NF-κB依赖性荧光素酶激活及基因表达定量 沙门氏菌 感染的组织培养细胞

摘要

本文介绍一种快速简便的实验方案，通过检测细胞裂解液中的发光强度，来测定表达NF-κB::荧光素酶报告基因构建体的细胞系中活化B细胞核因子κ轻链增强子（NF-κB）的激活水平。此外，通过RT-qPCR检测鼠伤寒沙门菌（Salmonella Typhimurium）感染细胞后分离得到的基因表达水平。

摘要

二聚体转录因子 NF-κB 调控多种细胞应答通路，包括通过诱导多种细胞因子和趋化因子的表达来调节炎症通路。NF-κB 组成性表达，并由抑制性蛋白 B 细胞κ轻链多肽基因增强子的核因子抑制蛋白α（IκBα）在细胞质中隔离。NF-κB 的激活需要 IκBα 的降解，从而暴露 NF-κB 上的核定位信号，促进其向细胞核的转运。进入细胞核后，NF-κB 结合到其靶基因（如白细胞介素 6（IL-6）和 IL-23）的启动子区域，促进这些基因的表达。

NF-κB 的激活与转录或翻译过程无关。因此，必须通过特异性定量细胞核内的 NF-κB，或定量 NF-κB 靶基因的表达水平来检测其激活状态。在本实验方案中，采用体外组织培养技术，检测稳定转染了 NF-κB::luciferase 报告基因构建体的细胞中 NF-κB 的激活情况。这些细胞被鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）感染以激活 NF-κB，活化的 NF-κB 进入细胞核并结合到荧光素酶基因启动子区域的 κB 位点，从而诱导其表达。随后裂解细胞，并使用荧光素酶检测系统进行分析。细胞产生的荧光素酶量与发光信号强度成正比，该信号由酶标仪检测。本方法产生的发光信号提供了一种快速且高度敏感的手段，可用于在多种条件下评估 NF-κB 的激活水平。本方案还利用定量反转录 PCR（RT-qPCR）检测反映基因表达水平的相对 mRNA 含量。

引言

核因子-κB（NF-κB）蛋白家族是一类重要的转录激活因子，可调控多种生物通路中的基因表达。NF-κB的激活可诱导靶基因的转录，其中许多基因在免疫和炎症反应、细胞增殖、应激反应以及癌症进展中发挥重要作用^1,2。NF-κB在介导病原体清除相关的早期炎症反应中起着关键作用。鉴于NF-κB激活参与调控多种生物学过程，其信号通路的异常可能对健康和疾病产生严重后果。NF-κB信号通路的功能缺失突变与多种免疫缺陷表型相关，而功能获得性突变则与多种癌症相关，包括B细胞淋巴瘤和乳腺癌³。此外，许多病原体已被证实可通过表达毒力因子直接调控NF-κB的活化状态^4,5,6,7。

已知NF-κB的活化可由多种不同的刺激引发，包括细菌产物，如脂多糖（LPS）、鞭毛蛋白和肽聚糖，这些分子被称为病原体相关分子模式（PAMPs）。这些PAMPs可被模式识别受体（PRRs）识别，例如Toll样受体（TLRs）和Nod样受体（NLRs），从而导致NF-κB的活化，并继而诱导一系列NF-κB依赖性....

方案

1. 细胞传代与接种

1. 在37 °C、5% CO₂ 培养箱中，将HeLa 57A细胞培养于含10 mL添加5%热灭活胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）的75 cm²培养瓶中。
2. 吸除细胞培养液，加入1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液洗涤。吸除胰蛋白酶溶液后，再加入1 mL新鲜胰蛋白酶溶液，将培养瓶置于37 °C培养箱中孵育4–5分钟，使细胞从瓶壁脱落。
3. 加入9 mL细胞培养液，轻轻吹打培养瓶底部数次，使细胞充分悬浮，形成均一的细胞悬液。
4. 将HeLa 57A细胞按1:6或1:8比例用新鲜培养基稀释后接种至新的培养瓶中。当细胞融合度达到90%或每隔三天传代一次，并维持细胞融合度不低于25%。
5. 在细胞刺激前一天，用胰蛋白酶消化HeLa 57A细胞，重悬于10 mL生长培养基中。使用血细胞计数板对细胞悬液进行计数，并用生长培养基将细胞稀释至最终浓度为2.5 × 10⁵ 个细胞/mL，置于50 mL锥形管中。
6. 将250 µL细胞悬液（约6.25 × 10⁴ 个细胞）转移至48孔板的每个孔中。定期盖紧并翻转锥形管，确保细胞悬液均匀。轻轻敲击培养板侧面，使细胞在各孔中分布均匀。
7. 将培养板转移至37 °C、5% CO₂ 培养箱中，过夜培养，使细胞贴壁并生长。<....

