引物，熔解曲线应仅出现一个峰。将含有一个以上峰的熔解曲线的孔排除在进一步分析之外。
- 将Ct值导出至电子表格程序，使用ΔΔCt法分析数据。建议格式见（表4）。最后一列为相对于对照样本的样本表达量变化倍数。
| 看家基因（GAPDH） | 目的基因（IL6） | ||||||||||
| Ct1 | Ct2 | 平均 Ct | Ct1 | Ct2 | 平均 Ct | ΔCt | 对照组平均 ΔCt | ΔΔCt | 2^-(ΔΔCt) | 几何平均值 | |
| 对照组 1 | 15.33 | 15.37 | 15.35 | 26.81 | 26.91 | 26.86 | 11.51 | 10.51 | 1.00 | 0.50 | 1.00 |
| 对照组 2 | 16.83 | 16.77 | 16.80 | 26.89 | 26.92 | 26.91 | 10.11 | 10.51 | -0.41 | 1.33 | |
| 对照组 3 | 17.56 | 17.53 | 17.54 | 27.38 | 27.56 | 27.47 | 9.93 | 10.51 | -0.59 | 1.50 | |
| Sl1344 1 | 15.50 | 15.41 | 15.45 | 22.15 | 22.13 | 22.14 | 6.69 | 10.51 | -3.83 | 14.21 | 13.23 |
| SL1344 2 | 16.02 | 15.98 | 16.00 | 23.01 | 22.96 | 22.98 | 6.98 | 10.51 | -3.53 | 11.57 | |
| SL1344 3 | 17.27 | 17.30 | 17.28 | 23.99 | 23.98 | 23.98 | 6.70 | 10.51 | -3.82 | 14.09 | |
| sipA sopB sopE2 1 | 15.38 | 15.41 | 15.39 | 23.31 | 23.09 | 23.20 | 7.80 | 10.51 | -2.71 | 6.56 | 7.29 |
| sipA sopB sopE2 2 | 16.01 | 16.05 | 16.03 | 23.89 | 23.92 | 23.91 | 7.88 | 10.51 | -2.64 | 6.23 | |
| sipA sopB sopE2 3 | 16.78 | 16.78 | 16.78 | 24.02 | 24.06 | 24.04 | 7.27 | 10.51 | -3.25 | 9.49 | |
| sipA sopB sopE2 sopE 1 | 15.52 | 15.60 | 15.56 | 27.04 | 27.03 | 27.03 | 11.47 | 10.51 | 0.96 | 0.51 | 0.79 |
| sipA sopB sopE2 sopE 2 | 15.56 | 15.59 | 15.57 | 26.37 | 26.42 | 26.39 | 10.82 | 10.51 | 0.31 | 0.81 | |
| sipA sopB sopE2 sopE 3 | 15.91 | 15.92 | 15.91 | 26.24 | 26.12 | 26.18 | 10.27 | 10.51 | -0.25 | 1.19 | |
表4：qPCR数据分析格式。
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结果
本文所述的检测方法聚焦于使用稳定转染了NF-κB依赖性荧光素酶报告系统的HeLa细胞系，以检测转录因子NF-κB的激活情况。活化的NF-κB会转位至细胞核，结合靶基因（包括促炎性细胞因子IL6和IL23）的κB结合位点。图1展示了NF-κB激活的总体示意图。本研究中采用革兰氏阴性菌Salmonella enterica血清型Typhimurium作为NF-κB的激活剂，并诱导IL6的表达（图2）。该菌致病所必需的主要毒力因子之一是III型分泌系统-1（T3SS-1），其使S. Typhimurium能够侵入细胞并诱导NF-κB的激活。T3SS-1的功能是将细菌蛋白（称为效应蛋白）递送至宿主细胞内。这些效应蛋白可靶向多种宿主细胞信号通路，介导宿主上皮细胞的侵袭。由S. Typhimurium诱导的NF-κB激活主要依赖于T3SS-1效应蛋白SopE、...
