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方法文章

利用人胚胎干细胞单细胞培养实现高效神经分化

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DOI：

10.3791/60571

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2020年1月18日

 ,  , 
1Immunity, Inflammation and Disease Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health, 2NIH Stem Cell Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

本文内容

摘要

本文介绍了一种人类胚胎干细胞单细胞培养及其后续分化为神经前体细胞的实验方案。该方案操作简便、稳定可靠、可扩展性强，适用于药物筛选和再生医学应用。

摘要

人类胚胎干细胞（hESCs）的体外分化已彻底改变了在生物学和分子水平上研究人类发育的能力，并为再生医学应用提供了细胞来源。传统的hESC培养方法依赖于集落型培养以维持hESCs的未分化状态，以及通过拟胚体（EB）和玫瑰花结结构形成来实现向不同胚层的分化，但这些方法效率低且耗时。本文介绍了一种采用单细胞培养方式替代集落型培养的hESC培养方法。该方法能够维持未分化hESCs的典型特征，包括hESC标志物的表达水平与集落型培养的hESCs相当。此外，本方案还提供了一种高效的由单细胞型hESCs生成神经前体细胞（NPC）的方法，可在1周内获得NPC。这些细胞高表达多种NPC标志基因，并可进一步分化为多种神经细胞类型，包括多巴胺能神经元和星形胶质细胞。这种hESC单细胞培养体系将有助于研究这些过程的分子机制、特定疾病的相关研究以及药物筛选。

引言

人类胚胎干细胞（hESCs）具有分化为三个主要胚层的潜能，这些胚层进一步分化为多种多能祖细胞谱系，最终产生人体内所有类型的细胞。体外hESC培养系统极大地提升了研究人类胚胎发育的能力，并为深入理解这些过程在生物学和分子水平上的调控机制提供了有力工具。同样，通过对来自患者体细胞重编程所获得的诱导性多能干细胞（iPSCs）进行研究，也为多种疾病机制提供了新的认识。此外，由hESCs衍生的祖细胞和分化细胞在干细胞治疗和药物筛选相关研究中也具有重要应用价值1,2,3,4。

人胚胎干细胞（hESCs）可被诱导分化为神经前体细胞（NPCs），这类细胞具有多向分化潜能和强大的自我更新能力。随后，这些细胞可进一步分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞5,6。NPCs 还为研究神经发育生物学及多种神经系统疾病提供了体外细胞模型。然而，目前涉及 hESCs 及其向 NPCs 分化的集落型培养方法效率较低，常需依赖共培养体系以及拟胚体（EB）和玫瑰花结结构的形成5,7,8,9。这些方案存活率较低，易发生自发性分化，且耗时较长。

本文展示了一种改进且稳健的培养体系，该体系易于扩增，并采用高密度的单细胞类型人胚胎干细胞（hESCs）培养10。在单细胞类型hESCs培养过程中，添加Rho激酶（ROCK）抑制剂显著提高了细胞存活效率10,11,12,13,14。在此培养体系中，hESCs可被轻松维持并扩增。此外，本方案提供了一种高效的方法，可从单细胞类型的hESCs培养中生成神经前体细胞（NPCs），从而获得高纯度的NPCs。使用ALK抑制剂抑制BMP/TGFβ/激活素信号通路，可有效诱导单细胞类型的hESCs向NPCs分化15,16，随后可进一步诱导其分化为功能性的神经谱系细胞，如多巴胺能神经元和星形胶质细胞。

总之，利用人胚胎干细胞（hESCs）的单细胞类型培养方案为研究这些细胞向包括神经前体细胞（NPCs）在内的多种谱系分化提供了一个理想的模型。该方案易于扩增，因此适用于为再生治疗和药物筛选相关研究提供细胞。

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方案

1. hESC 级基底膜基质包被培养板的制备

  1. 在 4 °C 下缓慢解冻适用于人胚胎干细胞的基底膜基质（见材料表）溶液，至少 2–3 小时或过夜，以避免形成凝胶。
  2. 为制备包被基底膜基质的培养板，用冷的 DMEM/F12 将基质稀释至终浓度为 2%。充分混匀后，每孔加入 1 mL 稀释后的基质溶液，覆盖 6 孔板的每个孔。
  3. 将包被了基底膜基质的培养板在室温（RT）孵育至少 3 小时，或在 4 °C 过夜。
    注意：包被基底膜基质的培养板可在 4 °C 保存 1 周，在使用前去除基质溶液即可。

