在沙门氏菌感染组织培养细胞中，NF-βB依赖性路西酶的激活和基因表达的定量

摘要

在这里，我们提出了一个协议，通过测量细胞裂解中的发光，快速、轻松地测量活性B细胞（NF-B）激活细胞系中激活的核因子kappa-光链增强剂::快星酶报告器结构。此外，基因表达通过从感染沙门氏菌的细胞中分离的RT-qPCR确定。

摘要

二分体转录因子NF-βB调节许多细胞反应途径，包括通过诱导各种细胞因子和化学因子的表达来引起炎症通路。NF-βB是组织表达的，通过B细胞抑制剂α（I+B+）中的卡帕光多肽基因增强剂的抑制蛋白核因子在细胞溶质中固存。NF-βB的激活需要I+B+的降解，然后它暴露NF-βB上的核定位信号，并促进其向核的贩运。一旦进入细胞核，NF-βB与NF-βB靶基因的介子基因（如白细胞介素6（IL-6）和IL-23）的介动区域结合，以促进其表达。

NF-βB 的激活独立于转录或翻译而发生。因此，NF-βB的激活状态必须通过在核中具体量化NF-βB，或者通过量化NF-βB靶基因的表达来测量。在此协议中，使用NF-βB::乳酸酶报告器构造的细胞通过体外组织培养技术进行NF-βB激活。这些细胞感染了沙门氏菌，以激活NF-βB，它流到细胞核，并结合在荧光素酶的启动区βB位点，诱导其表达。细胞用荧光素酶测定系统进行分化和分析。细胞产生的荧光素酶量与发光信号的强度相关，发光信号由板读取器检测到。此过程生成的发光信号提供了一种快速且高度敏感的方法，用于评估 NF-+B 在一系列条件下的激活。该协议还利用定量逆转录PCR（RT-qPCR）来检测指示基因表达的相对mRNA水平。

引言

核因子-βB（NF-B）系列蛋白质是调节各种生物途径中基因表达的重要转录活化剂。NF-βB的激活诱导靶基因的转录，其中许多基因对免疫和炎症反应、细胞增殖、应激反应和癌症进展^1、2都很重要。NF-βB在调解早期炎症结果以清除病原体方面起着不可或缺的作用。鉴于由NF-β-B激活调节的许多生物过程，其信号中断可能会对健康和疾病产生严重后果。NF-βB信号的功能突变的丧失与几种免疫缺陷表型有关，而功能突变的增益与几种癌症有关，包括B细胞淋巴瘤和乳腺癌^3。此外，许多病原体已被证明通过表达毒性因子^{4、5、6、7}直接调节NF-βB的激活状态。

NF-βB的激活被认为是许多可变刺激的结果，包括细菌产物，如脂多糖（LPS）、鞭霉蛋白和称为病原体相关分子模式（PAMPs）的肽类。这些PAMP由模式识别受体（PRRs）检测，如收费受体（TPR）和点头样受体（NLRs），导致NF-βB的激活和NF-βB依赖性炎症基因⁸的后续表达。除了PPP的PRR活化外，其他细菌产物，如细菌效应蛋白，可以诱导NF-βB的活化。有趣的是，细菌还表达有效蛋白，主动衰减NF-βB通路，增强其致病性，强调NF-βB^{作为免疫9}的重要中介的重要性。

有五个不同的子单位，形成NF-βB二聚体;p50，p52，RelA（p65），RelB 和 crel。两个主要的NF-+B杂物是p50:RelA和p52:RelB二聚苯醚。激活的NF-βB二聚体结合各种目标基因的启动子和增强剂区域的DNA位点，称为βB位点。在正常的静息条件下，NF-βB与一系列称为I+B蛋白的抑制剂蛋白相互作用，保持不活性。在刺激时，I+B由I+B基纳斯（IKK）磷酸化，允许其被靶向成泛化，并随后降解。I+B 的降解通过揭示核定位信号激活 NF-+B。NF-βB然后转移到细胞核，在目标基因的启动位区域结合βB位点，促进转录^10。因此，NF-βB的激活调节了NF-βB靶基因的mRNA表达，这种变化可以通过RNA定量测定，如^RT-qPCR11。

