利用人类胚胎干细胞的单细胞培养进行高效神经分化

摘要

这里介绍的是人类胚胎干细胞单细胞培养及其随后分化为神经祖细胞的一个方案。该协议简单、可靠、可扩展，适用于药物筛选和再生医学应用。

摘要

人类胚胎干细胞（hESCs）的体外分化改变了研究人体在生物学和分子水平上发育的能力，并为再生应用提供了用于再生的细胞。hESC 培养的标准方法使用菌落类型培养来保持未分化的 hESC 和胚胎体 （EB） 和玫瑰形形成，以分化成不同的胚层，效率低且耗时。此处介绍的是使用 hESC 而不是殖民地类型的区域性的单细胞培养方法。此方法允许维护未分化 hESC 的特征，包括与菌群类型 hESC 相媲美的 hESC 标记的表达。此外，该协议还提出了一种从单细胞型hESC生成神经祖细胞（NPC）的有效方法，在1周内产生NPC。这些细胞高度表达几个NPC标记基因，并可以分化成各种神经细胞类型，包括多巴胺能神经元和星形细胞。这种用于hESC的单细胞培养系统将有助于研究这些过程的分子机制、某些疾病的研究以及药物发现屏幕。

引言

人类胚胎干细胞（hESCs）有可能分化成三种主要生殖层，然后分化成各种多能的祖细胞系。这些血统随后引起人体的所有细胞类型。体外hESC培养系统已经改变了研究人类胚胎发育的能力，并已成为获得关于如何在生物和分子水平上对这些过程进行调控的新见解的宝贵工具。同样，从人类患者中分离出来的诱导多能干细胞（iPSCs）的研究提供了对各种疾病的新见解。此外，从hESCs衍生的祖细胞和分化细胞可用于干细胞治疗和药物筛选^{1、2、3、4}的研究。

hESCs 可以诱导分化成神经祖细胞 （NPC），这是具有广泛自我更新能力的多电位细胞。随后，这些细胞可以分化成神经元、星形细胞和寡核苷酸细胞^5，6。NPC还为神经发育生物学和各种神经系统疾病的体外研究提供了一个细胞系统。然而，目前涉及hESC及其分化为NPC的菌群培养方法效率不高，往往涉及共栽以及胚胎体（EB）和玫瑰花形成^{5、7、8、9。}这些协议表现出较低的存活率和自发分化，并且更耗时。

这里介绍的是一个改进和强大的培养系统，易于扩展，并使用高密度单细胞类型培养hESCs¹⁰。在hESC10、11、12、13、14的单细胞类型培养中，加入Roh-激酶（ROCK）抑制剂有助于显著提高生存效率。在此文化系统中，hESC 可以轻松维护和扩展。此外，该议定书还提出了一种从hESCs的单细胞类型培养物生成NPC的有效方法，它允许产生高度纯的NPC。 用ALK抑制剂抑制BMP/TGF+/activin信号通路，有效地诱导单细胞型hESC分化为^{NPC15、16，}然后可以诱导分化成功能神经谱系，如多巴胺能神经元和星形。

总之，使用hESCs的单细胞类型培养协议为研究这些细胞分化为包括NPC在内的各种谱系提供了一个有吸引力的模型。该协议易于扩展，因此适合生成细胞，用于涉及再生治疗和药物筛选的研究。

方案

1. 制备符合hESC资格的地下室膜基质涂层板

1. 在4°C下缓慢解冻hESC认证的基底膜基质（见材料表）溶液至少2~3小时或过夜，以避免形成凝胶。
2. 要制备基底膜基质涂层板，请将冷 DMEM/F12 中的基质稀释至 2% 的最终浓度。混合好，用1 mL的稀释基质溶液涂覆6孔板。
3. 在室温 （RT） 下孵育基质涂层板至少 3 小时或 4°C 过夜。
   注:在去除基质溶液和使用板之前，具有基底膜基质的板可在4°C下储存1周。