2. 将集落型人胚胎干细胞适应为单细胞人胚胎干细胞培养

  1. 对于在基底膜基质上生长的无饲养层培养的 H9（WA09）人胚胎干细胞（hESC）集落型培养物，吸除孔中的培养基（图1A）9。
  2. 用 1 mL DPBS 洗涤一次。每孔加入 1 mL 分散酶溶液（1 U/mL），于 37 °C 孵育 20 分钟。
  3. 移除分散酶溶液，用 2 mL DMEM/F12 轻柔洗涤细胞一次，吸除培养基，然后每孔加入 2 mL DMEM/F12。
  4. 通过轻柔吹打使集落脱落，并转移至 15 mL 离心管中。
  5. 以 370 × g 离心 2 分钟，收集细胞沉淀，并吸除上清液。
  6. 为将细胞沉淀解离为单细胞，每管加入 2 mL 细胞解离溶液（1× 浓度，参见 材料表），于 37 °C 孵育 10 分钟。
  7. 以 370 × g 离心 2 分钟，移除解离溶液。
  8. 加入新鲜 mTeSR1 人 ESC 培养基，通过轻柔吹打将细胞解离为单细胞。
  9. 为使集落型 hESC 适应单细胞型培养，将约 1.5–2.0 × 106 个 hESC 接种至经基底膜基质包被的 6 孔板的每个孔中，每孔加入含 10 μM ROCK 抑制剂的 2 mL mTeSR1 培养基，培养 24 小时（图1A）。
  10. 24 小时后，更换为不含 ROCK 抑制剂的新鲜 mTeSR1 培养基，继续培养 hESC 使其以单细胞形式生长 3 天。每天更换培养基。
  11. 第 4 天，当细胞培养接近 100% 汇合时，用解离溶液将细胞解离，然后按照步骤 2.6 所述重新接种。
    注意：ROCK 抑制剂可提高单细胞型 hESC 培养最初 24 小时内的细胞存活率。

3. 胚状体形成及向三个胚层的分化（图2）

  1. 为形成拟胚体（EB），首先在最初24小时内，将细胞重悬于3 mL含10 μM ROCK抑制剂的mTeSR1培养基中，随后在37 °C培养箱中过夜孵育于60 mm低吸附培养皿中，以促进细胞聚集。
  2. 24小时后，将形成的较小拟胚体转移至15 mL离心管中。让拟胚体自然沉降至管底，用移液器小心吸去上清培养基。将拟胚体转移至EB培养基（即含20% Knockout血清替代物、1×谷氨酰胺补充剂[参见材料表]、1% NEAA[非必需氨基酸；参见材料表]和0.2% β-巯基乙醇的Knockout-DMEM）中，并在低吸附培养皿中继续培养7天。培养基可按上述方法每隔一天更换一次（图2A）。
  3. 第7天时，从培养皿中收集拟胚体并转移至15 mL离心管中。用移液器小心吸去上清液，将拟胚体转移至基底膜基质包被的6孔板中。
  4. 让拟胚体贴附于孔板表面，并在EB培养基中继续孵育12天，期间拟胚体将分化为三个胚层（图2B）。每隔一天更换一次培养基。
    注意：在细胞聚集过程中，使用低吸附培养皿有助于防止拟胚体过早贴壁。

4. 单细胞类型人胚胎干细胞向神经前体细胞的分化（图3）

  1. 为诱导NPC分化，使用1 mL解离液（1x）将单细胞类型的hESC解离，并在37 °C下孵育10分钟。
  2. 以370 × g离心2分钟，弃去解离液上清。加入1 mL DMEM/F12，通过轻柔吹打重悬细胞。
  3. 将细胞以2 × 105 个/孔的密度接种于基底膜基质包被的6孔板中，每孔加入含10 μM ROCK抑制剂的2 mL mTeSR1培养基。
  4. 24小时后，更换为神经诱导培养基（含1% B27（不含维生素A）的DMEM），并添加1 μM dorsomorphin和5 μM SB431542。
  5. 在神经诱导的前4天内每隔一天换液一次，之后每天换液，直至第7天达到汇合状态（图3B）。
    注意：(1) Dorsomorphin通过靶向ALK2、3、6受体抑制BMP通路，同时也能抑制AMPK；SB431542通过靶向ALK5、7抑制TGFβ/Activin通路。(2) 该方案已在另一株ESC系（WA01）中验证，结果与WA09相似16。(3) 我们通常使用Matrigel作为基底膜基质；然而，细胞也可在Geltrex上培养并分化为NPC，其结果非常相似，多种NPC标志物的表达情况可证明这一点（图4D,E）。Geltrex的处理方式应与Matrigel相同（见第1节）。