存在几种方法，通常用于NF-βB活化的测量，包括电泳移动转移测定（EMSA）、核易位和基因报告器测定。EMSA用于检测核酸的蛋白质复合物。刺激细胞被分馏以分离核蛋白，包括转移的NF-βB，然后用含有NF-βB结合域的放射性标记核苷酸孵育。样品在凝胶上运行，并通过³²个P标记核酸的自成像成像。如果NF-βB存在于蛋白质馏分中，它将结合核苷酸，核苷酸在凝胶中迁移较慢，并作为离散带出现。缺乏活性NF-βB（例如，未刺激控制细胞）的细胞的核部分不会产生带状，因为核苷酸会更快地迁移到凝胶的末端。此方法的一个主要缺点是，它在很大程度上是定量的二进制意义上的（即打开或关闭），并且不能充分捕获 NF-+B 绑定容量中有意义的差异。此外，这种方法不考虑对NF-βB靶基因^12、13具有功能重要性的染色质结构。

与前一种方法类似，存在一种"非移位"测定法，其中多孔板涂有含有NF-βB结合序列的核苷酸。在对含有核蛋白质成分的细胞进行处理后，NF-βB将与结合在井上的核苷酸结合。然后加入抗NF-βB抗体，与结合的NF-βB相互作用，产生与NF-βB量成比例的色度信号，指示NF-βB的激活程度。这种方法优于EMSA，因为它不需要放射性标记的核酸，是定量的，相比之下。然而，这种方法的一个警告是，它再次不区分NF-βB靶基因¹⁴的染色质状态。

另一种可以检测NF-βB活化的方法是通过染色质免疫沉淀（ChIP），即DNA和相互作用的蛋白质与甲醛交联，免疫沉淀与特定的抗NF-β-B抗体。然后，通过PCR扩增或直接高通量测序，对特定的核苷酸片段进行纯化和识别。该方法产生的结果是NF-βB结合活性与靶基因的半定量结果。然而，结果高度依赖于每个步骤¹⁵的固定条件和纯化过程。

在核易位测定中，细胞被刺激诱导NF-βB激活，然后固定。抗p65抗体被添加到固定细胞。或者，p65 亚单位本身可以使用荧光肽（如绿色荧光绿色 （GFP））标记。在这两种情况下，免疫荧光将允许对p65的定位进行成像，以确定细胞分布。通过测量细胞和核局部蛋白的比例，研究者可以确定NF-βB的相对激活状态。这种方法的缺点是免疫荧光相对耗时，需要昂贵的抗体，并且需要相对更高的技术专长^16。

报告基因是研究感兴趣的基因的调控和表达模式的常用工具。通常，报告基因是由一个感兴趣的基因的启动子序列构建的，该基因与一种易于检测的蛋白质的基因编码有关。具有酶活性、荧光或发光特性的蛋白质通常被选择用于测定和量化。因此，读出（例如，发光、荧光）作为检测基因表达的信号。然后，这些报告器构造可以引入到不同的细胞类型中，如上皮细胞或巨噬细胞。