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讨论
本方案的主要贡献在于提供了一种快速、简便的细胞内NF-κB活化检测方法，可用于高通量分析多种刺激条件或影响NF-κB活化的药物。本文描述了沙门氏菌（Salmonella）感染HeLa细胞中NF-κB活化的实验方案。该细胞体系也可用于其他病原体的感染实验，以研究细菌感染对NF-κB活化的影响。此外，HeLa 57A细胞中NF-κB依赖性的荧光素酶活化可用于筛选诱导或抑制NF-κB活化信号通路的分子。本实验中，我们将HeLa 57A细胞接种于48孔板中，但该实验体系可扩展至96孔板甚至384孔板，以实现单次实验检测更多样本。HeLa 57A细胞组成型表达LacZ，可通过β-半乳糖苷酶（β-gal）检测法测定其活性，作为细胞数量和存活率的内参对照。本文所述方案适用于稳定或瞬时转染了NF-κB::luciferase报告基因构建体的细胞系。RAW264.7巨噬细胞系此前已用于类似研究18。需要强调的是，该方法无法区分五种不同NF-κB亚基所形成的同源或异源二聚体的活化状态。不同的NF-κB同源或异源二聚体复合物对启动子序列具有不同的亲和力，并产生不同的转录调控效应
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
Keestra-Gounder 实验室的研究工作获得了美国国立卫生研究院下属的国家过敏与传染病研究所资助，资助编号为 R21AI122092，以及美国糖尿病协会资助，资助编号为 1-18-JDF-035。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 粘附膜 | VWR International | 60941-070 | |
| 氯仿 | Fisher Bioreagents | C298-500 | |
| DMEM | 赛默飞世尔科技 | 11665092 | |
| DNA酶处理试剂盒 | Qiagen | 79254 | |
| dNTPs | 普洛麦格 | U1511 | |
| 乙醇 | Fisher Bioreagents | BP2818100 | 分子级 |
| FBS | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| HeLa 57A 细胞 | 参考编号 15 | ||
| 高容量 cDNA 反转录试剂盒 | 应用生物系统公司 | 4368814 | |
| 异丙醇 | Fisher Bioreagents | BP26181 | |
| 卡那霉素 | Fisher Bioreagents | BP906-5 | |
| LB 琼脂 | Fisher Bioreagents | BP1425-500 | |
| 溶菌肉汤 | Fisher Bioreagents | BP1426-500 | |
| MgCl₂2 | Fisher Chemical | ||
| NanoDrop ND-1000 | 赛默飞世尔科技 | 分光光度计 | |
| Promega 萤光素酶检测系统 | 普洛麦格 | E1501 | 细胞裂解缓冲液 &和荧光素底物 |
| 随机六聚体 | 赛默飞世尔科技 | SO142 | |
| 实时GAPDH正向引物 | 5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3' | ||
| 实时GAPDH反向引物 | 5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3' | ||
| 实时 IL-23 正向引物 | 5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3' | ||
| 实时 IL-23 反向引物 | 5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3' | ||
| 实时 IL-6 正向引物 | 5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3' | ||
| 实时 IL-6 反向引物 | 5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3' | ||
| 逆转录酶 | 应用生物系统公司 | 4308228 | |
| RNase抑制剂 | 赛默飞世尔科技 | EO0381 | |
| RT缓冲液 | 普洛麦格 | A3561 | |
| SL1344 | 参考编号 17 | ||
| SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | 参考编号 18 | ||
| SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039 | 参考编号 18 | ||
| SYBR Green | 应用生物系统公司 | 4309155 | 2x 预混液 |
| 三试剂 | 分子研究中心 | TR 118 | 硫氰酸胍 |
| 胰蛋白酶-EDTA | 赛默飞世尔科技 | 25300054 | 0.05% 胰蛋白酶-EDTA |
| 超纯水 | Fisher Bioreagents | BP248450 | |
| 用于 PCR 的孔板 | VWR International | 89218-294 | 384孔板 |
参考文献
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