2. 对单细胞hESC培养的孔位型hESC的适应

1. 为了传递生长在基底膜基质上的菌落型H9型（WA09）hESC的无进给培养物，从井中吸出介质（图1A）9。
2. 用 1 mL DPBS 清洗 1 次。每口井加入1 mL的消口液（1 U/mL），在37°C下孵育20分钟。
3. 取出去巴塞，用 2 mL 的 DMEM/F12 轻轻清洗细胞 1x，取出介质，并将 2 mL 的 DMEM/F12 添加到每个板上。
4. 轻轻分离菌落，轻轻上下移液，并转移到15 mL管。
5. 在 370 x g下将颗粒离心 2 分钟，然后吸气培养基。
6. 要将细胞颗粒分离到单个细胞中，加入2 mL的细胞分离溶液（1x浓度，见材料表），并在37°C孵育10分钟。
7. 在370 x g下离心细胞2分钟，并去除分离溶液。
8. 加入新鲜的mTeSR1人类ESC培养基，通过上下轻柔移液，将细胞分离成单个细胞。
9. 为了使菌群型hESC适应单细胞类型培养，将大约1.5~2.0 x 10⁶ hESC的板板放入基底膜基质涂层的6孔板中，在2mL的mTeSR1中含有10μM ROCK抑制剂24小时（图1A）。
10. 24小时后，用不含ROCK抑制剂的新鲜mTeSR1替换hESC培养基，并允许hESC作为单细胞类型生长3天。每天更改媒体。
11. 在第4天，当培养物达到接近100%的汇合时，分离溶液中的细胞分离，然后重新进行重新板，如步骤2.6所述。
    注:ROCK抑制剂在单细胞型hESC培养的最初24小时期间提高细胞存活率。

3. 胚胎体形成和分化为三个胚芽层 （图 2）

1. 要形成BB，首先在3mL的mTeSR1培养基中用10μM ROCK抑制剂在10μM ROCK抑制剂中重新悬浮细胞，然后在37°C培养箱中孵育到60毫米低附着皿中，以便聚集。
2. 24 小时后，小型 OB 被转移到 15 mL 管中。让 IB 稳定到管的底部，用移液器轻轻取出介质。将EB培养基转移到EB培养基（敲除-DMEM补充20%敲除血清置换，1x谷氨酰胺补充剂[见材料表]，1%NEAA [非必需氨基酸;见材料表]，以及0.2%β-美尔卡托乙醇），并允许它们在低附着皿中膨胀7天。介质可以改每隔一天更换一次，如上所述（图2A）。
3. 第7天，从盘子中收集HB，并将其转移到15 mL管中。用移液器轻轻取出介质，并将 IB 转移到底膜基质涂层 6 孔板。
4. 允许EB附着在板上，在EB培养基中孵育12天，在此期间，它们将分化成三个胚芽层（图2B）。每隔一天更改一次媒体。
   注:在细胞聚集期间，低附着盘有助于避免EB附件。

4. 单单元型hESCs分化为NPC （图3）

1. 为了诱导NPC分化，分离单细胞型hESCs，分离1mL分离溶液（1x），并在37°C孵育10分钟。
2. 在370 x g下将细胞离心2分钟，并去除分离溶液上清液。加入 1 mL 的 DMEM/F12，并通过温和移液重新悬浮细胞。
3. 在含有10μM ROCK抑制剂的mTeSR1中，在2mL的mTeSR1中，以2 x 10⁵个单元/孔的密度在基底膜基质涂层6孔板的板单元。
4. 24小时后，用神经诱导培养基（DMEM，1%B27减去维生素A）替换培养基，辅以1μM多索替林和5μM SB431542。
5. 在神经感应的前4天每隔一天更换一次介质，然后每天直到第7天达到汇合（图3B）。
   注:（1） 多索霉素通过靶向ALK2，3，6受体抑制BMP通路，也抑制AMPK;SB431542 是 TGF®/Activin 通路抑制剂，以 ALK5，7 为目标。（2） 同一协议与另一个ESC线路（WA01）进行了测试，结果与WA09¹⁶相似。（3） 我们一般使用母凝胶作为基底膜基质;然而，细胞可以在Geltrex上培养，然后分化成NPC，结果与几个NPC标记的表达表明的非常相似（图4D，E）。以与母马瑞格尔相同的方式处理 Geltrex（参见第 1 节）。