该协议中描述的是使用克隆的HeLa细胞系（HeLa 57A），该细胞系通过含有免疫球蛋白β链促进器区域¹⁷的三个βB共识的荧光酶报告器进行稳稳的转染。荧光素酶的表达取决于NF-βB的激活，在细胞刺激后发生。使用荧光素酶测定试剂盒中提供的细胞乳液酶缓冲液，可轻松对刺激细胞进行分莱。然后，细胞莱沙的一部分与含有荧光素的荧光素酶测定缓冲液混合。路西法林是荧光素酶的基质，在荧光素酶存在的情况下生成光是必需的。将测定缓冲液与解液结合后，溶液将在称为发光的工艺中发出光。以流明表示的发光量与流沙中存在的荧光素酶量成正比，并用作 NF-βB 活化的量度。与未刺激的标准相比，对流明读数进行解释，以考虑基线 NF-+B 活性，信号本身稳定几分钟，以便进行可靠的测量。此外，HeLa 57A 细胞系通过 NF-βB 独立 β-乳糖酶报告器进行稳稳的转染。β-乳糖酶报告器是构成性的表达，β-乳糖酶活性可以测量，以控制细胞的存活性或细胞数¹⁷的变化。然后，可调整荧光酶值，以调整到β-乳糖酶值，并报告为在未刺激的控制细胞上增加的褶皱。

由于NF-βB是负责NF-βB依赖性靶基因表达增加的转录因子，因此控制NF-βB依赖性增加基因表达的后续实验是定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）。RT-qPCR是一种高度敏感的方法，通过这种方法，基因表达的变化可以量化在几个数量级。通过苯酚氯仿提取为RNA采集刺激和控制细胞。相分离后，RNA作为水层的主要成分被提取。然后，RNA被沉淀和洗涤，产生纯颗粒。然后，通过DNase处理，再重组并进一步清除污染物DNA。然后反向转录纯RNA，以创建互补DNA（cDNA）。然后，可以通过定量PCR技术分析该cDNA，其中对特定mRNA序列的丰度进行量化以确定基因表达。此技术不能阐明翻译控制、翻译后修饰、蛋白质丰度或蛋白质活性。然而，许多基因，尤其是那些参与亲炎过程的基因，通过NF-βB进行调控，其mRNA丰度表示其表达。

这里提出的方法采用一种快速、简单的方法，通过细胞莱沙的发光检测可以检测NF-βB的活化。NF-βB靶基因表达的RT-qPCR可用于量化特定基因的表达，以及验证NF-βB活化的功能活性。这种系统的主要优点是其简单性和速度，允许对调节 NF-+B 激活的一系列条件进行高吞吐量筛选。该协议适用于表达NF-βB::乳酸酶报告器的其他细胞系，并已在稳稳转染RAW264.7细胞¹⁸中得到证明。处理样品所需的时间（从细胞溶解到产生发光信号）非常少，大约需要一个小时。NF-+B 的测量只需要基本的实验室设备，如不透明板、能够测量发光的板式读取器以及简单的数据分析软件（如电子表格程序）。

方案

1. 细胞传种和播种

1. 在含有10mL的Dulbeco改性鹰培养基（DMEM）的75cm²烧瓶中保持HeLa 57A细胞，在5%的_CO2培养箱中，在37°C下辅以5%热灭活胎儿牛血清（FBS）。
2. 吸气细胞培养基，用1mL0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液洗涤。吸气胰蛋白酶，并替换为额外的1 mL。将烧瓶置于 37°C 培养箱中 4-5 分钟，让细胞从烧瓶中分离。
3. 加入9 mL的细胞培养基，轻轻清洗瓶底几次，使细胞脱落，形成均匀悬浮液。
4. 稀释HeLa 57A细胞1:6或1:8在新鲜的介质和种子到新的瓶。通道细胞在90%汇合或每三天一次时，将细胞保持至少25%的汇合。
5. 在细胞刺激的前一天，胰腺化HeLa 57A细胞并悬浮在10mL的生长培养基中。使用血细胞计对悬浮细胞进行计数，并使用生长培养素将细胞稀释到50 mL锥形管中最终浓度为2.5 x 10⁵细胞/mL。
6. 将250 μL的细胞悬浮液（±6.25 x 10⁴细胞）转移到48孔板的每个孔。定期盖上锥形管，确保均匀细胞悬浮液。轻轻敲击侧面的板，以确保细胞均匀地分布在孔中。
7. 将板转移到37°C，在5%的_CO2培养箱中，让细胞附着并生长过夜。

