利用人类胚胎干细胞的单细胞培养进行高效神经分化

Summary

这里介绍的是人类胚胎干细胞单细胞培养及其随后分化为神经祖细胞的一个方案。该协议简单、可靠、可扩展，适用于药物筛选和再生医学应用。

Abstract

人类胚胎干细胞（hESCs）的体外分化改变了研究人体在生物学和分子水平上发育的能力，并为再生应用提供了用于再生的细胞。hESC 培养的标准方法使用菌落类型培养来保持未分化的 hESC 和胚胎体 （EB） 和玫瑰形形成，以分化成不同的胚层，效率低且耗时。此处介绍的是使用 hESC 而不是殖民地类型的区域性的单细胞培养方法。此方法允许维护未分化 hESC 的特征，包括与菌群类型 hESC 相媲美的 hESC 标记的表达。此外，该协议还提出了一种从单细胞型hESC生成神经祖细胞（NPC）的有效方法，在1周内产生NPC。这些细胞高度表达几个NPC标记基因，并可以分化成各种神经细胞类型，包括多巴胺能神经元和星形细胞。这种用于hESC的单细胞培养系统将有助于研究这些过程的分子机制、某些疾病的研究以及药物发现屏幕。

Introduction

人类胚胎干细胞（hESCs）有可能分化成三种主要生殖层，然后分化成各种多能的祖细胞系。这些血统随后引起人体的所有细胞类型。体外hESC培养系统已经改变了研究人类胚胎发育的能力，并已成为获得关于如何在生物和分子水平上对这些过程进行调控的新见解的宝贵工具。同样，从人类患者中分离出来的诱导多能干细胞（iPSCs）的研究提供了对各种疾病的新见解。此外，从hESCs衍生的祖细胞和分化细胞可用于干细胞治疗和药物筛选^{1、2、3、4}的研究。

hESCs 可以诱导分化成神经祖细胞 （NPC），这是具有广泛自我更新能力的多电位细胞。随后，这些细胞可以分化成神经元、星形细胞和寡核苷酸细胞^5，6。NPC还为神经发育生物学和各种神经系统疾病的体外研究提供了一个细胞系统。然而，目前涉及hESC及其分化为NPC的菌群培养方法效率不高，往往涉及共栽以及胚胎体（EB）和玫瑰花形成^{5、7、8、9。}

Protocol

1. 制备符合hESC资格的地下室膜基质涂层板

1. 在4°C下缓慢解冻hESC认证的基底膜基质（见材料表）溶液至少2~3小时或过夜，以避免形成凝胶。
2. 要制备基底膜基质涂层板，请将冷 DMEM/F12 中的基质稀释至 2% 的最终浓度。混合好，用1 mL的稀释基质溶液涂覆6孔板。
3. 在室温 （RT） 下孵育基质涂层板至少 3 小时或 4°C 过夜。
   注:在去除基质溶液和使用板之前，具有基底膜基质的板可在4°C下储存1周。

2. 对单细胞hESC培养的孔位型hESC的适应

1. 为了传递生长在基底膜基质上的菌落型H9型（WA09）hESC的无进给培养物，从井中吸出介质（图1A）9。
2. 用 1 mL DPBS 清洗 1 次。每口井加入1 mL的消口液（1 U/mL），在37°C下孵育20分钟。
3. 取出去巴塞，用 2 mL 的 DMEM/F12 轻轻清洗细胞 1x，取出介质，并将 2 mL 的 DMEM/F12 添加到每个板上。
4. 轻轻分离菌落，轻轻上下移液，并转移到15 mL管。
5. 在 370 x g下将颗粒离心 2 分钟，然后吸气培养....

Results

这里介绍的是一个改进的协议，用于维护和扩展hESC的单细胞类型培养及其有效分化为神经祖细胞，后者随后分化成各种下游神经谱系，包括多巴胺能神经元和星形细胞。

代表性相位对比图像显示细胞形态在适应单细胞类型培养过程中不同步骤的细胞形态（图1A）。通过单细胞培养条件，发现适应的hESC能够维持在高密度，然后在达到汇合时轻松有效地亚培养（图1A，B）。这些细胞保留了菌落型hESCs的典型细胞周期特征（即短G1相和S相中高比例的细胞）（图1C，D）。他们还表示ESC标记（即OCT4、TRA 1-81、SOX2和NANOG），其水平与QRT-PCR和免疫染色分析所示的菌群类型hESC水平相当（图7，表2）。此外，研究表明，单.......

Discussion

将hESCs分化成各种谱系和产生足够数量的分化细胞的可扩展和有效方法是药物筛选和干细胞治疗的重要标准。已经发表了各种单细胞传递方法，其中细胞在ROCK抑制剂或其他小分子的存在下培养，以提高存活率，但这些培养方法的最终产物是菌群型hESCs17，18，19，20，21。单细胞ESC协议部分基于先前公布的方法^{19、20、21、22，}成功生成和维护单细胞型hESC培养，并防止菌群型hESC培养。它包括高密度单细胞电镀、多细胞关联、单层生长和高效亚培养（

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm m-dishes	ibidi	81156	细胞培养皿
6 孔板	康宁	3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104-500	细胞分离溶液
激活素 A	R&D 系统	338-AC-050
抗坏血酸	Sigma Aldrich	A4403
B27 补充剂	Thermo Fisher	17504044
B27 补充剂 （-维生素 A）	Thermo Fisher	12587010
BDNF	应用生物材料	Z100065
bFGF	Peprotech	100-18C
离心机	DAMON/ICE	428-6759
CO2 培养箱	Thermo Fisher	4110
康宁 hESC qulified 基质 （Magrigel）	康宁	354277	基底膜基质（用于此处的大部分方案）
低温储存器 CS 10	Stemcell Technologies	7930	细胞冷冻液
Dispase	Stemcell Technologies	7923
DMEM	Thermo Fisher	10569-010
DMEM/F12	Thermo Fisher	10565-018
Dorsomorphin	Tocris	3093
EGF	Peprotech	AF-100-16A
胎牛血清	Fisher Scientific	SH3007003HI
FGF8	应用生物材料	Z101705
GDNF	应用生物材料	Z101057
Geltrex 基质	Thermo Fisher	A1569601	基底膜基质
GlutaMax	Thermo Fisher	35050061	谷氨酰胺补充剂，100X
H9 （WA09） 人胚胎干细胞系	WiCell	WA09
Heregulin b-1	Peprotech	100-3
IGF	Peprotech	100-11
敲除 DMEM，Thermo	Fisher	10829018
Knockout 血清替代物，	Thermo Fisher	10828028
层粘连蛋白	Sigma Aldrich	L2020
mTeSR1	Stemcell Technologies	85850	hESC 培养基
N2 补充剂	Thermo Fisher	17502001
NEAA	Thermo Fisher	11140050
Neurobasal	Thermo Fisher	21103049
Poly-L-鸟氨酸	Sigma Aldrich	P3655
ROCK 抑制剂	Tocris	1254
SB431542	Tocris	1614
SHH	应用生物材料	Z200617
Stemdiff 神经祖细胞培养基	Stemcell Technologies	5833	NPC 扩增培养基