中国仓鼠卵巢细胞培养中高通量自动化微生物反应器工艺优化

Summary

在这里，我们提出了一个详细的过程，在自动化的微生物反应器中运行实验设计，然后使用蛋白质A柱进行细胞收获和蛋白质定量。

Abstract

优化生物工艺，提高所需产品的产量，在生物制药行业具有重要意义。这可以通过菌株选择和开发生物工艺参数来实现。摇瓶已用于此目的。然而，它们缺乏控制过程参数的能力，如pH值和溶解氧 （DO）。在自动化微生物反应器的帮助下，可以克服这一限制。这些生物反应器模仿大规模种植。该系统的主要优点之一是实验设计（DOE）在软件中集成。这种集成可以建立一个可以同时改变多个过程参数的设计。可在软件内分析关键工艺参数和最佳生物工艺条件。此处介绍的工作重点是向用户介绍软件中过程设计所涉及的步骤，并将 DOE 纳入培养运行中。

Introduction

2018年全球生物制药市场价值超过2500亿美元，并不断扩大^1.制药公司正在从生产小分子药物转向生物技术产生的治疗药物，如重组蛋白。仅此一项，收入就超过1500^亿美元。哺乳动物细胞现在广泛用于这些药物重组蛋白的产生。在目前68种经批准的哺乳动物细胞产品中，有57种是由中国仓鼠卵巢细胞^（CHO）2产生的。CHO细胞专门用于生产需要翻译后修饰的重组蛋白。这些细胞是首选，因为它们生长在悬浮液中，从而在无血清化学定义的介质^33，44中产生可重复的结果。使用CHO细胞的另一个优点是，该产品的甘油结构类似于人类单克隆抗体（mAb），由于基因扩增^5，导致重组蛋白产量和特定生产力提高。

重组性CHO（rCHO）细胞培养的产量在过去二十年中增加了一百倍。这一改进归功于工艺参数的优化、喂养策略以及血清无化学定义的介质⁶的开发。随着药品需求的增加，生产过程发展的成本和时间效率的压力^增加7.为了减轻压力，同时保证产品质量，制药行业的重点已转向设计质量 （QbD）。QbD 用于了解产品生产和流程。ObD....

Protocol

1. 前培养程序

注:重组性CHO DG44细胞，其活细胞浓度为1 x 10⁷细胞/mL用于此协议。

1. 将含有1.2 mL细胞的小瓶解冻至室温，并立即将细胞悬浮液转移到含有10 mL冷种子介质的15 mL锥形离心管中。
2. 在 190 x g和室温下使圆锥式离心管离心 5 分钟，并丢弃上清液。
3. 将150mL的种子介质预热至36.8°C。
4. 轻轻地将细胞颗粒悬浮在10 mL的预加热种子介质中，并将细胞转移到奶瓶中。
5. 使用烧瓶中的 1 mL 样品测量使用细胞计数器的初始 VCC 和可行性。
   注:解冻后，成功栽培的生存能力应高于70%。
6. 在36.8°C和7.5%CO₂下，以120 rpm的振动速率将摇瓶孵育在轨道摇床（振动器直径为19毫米）中。
   注:这些条件因细胞应变和介质而异。
7. 通过细胞三天后，从摇摇器中取出摇瓶，并将其放在层压流柜下。采集1 mL样品以测量最终细胞浓度。计算要转移到新鲜预热种子介质的体积，使新通道中的初始细胞浓度为 2 x 10⁵细胞/mL。
8. 在转移到生物反应器进行主要培养之前，共通过细胞5次。

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Results

图2概述了本研究中进行的栽培情况。

图2:在培养站中测试pH和搅拌器速度曲线的实验条件的原理图表示。该图还表示放置船只的正确布局。请点击此处查看此图形的较大版本。

自动化微生物反应器中的细胞生长与多用途生物反应器相当。如图3所示。比较了三个不同尺度的细胞浓度，观察到15mL自动微生物反应器模仿2升玻璃生物反应器。摇瓶的结果也比较，以显示AMBR的好处。

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Discussion

优化工艺，提高产量，对生物制药行业至关重要。摇瓶可能用于菌株的筛选;但是，在烧瓶中不监视过程参数（如 pH 和 DO）。微生物反应器具有优势，因为它们允许对过程进行持续监测和控制。微生物反应器中的这些控制回路也提供了与更大规模类似的条件，因此，其结果可与较大规模的生物反应器相媲美。微生物反应器的另一个优点是，与台式生物反应器相比，在时间和人工^方面,，可以在相同的时间范围内以更低的成本测试多种^条件。由于基板数量减少，并行操作空间要求减少，较小的尺寸也有利于降低运行成本;然而，必须考虑这些容器的成本，因为与台顶多用途生物反应器相比，在单次使用微生物反应器中进行栽培可能更昂贵。

虽然该系统有几个优点，但使用微生物反应器有几个相当大的缺点。可以在一个培养站内更改每个容器的 pHH 和 DO;但是，单个容器的搅拌器速度和温度不能改变。这增加了为建立最佳搅拌器速度和温度而进行的实验次数。在线测量仅限于 pH 和 DO。关键过程参数（CPP）的实时过程监控（如温度、pH、DO）将.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL 一次性移液器吸头，灭菌	Sartorius Stedim Biotech GmbH	A-0040
200 mM L-谷氨酰胺	Corning，Merck	25-005-CV
24 孔深孔板	Sartorius Stedim Biotech GmbH	A-0038
5 mL 一次性移液器吸头，灭菌	Sartorius Stedim Biotech GmbH	A-0039
ambr 15 自动微生物反应器系统	Sartorius Stedim Biotech GmbH	001-2804
ambr 15 细胞培养物 24 一次性生物反应器 - Spraged	Sartorius Stedim Biotech GmbH	001-1B86
消泡剂 C 乳液	Sigma-Aldrich， Merck	A8011
瓶顶无菌过滤器	Corning， Merck	CLS431474	0.1 μm 孔径
CEDEX 洗涤剂（3% 粘液醇）	Roche Innovatis AG	05-650-658-001
细胞计数器	Roche Innovatis AG	05-650-216-001	CEDEX HiRes
CHO DG44 细胞系	Cellca， Sartorius Stedim Biotech GmbH
CHOKO 补料培养基 A （FMA）	Sigma-Aldrich， 默克	CR80025
CHOKO 补料培养基 B （FMB）	Sigma-Aldrich，Merck	CR80026
CHOKO 生产培养基	Sigma-Aldrich， Merck	CR80027
CHOKO 原种培养物 Meium	Sigma-Aldrich， Merck	CR80028
Chromaster 高压液相色谱系统	VWR International
锥形离心管	Corning， Merck	SIAL0790
Ethanol	Merck
甘氨酸	Carl Roth	56-40-6
HPLC 样品瓶	VWR International	SUPLSU860181
PBS	Sigma-Aldrich，Merck	P4417
Protein A 色谱柱	Thermo Fisher Scientific	1502226	POROS™一个 1.7 mL
氯化钠	Sigma-Aldrich，Merck	7647-14-5
氢二钠 无水	Sigma-Aldrich，Merck	7558-79-4
台盼蓝	VWR 国际	VWRVK940
YSI	YSI Inc	2900D	YSI 2900 Select