2. 细菌的制备

1. 感染前两天，将沙门氏菌的条纹冷冻到LB琼脂板上，以产生单一菌落。将板转移到设定为 37 °C 的培养箱中，并允许一夜生长。
2. 感染前一天，在无菌细菌培养管中加入3 mL的液化汤（LB），向介质中加入适当的抗生素。
3. 使用无菌接种回路，从带条纹的细菌培养物中选取单个菌落，并将环接触 LB 介质。接种后盖住管子并丢弃回路。
4. 将管子置于37°C、180 rpm 的摇动培养箱中，并允许一夜之间生长。
5. 在感染当天，从培养箱中检索过夜的细菌培养物。
6. 通过加入3 mL新鲜LB，在适当的时候含有抗生素，为亚培养准备管子。
7. 将隔夜细菌培养物（100分之一稀释）的30μL转移到新鲜制备的介质中。将管子置于37°C的摇动培养箱中3小时。
8. 3 h 孵育后，将 1 mL 无菌 LB 肉汤转移到塑料比色皿中，作为空白。将 900 μL 的 LB 转移到其他用于样品分析的比色皿中。
9. 将 100 μL 的细菌亚培养物转移到含有 900 μL LB 的比色皿中，并上下移液器多次混合。对每次细菌悬浮液重复此操作。
10. 打开分光光度计，以600nm（OD₆₀₀）的波长测量细菌培养物的光密度（OD）。
11. 在分光光度计中放置空白。记下方向，因为顶部应该有一个标记，指示该方向。
12. 关闭盖子并按下分光光度计的空白按钮以获取背景吸光度。
13. 以相同的方向将空白比色皿替换为样品比色皿，然后按"读取"。
14. 记录这些样本的 OD₆₀₀值。将值乘以 10 以考虑稀释系数。
15. 用新鲜的LB稀释细菌亚培养，达到大约1.0的吸收值，这与1 x 10⁹ cfu/mL大致相对应。在比色皿中稀释此悬浮液 1:10 并测量吸光度 - 应给出 ±0.1 的值。
16. 在新管中，将适当体积的稀释亚培养量添加到新鲜 LB 中，以实现 1 x 10⁸ cfu/mL 的悬浮液，用作接种液。
17. 通过将 50 μL 的细菌悬浮液转移到含有 450 μL 无菌 PBS（10 倍稀释）的管中，直到最终稀释约 10² cfu/mL，制备接种的连续稀释剂。
18. 将两个最低稀释剂的100 μL（10²和10³对应分别为10和100个菌落形成单位）转移到LB琼脂板，用细胞扩张器将悬浮液扩散，以获得单菌落。将这些板转移到37°C培养箱中，并在一夜之间孵育。
19. 第二天计算菌落并计算初始接种的细菌浓度，以确定实际接种浓度。

3. 细胞感染

注:此时，细胞应处于约90%的汇合度。对于 48 孔板中的 HeLa 57A 细胞，每孔大约 1 x 10⁵个细胞。细胞将感染10的多重感染（MOI），或10⁶ cfu/well。

1. 根据将用于每个孔的感染条件，标记板盖，每种条件以三次处理的方式完成。
2. 将10μL的接种液加入适当的井中。在未感染的控制井中加入 10 μL 无菌 LB。
3. 要同步感染时间，将板放在桌面离心机中，以 500 x g旋转 5 分钟，确保板平衡。
4. 将受感染的细胞在37°C下转移到5%的_CO2培养箱1小时。
5. 将细胞培养基分置于37°C水浴中，以便下一步使用。
6. 感染一小时后，从水浴中取出细胞培养基，并用70%乙醇擦拭外部。将组织培养板转移到生物安全柜。
7. 使用无菌技术，从井中吸出培养基，用250μL的新鲜、温暖的细胞培养基。
8. 在37°C下将板返回到5%的_CO2培养箱，额外4小时。
9. 从_CO2培养箱中取出板，并从井中吸出介质。对于荧光酶分析，请继续执行步骤 4.1。对于RNA分离，继续步骤5.1。