5. NPC 扩增与冷冻保存

  1. 神经诱导 7 天后，加入 1 mL 解离液（1x），在 37 °C 下孵育 10 分钟，使细胞解离。
  2. 在 370 × g 条件下离心细胞 2 分钟，弃去解离液上清。加入 1 mL NPC 扩增培养基（见材料表），通过轻柔吹打重悬细胞。
  3. 将 1 × 105 个细胞接种于 2 mL NPC 扩增培养基中，种植于基底膜基质包被的 6 孔板中。
  4. 当细胞培养接近 90% 汇合度时，根据需要多次传代 NPC。在前 3–4 次传代期间，初始 24 小时内加入 10 μM ROCK 抑制剂以防止细胞死亡。经过这些传代后，细胞可在无 ROCK 抑制剂的条件下进行传代和培养。扩增期间每两天更换一次培养基。
  5. 当细胞培养达到汇合状态时，进行 NPC 冻存。
    1. 冻存时，将细胞在 1 mL 解离液（1x）中于 37 °C 解离 5 分钟，然后在 370 × g 条件下离心 2 分钟，去除解离液。
    2. 将细胞冻存液（见材料表）加入解离后的 NPC 中，调整细胞密度为 1 × 106 个细胞/mL，并将 1 mL 分装至冻存管中。
    3. 将冻存管放入冻存盒中，于 -80 °C 冰箱中过夜保存。
  6. 将冻存管转移至液氮中长期保存。

6. 多聚-L-鸟氨酸（PLO）和层粘连蛋白包被培养板的制备

  1. 为制备多聚赖氨酸/层粘连蛋白（PLO/laminin）包被的培养板，将PLO储存液用PBS或水稀释至终浓度为10 μg/mL。充分混匀后，每孔加入1 mL稀释后的PLO溶液，包被6孔板的每个孔。
  2. 在37 °C孵育至少2小时，或在4 °C过夜孵育。
  3. 用PBS洗涤每个孔。
  4. 将层粘连蛋白（laminin）储存液用冷PBS或水稀释至10 μg/mL。充分混匀层粘连蛋白溶液。吸除PBS后，立即向每孔加入1 mL层粘连蛋白溶液进行包被。将培养板置于4 °C保存，并在1周内使用。使用前用PBS洗涤，并立即加入培养基。
    注意：切勿让PLO/层粘连蛋白包被的培养板干燥。

7. 人胚胎干细胞来源的神经前体细胞向多巴胺能神经元的分化（图6A）

  1. 以约50%的密度将神经前体细胞（NPCs）接种于多聚赖氨酸/层粘连蛋白包被的培养皿中，使用NPC扩增培养基进行培养。
  2. 24小时后，更换为DA1培养基（含2 mM谷氨酰胺补充剂、1×非必需氨基酸（NEAA）、1×B27补充剂、200 ng/mL SHH和100 ng/mL FGF8的Neurobasal培养基），之后每隔一天更换一次培养基。
  3. 当细胞培养物达到汇合状态时进行传代。加入1 mL解离液（1×），在37 °C孵育10分钟以解离细胞。
  4. 在370 × g 条件下离心2分钟，弃去解离液上清。加入1 mL DA1培养基，通过轻柔吹打重悬细胞。
  5. 将1 × 105个细胞接种至含2 mL DA1培养基的多聚赖氨酸/层粘连蛋白包被的6孔板中。
  6. 10天后，更换为DA2培养基（含2 mM谷氨酰胺补充剂、1×非必需氨基酸（NEAA）、1×B27补充剂、200 μM抗坏血酸、20 ng/mL BDNF和20 ng/mL GDNF的Neurobasal培养基），继续每隔一天换液，持续额外20天（图6A）。
    注意：需每日向DA2培养基中添加新鲜的抗坏血酸。在分化的前14天内，当细胞达到90%汇合度时应进行传代，但此后不再传代。

8. 将ESC来源的NPC分化为星形胶质细胞

  1. 将神经前体细胞以约50%的密度接种于PLO/层粘连蛋白包被的培养板中，并使用NPC扩增培养基进行培养。
  2. 24小时后，更换为星形胶质细胞培养基（DMEM/F12培养基，含1:100 N2、1:100 B27、200 ng/mL IGF、10 ng/mL activin A、10 ng/mL heregulin β-1和8 ng/mL bFGF），每隔一天更换一次培养基。
  3. 当细胞达到汇合状态时进行传代。加入1 mL解离溶液（1x），在37 °C孵育10分钟以解离细胞。
  4. 在370 x g条件下离心2分钟，弃去解离溶液上清。加入1 mL星形胶质细胞培养基，通过轻柔吹打重悬细胞。
  5. 将1 × 105个细胞接种于2 mL星形胶质细胞培养基中，置于PLO/层粘连蛋白包被的6孔板中。
  6. 继续诱导分化，总共培养5–6周（图6B）。