结果

本文所述的检测方法聚焦于使用稳定转染了NF-κB依赖性荧光素酶报告系统的HeLa细胞系，以检测转录因子NF-κB的激活情况。活化的NF-κB会转位至细胞核，结合靶基因（包括促炎性细胞因子IL6和IL23）的κB结合位点。图1展示了NF-κB激活的总体示意图。本研究中采用革兰氏阴性菌Salmonella enterica血清型Typhimurium作为NF-κB的激活剂，并诱导IL6的表达（图2）。该菌致病所必需的主要毒力因子之一是III型分泌系统-1（T3SS-1），其使S. Typhimurium能够侵入细胞并诱导NF-κB的激活。T3SS-1的功能是将细菌蛋白（称为效应蛋白）递送至宿主细胞内。这些效应蛋白可靶向多种宿主细胞信号通路，介导宿主上皮细胞的侵袭。由S. Typhimurium诱导的NF-κB激活主要依赖于T3SS-1效应蛋白SopE、.......

讨论

本方案的主要贡献在于提供了一种快速、简便的细胞内NF-κB活化检测方法，可用于高通量分析多种刺激条件或影响NF-κB活化的药物。本文描述了沙门氏菌（Salmonella）感染HeLa细胞中NF-κB活化的实验方案。该细胞体系也可用于其他病原体的感染实验，以研究细菌感染对NF-κB活化的影响。此外，HeLa 57A细胞中NF-κB依赖性的荧光素酶活化可用于筛选诱导或抑制NF-κB活化信号通路的分子。本实验中，我们将HeLa 57A细胞接种于48孔板中，但该实验体系可扩展至96孔板甚至384孔板，以实现单次实验检测更多样本。HeLa 57A细胞组成型表达LacZ，可通过β-半乳糖苷酶（β-gal）检测法测定其活性，作为细胞数量和存活率的内参对照。本文所述方案适用于稳定或瞬时转染了NF-κB::luciferase报告基因构建体的细胞系。RAW264.7巨噬细胞系此前已用于类似研究¹⁸。需要强调的是，该方法无法区分五种不同NF-κB亚基所形成的同源或异源二聚体的活化状态。不同的NF-κB同源或异源二聚体复合物对启动子序列具有不同的亲和力，并产生不同的转录调控效应

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
粘附膜	VWR International	60941-070
氯仿	Fisher Bioreagents	C298-500
DMEM	赛默飞世尔科技	11665092
DNA酶处理试剂盒	Qiagen	79254
dNTPs	普洛麦格	U1511
乙醇	Fisher Bioreagents	BP2818100	分子级
FBS	Sigma-Aldrich	F0926
HeLa 57A 细胞			参考编号 15
高容量 cDNA 反转录试剂盒	应用生物系统公司	4368814
异丙醇	Fisher Bioreagents	BP26181
卡那霉素	Fisher Bioreagents	BP906-5
LB 琼脂	Fisher Bioreagents	BP1425-500
溶菌肉汤	Fisher Bioreagents	BP1426-500
MgCl₂2	Fisher Chemical
NanoDrop ND-1000	赛默飞世尔科技		分光光度计
Promega 萤光素酶检测系统	普洛麦格	E1501	细胞裂解缓冲液 &和荧光素底物
随机六聚体	赛默飞世尔科技	SO142
实时GAPDH正向引物			5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3'
实时GAPDH反向引物			5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3'
实时 IL-23 正向引物			5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3'
实时 IL-23 反向引物			5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'
实时 IL-6 正向引物			5'-GTAGCCGCCCCACACAGA-3'
实时 IL-6 反向引物			5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3'
逆转录酶	应用生物系统公司	4308228
RNase抑制剂	赛默飞世尔科技	EO0381
RT缓冲液	普洛麦格	A3561
SL1344			参考编号 17
SL1344 ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039			参考编号 18
SL1344 ΔsopE ΔsipA sopB::MudJ sopE2::pSB1039			参考编号 18
SYBR Green	应用生物系统公司	4309155	2x 预混液
三试剂	分子研究中心	TR 118	硫氰酸胍
胰蛋白酶-EDTA	赛默飞世尔科技	25300054	0.05% 胰蛋白酶-EDTA
超纯水	Fisher Bioreagents	BP248450
用于 PCR 的孔板	VWR International	89218-294	384孔板