4. 路西酶分析

1. 向井中加入100 μL的1x细胞莱沙缓冲液。缓冲液可能需要首先稀释到工作浓度，具体取决于试剂。
2. 将板转移到-80°C冷冻室，孵育至少30分钟，以确保有效的细胞解毒。
3. 将含有冷冻细胞赖酸的板放在工作台上，根据制造商的建议解冻并制备荧光素酶基质试剂。
4. 允许荧光素酶基质试剂与室温平衡。
5. 打开板式读卡器并打开相应的读卡器程序。将机器设置为测量发光。
6. 将每个样品的 10 μL 转移到不透明的 96 孔板的孔中。
7. 使用多通道移液器将 50 μL 的 Luciferase 测定试剂添加到不透明板的每个孔中。
8. 轻轻敲击侧面的板以混合水井，并确保底部表面覆盖液体。将板放在板式读卡器中并启动读数。
9. 将发光值复制到电子表格程序中并绘制结果。

5. RNA分离

1. 在每个井中加入500 μL的苯二恶亚酯，上下移液几次，以确保完全分解。
2. 将内容物转移到标记的微离心管中。尽可能在冰上保存样品，以保持RNA质量。
3. 将桌面离心机设置为 4°C，并将离心机保持在此温度下，直到协议的其余部分。
4. 在每个样品管中，加入100μL的氯仿，盖紧盖子，摇动15秒，在室温下孵育10分钟。
5. 在 12，000 x g下在 4 °C 下离心 15 分钟。在此期间，通过标记新管，为RNA纯化的下一步做好准备。
6. 将上水相转移到含有250 μL异丙醇的新管中，小心不要干扰中下层或下层。
7. 将未使用的产品存放在-80°C冷冻机中，也可用于蛋白质分析。如果以后需要RNA，残留水层也可以作为备用。
8. 涡旋水层和异丙醇的混合物，让样品在室温下坐10分钟。
9. 在4°C下将样品在12，000 x g下离心10分钟。
10. 从离心机中取出管子。RNA沉淀在管的侧面和底部形成白色颗粒。打开管子，小心地取出上清液，倒入废物容器。
11. 加入500μL的75%乙醇和涡旋，洗涤RNA颗粒。
12. 在 4°C 下以 8，000 x g离心 5 分钟。
13. 通过倒出去除上清液，然后用 75% 乙醇再次清洗颗粒。
14. 在 4°C 下以 8，000 x g离心 5 分钟。
15. 使用小体积移液器（例如，10-200 μL 体积），尽可能多吸气上清液，小心不要将任何液体推回管中，或用移液器尖端将颗粒移开。如果颗粒脱落，离心机将短暂停止，并再次尝试去除上清液。
    1. 空气干燥RNA颗粒。如果颗粒对于任何样品都可见，请定期（每 5 分钟）检查它们，看它们是否从白色变为透明，表明它们干燥。一旦颗粒开始变清，加入20μL的超纯RNase游水溶解RNA。
    2. 如果颗粒最初对任何样品不可见，只需在去除上清液后 5 分钟添加超纯水即可。
16. 为了增加溶解度，通过移液器尖端将溶液传递几次，并在55-60°C下孵育10分钟。