9. 免疫荧光染色

  1. 按照上述方法将细胞接种于35 mm μ-培养皿中进行培养。吸除培养基，每皿加入1 mL 4%多聚甲醛（PFA）溶液，室温孵育20分钟。
  2. 用PBS洗涤2次，每次5分钟。
    注意：细胞固定后，可将检测用培养皿用封口膜密封，并于4 °C保存。建议在固定后1周内进行抗体染色。
  3. 每皿加入300 μL封闭液（含山羊或驴血清的PBS），室温孵育30–60分钟。
  4. 用PBS洗涤培养皿2次，每次5分钟。
  5. 每皿加入300 μL一抗抗体溶液（见表1，用封闭液稀释），室温孵育1.5小时，或4 °C过夜。
  6. 用PBS洗涤2次，每次10分钟。
  7. 每皿加入300 μL荧光标记的二抗抗体溶液（见表1，用封闭液稀释），避光、室温孵育1小时。
  8. 用PBS洗涤细胞2次，每次10分钟。
  9. 加入Hoechst染色液（终浓度为1 μM，溶于PBS）以染色细胞核。避光、室温孵育5分钟。
  10. 用PBS洗涤细胞1次，每次5分钟，然后每皿加入500 μL PBS。将培养皿避光保存，随后使用共聚焦显微镜观察荧光信号（图2B、图5C、图6A和图7B）。

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结果

本文介绍了一种改进的人胚胎干细胞（hESCs）单细胞类型培养的维持与扩增方案，以及高效将其分化为神经前体细胞的方法。这些神经前体细胞可进一步分化为多种下游神经谱系细胞，包括多巴胺能神经元和星形胶质细胞。

代表性相差显微图像显示了在集落型人胚胎干细胞（hESCs）向单细胞型培养适应过程中不同阶段的细胞形态（图1A）。通过单细胞培养条件发现，适应后的hESCs能够在高密度下维持生长，并在达到汇合时被简便且高效地传代（图1A,B）。这些细胞保留了集落型hESCs典型的细胞周期特征（即较短的G1期和较高比例处于S期的细胞）（图1C,D）。定量RT-PCR和免疫染色分析表明，它们表达胚胎干细胞标志物（如OCT4、TRA 1-81、SOX2和NANOG）的水平与集落型hESCs相当（

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讨论

将人胚胎干细胞（hESCs）高效、可扩展地分化为各种谱系，并获得足够数量的分化细胞，是药物筛选和干细胞治疗的重要前提。已有多种单细胞传代方法被报道，这些方法通过在培养过程中添加ROCK抑制剂或其他小分子以提高细胞存活率，但这些培养方法最终获得的仍是集落型hESCs17,18,19,20,21。本单细胞ESC培养方案部分基于先前发表的方法19,20,21,22，可成功建立并维持单细胞型hESC培养，避免形成集落型hESC培养。该方案包括高密度单细胞接种、多细胞聚集...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢美国国家环境健康科学研究所（NIEHS）的 Carl D. Bortner 博士在 FACS 分析方面提供的帮助。本研究由美国国家环境健康科学研究所、美国国立卫生研究院的院内研究计划资助，项目编号为 Z01-ES-101585（AMJ）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
35 mm m-培养皿ibidi81156细胞培养皿
6孔板Corning3516
Accutase创新细胞技术AT104-500细胞解离液
激活素AR&D系统338-AC-050
抗坏血酸Sigma AldrichA4403
B27添加剂赛默飞世尔科技17504044
B27添加剂（-维生素A）赛默飞世尔科技12587010
BDNF应用生物材料Z100065
bFGFPeprotech100-18C
离心DAMON/ICE428-6759
CO2培养箱赛默飞世尔科技4110
Corning hESC-qualified Matrix（Matrigel）康宁354277基底膜基质（本实验方案大部分步骤中使用）
Cryostor CS 10Stemcell Technologies7930细胞冻存液
DispaseStemcell Technologies7923
DMEM赛默飞世尔科技10569-010
DMEM/F12赛默飞世尔科技10565-018
DorsomorphinTocris3093
EGFPeprotechAF-100-16A
胎牛血清Fisher ScientificSH3007003HI
FGF8应用生物材料Z101705
GDNF应用生物材料Z101057
Geltrex基质赛默飞世尔科技A1569601基底膜基质
GlutaMax赛默飞世尔科技35050061谷氨酰胺补充剂，100倍浓缩液
H9（WA09）人胚胎干细胞系WiCellWA09
Heregulin b-1Peprotech100-3
IGFPeprotech100-11
敲除DMEM赛默飞世尔科技10829018
无血清替代物赛默飞世尔科技10828028
层粘连蛋白Sigma AldrichL2020
mTeSR1Stemcell Technologies85850hESC 培养基
N2 补充剂赛默飞世尔科技17502001
非必需氨基酸赛默飞世尔科技11140050
Neurobasal赛默飞世尔科技21103049
聚-L-鸟氨酸Sigma AldrichP3655
ROCK抑制剂Tocris1254
SB431542Tocris1614
SHH应用生物材料Z200617
Stemdiff 神经祖细胞培养基Stemcell Technologies5833NPC扩增培养基

参考文献

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