5. NPC 扩展和冷冻保存

1. 经过7天的神经诱导后，用1mL分离溶液（1x）分离细胞，并在37°C孵育10分钟。
2. 在370 x g下将细胞离心2分钟，并去除分离溶液上清液。添加1 mL的NPC膨胀介质（见材料表），并通过温和的移液重新悬浮细胞。
3. 在基底膜基质涂层6孔板上，板1×10⁵单元在2mL的NPC膨胀介质中。
4. 当文化达到近90%的汇合时，根据需要多次通过NPC。在前3⁄4个通道中，在初始24小时内加入10μM ROCK抑制剂，以防止细胞死亡。在这些通道之后，细胞可以通过和培养没有ROCK抑制剂。在扩展过程中每隔一天更改一次介质。
5. 当文化达到汇合时，冷冻保存 NPC。
   1. 对于冷冻保存，在1mL的分离溶液（1x）中分离细胞在37°C下5分钟，然后离心悬浮2分钟，在370 x g下去除分离溶液。
   2. 在1 x10⁶细胞/mL处向分离的NPC添加细胞冻结溶液（见材料表），并将1mL等分分分分给冷冻体。
   3. 将冷冻室放入冷冻容器中，并放在-80°C冷冻箱中过夜。
6. 将冷冻液储存在液氮中。

6. 制备聚L-球质（PLO）和拉米宁涂层板

1. 要制备 PLO/层宁涂层板，将 PLO 库存溶液稀释到 PBS 或水中，最终浓度为 10 μg/mL。混合好，用1 mL的稀释PLO溶液涂抹6孔板的每口井。
2. 在37°C下孵育至少2小时，或在4°C下孵育过夜。
3. 用 PBS 清洗每个井。
4. 在冷PBS或10μg/mL的水中稀释拉米宁库存溶液。混合拉米宁溶液。取出 PBS 并立即用 1 mL 的层压溶液覆盖每个井。将板保持在 4°C，并在 1 周内使用。用 PBS 清洗并立即添加培养基。
   注:不要让 PLO/层膜涂层板干燥。

7. hESC衍生的NPC分化为多巴胺能神经元 （图6A）

1. 在NPC膨胀介质中，在PLO/层膜涂层的皿中，在密度约为50%的板NPC。
2. 24小时后，将培养基更改为DA1介质（含有2mM谷氨酰胺补充剂的神经基培养基，1x NEAA，1x B27，200纳克/mL SHH和100纳克/mL FGF8），每隔一天更换一次该介质。
3. 传递文化，当他们到达汇合。分离细胞与1mL分离溶液（1x），并在37°C孵育10分钟。
4. 在370 x g下将细胞离心2分钟，并去除分离溶液上清液。加入 1 mL 的 DA1 介质，通过温和移液重新悬浮细胞。
5. 在 PLO/层宁涂层 6 孔板上，在 2 mL 的 DA1 介质中为 1 x 10⁵个单元进行板。
6. 10天后，改用DA2介质（含有2mM谷氨酰胺补充剂的神经碱培养基，1x NEAA，1x B27，200 μM抗坏血酸，20纳克/mL BDNF和20纳克/mL GNDF），每隔一天更换一次培养基，再延长20天（图6A）。
   注:每天向DA2介质中添加新鲜的抗坏血酸。在最初的14天内，分化的细胞在达到90%的汇合时应通过，但之后不再通过。

8. ESC衍生NPC分化为星形细胞

1. 在NPC膨胀介质中的PLO/层宁涂层板上的板神经祖细胞，密度约为50%。
2. 24小时后，将介质更改为星形介质（DMEM/F12介质包括1:100 N2、1:100 B27、200纳克/mL IGF、10纳克/mL活动A、10纳克/mL heregulinβ-1和8纳克/mL bFGF），每隔一天更换一次介质。
3. 传递文化，当他们到达汇合。分离细胞与1mL分离溶液（1x），并在37°C孵育10分钟。
4. 在370 x g下将细胞离心2分钟，并去除分离溶液上清液。加入1 mL的星形细胞介质，通过温和的移液重新悬浮细胞。
5. 在 PLO/层宁涂层 6 孔盘上，在 2 mL 的星形细胞介质中盘 1 x 10⁵细胞。
6. 允许区分持续 5-6 周（图 6B）。