6. RNA的DN酶处理

1. 为了保持RNA的完整性，除非另有说明，否则将RNA样品储存在冰上。此时，可以从冰箱中取出 10x DNase 缓冲液，并允许在冰上解冻。
2. 使用无绒布清洁所有样品分析表面，准备分光光度计进行样品分析。
3. 在分析之前进行背景测量。为此，向传感器装载与用于溶解RNA颗粒的相同纯水的1.5 μL。按"读取空白"按钮生成背景读数。
4. 使用无绒布擦拭仪器的样品装载表面。每次阅读示例后重复此步骤。
5. 将1.5 μL的重新悬浮RNA加载到样品支架，然后选择"读取样品"。重复上述步骤，直到读取所有样本。
6. 将 2.4 μL 的 10x DNase 缓冲液和 1 μL 的 DNase，每个样品在 1.5 mL 微离心管中组合，制备 DNase 主混合物。为两个额外的卷准备主组合。
7. 通过轻拂管子几次混合主混音。将管短暂离心以收集管底的含量。将3.4μL的主混合物加入20μL的RNA样品中。与之前一样，通过轻拂和离心机将内容混合在一起。
8. 将样品转移到37°C的热块中20分钟。从冷冻箱中取出DNase失活试剂，并在室温下解冻。
9. 将样品放在热块上 20 分钟后，将样品转移到放在工作台上的管架上。
10. 轻轻涡涡DNase灭活试剂的内容。将2.6 μL的DNase灭活化试剂转移到含有RNA的管中，然后轻拂管以产生均匀的混合物。
11. 将样品在12，000 x g下离心1分钟。
12. 小心地将上清液移至新的标记管中。

7. mRNA逆转录到cDNA

1. 根据样品数量加上两个额外的样品，准备主混合物，以考虑移液造成的损失（表1）。使用1μgRNA，并将_H2O加入50μL总体积。

试剂	体积 （μL）	最终浓度
MgCl2 （25mM）	3.5	1.75 mM
反向转录缓冲液 （10x）	5	1x
dNTP 组合（10 μM，每个）	2.5	500 纳米
随机六甲机 （100 μM）	1.25	2.5 μM
多片逆转录酶 （50 U/μL）	1	1 U/μL
RN酶抑制剂 （20 U/μL）	1.25	1.25 U/μL
RNA （1 μg）		20 纳克/uL
H2O	最多 50 个

表1:逆转录主组合的组件和配方。

2. 将样品盖紧并标记侧面的 PCR 管，因为盖上的标签稍后可能会从热循环器的加热盖上取下。通过涡旋混合。
3. 将 PCR 管短暂离心，以收集样品到管底部。
4. 将 PCR 管置于热循环器中，并在以下设置下运行样品:
   25°C 10 分钟，48°C 30 分钟，95°C 5 分钟，然后保持在 10°C。
5. 将含有新合成的cDNA的管转移到-20°C冷冻室，或立即用于qPCR分析。

8. RT-qPCR 分析的准备和装载板

1. 开始之前，计划 384 孔 qPCR 板的设置，以便进行样品分析。
2. 在冰上解冻引基和cDNA。
3. 准备主组合（见表2），加上大约10%的额外，以解释通过移液造成的损失。

试剂	体积 （μL）
10 μM F 底漆	1
10 μM R 引漆	1
超纯 H2O	4
2x SYBR 绿色	10

表 2:qPCR 主组合的组件和配方。

4. 使用中继器移液器将主混合和分配 8 μL 到 384 孔板的孔中。样品将分析重复为每个引物和cDNA样品组合。
5. 使用 P10（或更小）移液器，将 2 μL 的 cDNA 转移到要分析的每个引液集的重复井中。更换每个井后的小塞，以避免交叉污染。
6. 将粘合膜小心地涂在表面，确保覆盖所有孔，从而密封板。使用密封桨或滚轮按压薄膜以牢固密封。
7. 将板放在离心机中，用空板作为平衡。将板在 500 x g下离心 5 分钟。

9. 运行用于 qPCR 分析的热循环器

1. 打开计算机和实时 PCR 仪器。
2. 打开RT-qPCR软件并选择新的实验。
3. 在"设置"选项卡下，选择"实验属性"，其中可以设置运行参数。
4. 定义实验名称，它将设置用于存储结果的文件名和设置。
5. 对于"仪器选择"，选择将运行分析的当前连接的仪器。选择比较 CT （+Ct）运行方法。
6. 选择SYBR绿色试剂作为要使用的荧光DNA染料，选择标准作为斜坡速度。
7. 确保选中"包括熔体曲线"旁边的框。
8. 在"定义"选项卡下，指定目标（即要扩增的基因）和样本（即实验条件）。
9. 选择"分配"选项卡，将井标上适当的目标和样品，因为它们与 384 孔板的装载方案相对应。
10. 选择"运行方法"。使用参数进行分析 （表 3）。

	保持阶段		PCR 级		熔融曲线级
	步骤 1	步骤 2	步骤 1	步骤 2	步骤 1	步骤 2	步骤 3
临时	50 °C	95 °C	95 °C	60 °C	95 °C	60 °C	95 °C
时间	2:00	10:00	0:15	1:00	0:15	1:00	0:15
数据采集				是的			是的
循环数	1x		40 倍		1x

表3:热循环器的循环参数。

11. 将 384 孔板放入热循环器中并开始分析。

10. 使用增量-增量 Ct 方法分析 qPCR 结果 （2^-+Ct）

1. 分析 qPCR 反应产生的错误，以分析可能干扰下游分析的错误。系统会自动标记许多错误。
2. 对于构造正确的引体，熔体曲线应只有一个峰值。从进一步分析中排除任何含有具有多个峰的熔体曲线的油井。
3. 将 Ct 值导出到电子表格程序，以便使用 _Ct 方法分析数据。提供了建议的格式 （表 4）.最后一列是相对于控件样本的折叠表达式更改。

	家政基因 （GAPDH）			感兴趣的基因 （IL6）
	Ct1	Ct2	阿韦Ct	Ct1	Ct2	阿韦Ct	*Ct	Ave _Ct ctrls	•Ct	2°-（°Ct）	地理美恩
控制 1	15.33	15.37	15.35	26.81	26.91	26.86	11.51	10.51	1.00	0.50	1.00
控制 2	16.83	16.77	16.80	26.89	26.92	26.91	10.11	10.51	-0.41	1.33
控制 3	17.56	17.53	17.54	27.38	27.56	27.47	9.93	10.51	-0.59	1.50
Sl1344 1	15.50	15.41	15.45	22.15	22.13	22.14	6.69	10.51	-3.83	14.21	13.23
SL1344 2	16.02	15.98	16.00	23.01	22.96	22.98	6.98	10.51	-3.53	11.57
SL1344 3	17.27	17.30	17.28	23.99	23.98	23.98	6.70	10.51	-3.82	14.09
sipA sopB sopE2 1	15.38	15.41	15.39	23.31	23.09	23.20	7.80	10.51	-2.71	6.56	7.29
sipA sopB sopE2 2	16.01	16.05	16.03	23.89	23.92	23.91	7.88	10.51	-2.64	6.23
sipA sopB sopE2 3	16.78	16.78	16.78	24.02	24.06	24.04	7.27	10.51	-3.25	9.49
sipA sopB sopE2 sopE 1	15.52	15.60	15.56	27.04	27.03	27.03	11.47	10.51	0.96	0.51	0.79
sipA sopB sopE2 sopE 2	15.56	15.59	15.57	26.37	26.42	26.39	10.82	10.51	0.31	0.81
sipA sopB sopE2 sopE 3	15.91	15.92	15.91	26.24	26.12	26.18	10.27	10.51	-0.25	1.19