9. 免疫荧光染色

1. 培养细胞在35毫米μ--碟，如上所述，每个细胞类型。吸气介质，每盘加入1 mL 4%PFA溶液，在RT孵育20分钟。
2. 用 PBS 洗涤 2 次 5 分钟。
   注:一旦细胞固定，测定板可以用准膜密封，并储存在4°C。在固定后1周内与抗体染色。
3. 每盘加入300μL的阻断溶液（PBS中的山羊或驴血清），在RT孵育30~60分钟。
4. 用PBS洗碗2次5分钟。
5. 加入300 μL原发抗体（表1）溶液（在阻断溶液中稀释），在RT孵育1.5小时或在4°C下孵育过夜。
6. 用 PBS 清洗 2 次，10 分钟。
7. 在阻断溶液中加入300 μL荧光结合二级抗体（表1），在RT下在黑暗中孵育1小时。
8. 用PBS清洗细胞2次2次10分钟。
9. 将Hoechst染色溶液（PBS中的1μM最终浓度）加入染色核。在黑暗中孵育细胞5分钟在RT。
10. 用PBS清洗细胞1x5分钟，然后加入500μL的PBS。将盘子放在黑暗中，然后用共聚焦显微镜观察荧光（图2B，图5C，图6A和图7B）。

结果

这里介绍的是一个改进的协议，用于维护和扩展hESC的单细胞类型培养及其有效分化为神经祖细胞，后者随后分化成各种下游神经谱系，包括多巴胺能神经元和星形细胞。

代表性相位对比图像显示细胞形态在适应单细胞类型培养过程中不同步骤的细胞形态（图1A）。通过单细胞培养条件，发现适应的hESC能够维持在高密度，然后在达到汇合时轻松有效地亚培养（图1A，B）。这些细胞保留了菌落型hESCs的典型细胞周期特征（即短G1相和S相中高比例的细胞）（图1C，D）。他们还表示ESC标记（即OCT4、TRA 1-81、SOX2和NANOG），其水平与QRT-PCR和免疫染色分析所示的菌群类型hESC水平相当（图7，表2）。此外，研究表明，单...

讨论

将hESCs分化成各种谱系和产生足够数量的分化细胞的可扩展和有效方法是药物筛选和干细胞治疗的重要标准。已经发表了各种单细胞传递方法，其中细胞在ROCK抑制剂或其他小分子的存在下培养，以提高存活率，但这些培养方法的最终产物是菌群型hESCs17，18，19，20，21。单细胞ESC协议部分基于先前公布的方法^{19、20、21、22，}成功生成和维护单细胞型hESC培养，并防止菌群型hESC培养。它包括高密度单细胞电镀、多细胞关联、单层生长和高效亚培养（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm m-dishes	ibidi	81156	细胞培养皿
6 孔板	康宁	3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104-500	细胞分离溶液
激活素 A	R&D 系统	338-AC-050
抗坏血酸	Sigma Aldrich	A4403
B27 补充剂	Thermo Fisher	17504044
B27 补充剂 （-维生素 A）	Thermo Fisher	12587010
BDNF	应用生物材料	Z100065
bFGF	Peprotech	100-18C
离心机	DAMON/ICE	428-6759
CO2 培养箱	Thermo Fisher	4110
康宁 hESC qulified 基质 （Magrigel）	康宁	354277	基底膜基质（用于此处的大部分方案）
低温储存器 CS 10	Stemcell Technologies	7930	细胞冷冻液
Dispase	Stemcell Technologies	7923
DMEM	Thermo Fisher	10569-010
DMEM/F12	Thermo Fisher	10565-018
Dorsomorphin	Tocris	3093
EGF	Peprotech	AF-100-16A
胎牛血清	Fisher Scientific	SH3007003HI
FGF8	应用生物材料	Z101705
GDNF	应用生物材料	Z101057
Geltrex 基质	Thermo Fisher	A1569601	基底膜基质
GlutaMax	Thermo Fisher	35050061	谷氨酰胺补充剂，100X
H9 （WA09） 人胚胎干细胞系	WiCell	WA09
Heregulin b-1	Peprotech	100-3
IGF	Peprotech	100-11
敲除 DMEM，Thermo	Fisher	10829018
Knockout 血清替代物，	Thermo Fisher	10828028
层粘连蛋白	Sigma Aldrich	L2020
mTeSR1	Stemcell Technologies	85850	hESC 培养基
N2 补充剂	Thermo Fisher	17502001
NEAA	Thermo Fisher	11140050
Neurobasal	Thermo Fisher	21103049
Poly-L-鸟氨酸	Sigma Aldrich	P3655
ROCK 抑制剂	Tocris	1254
SB431542	Tocris	1614
SHH	应用生物材料	Z200617
Stemdiff 神经祖细胞培养基	Stemcell Technologies	5833	NPC 扩增培养基