表 4:用于分析 qPCR 数据的格式。

结果

此处描述的测定侧重于使用NF-βB依赖性荧光酶报告器激活转录因子NF-βB，该重感酶可稳稳地转染成HeLa细胞系。激活的NF-βB转位到细胞核，其中结合目标基因的βB结合位点，包括亲炎细胞因子IL6和IL23。图1描述了NF-+B激活的概述。本研究使用革兰氏阴性细菌肠杆菌血清分型，作为NF-βB的活化剂和随后表达IL6（图2）。发病机制所需的主要毒性因子之一是允许S的III型分泌系统-1（T3SS-1）。Typhimurium 感染细胞并诱导 NF-βB 激活。T3SS-1的功能是将细菌蛋白（称为效应器）输送到宿主细胞中。在这里，效应蛋白针对许多细胞信号通路，以调解宿主上皮细胞的入侵。由 S诱导的 NF-+B 激活。Typhimurium主要依赖于T3SS-1效应蛋白SopE，SipA，SopB和SopE2^18。...

讨论

所述协议的主要贡献是，它提供了一种快速和简单的方法来检测细胞中的NF-βB激活，从而能够对影响NF-βB活化的多种刺激条件或药物进行高通量分析。在这里，我们描述了在沙门氏菌感染的HeLa细胞中NF-βB激活的协议。这些细胞可用于感染其他病原体，以及研究细菌感染对NF-βB活化的影响。此外，在HeLa 57A细胞中NF-βB依赖性荧光酶活化可用于筛选信号通路的活化剂或抑制剂，导致NF-βB激活。在这里，我们在48孔板中播种HeLa 57A细胞，但这些实验可以扩展到96孔甚至384孔的板，以便每个实验有更多的样本。HeLa 57A 细胞构成表达 LacZ，可作为使用 β-gal 测定法对细胞数和生存能力的内部控制进行测量。此处描述的协议适用于使用 NF-βB::luciferase 报告器构造的稳态或瞬态转染的细胞系。RAW264.7巨噬细胞系已经用于这样的目的^18。重要的是，此方法不区分五个不同的 NF-+B 子单位的不同同源/异构体的激活。不同的NF-β-B同质异构体复合物对启动子序列有不同的亲和力，以及不同的转录结果^21。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胶膜	VWR International	60941-070
氯仿	Fisher 生物试剂	C298-500
DMEM	Thermo Fisher	11665092
DNAse 处理试剂盒	Qiagen	79254
dNTPs	Promega	U1511
乙醇	Fisher 生物试剂	BP2818100	分子级
FBS	Sigma-Aldrich	F0926
HeLa 57A 细胞			Ref # 15
高容量 cDNA 逆转录试剂盒	Applied Biosystems	4368814
异丙醇	Fisher 生物试剂	BP26181
卡那霉素	Fisher 生物试剂	BP906-5
LB 琼脂	Fisher生物试剂	BP1425-500
溶原肉汤	Fisher 生物试剂	BP1426-500
MgCl2	Fisher 化学
NanoDrop ND-1000	Thermo Scientific		分光光度计
Promega 荧光素酶检测系统	Promega	E1501	细胞裂解缓冲液和荧光素底物
随机 Hexamers	Thermo Scientific	SO142
实时 GAPDH 正向引物			5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3'
实时 GAPDH 反向引物			5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3'
实时 IL-23 正向引物			5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3'
实时IL-23 反向引物			5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'
实时 IL-6 正向引物			5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'
实时 IL-6 反向引物			5'-CATGTCTCCTTTCAGG GCTG-3'
逆转录酶	Applied Biosystems	4308228
RNAse 抑制剂	ThermoScientific	EO0381
RT缓冲液	Promega	A3561
SL1344			Ref # 17
SL1344 ΔsipA sopB：：MudJ sopE2：:p SB1039			Ref # 18
SL1344 ΔsopE 和 Delta;sipA sopB：：MudJ sopE2：:p SB1039			Ref # 18
SYBR green	Applied Biosystems	4309155	2x 预混液
三试剂	分子研究中心	TR 118	硫氰酸胍
胰蛋白酶-EDTA	Thermo Fisher	25300054	0.05% 胰蛋白酶-EDTA
超纯水	Fisher Bio试剂
用于 PCR 的 BP248450 孔板	VWR International	89218-294	384 孔板