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方法文章

利用高通量自动微型生物反应器优化中国仓鼠卵巢细胞培养工艺

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⸱

DOI：

10.3791/60577

⸱

2020年5月18日

 ,  ,  , 
1Institute for Technical Chemistry, Gottfried-Wilhelm-Leibniz Universität Hannover

本文内容

摘要

本文介绍了一种在自动化微型生物反应器中进行实验设计，随后通过蛋白A柱进行细胞收获和蛋白质定量的详细操作流程。

摘要

优化生物工艺以提高目标产物的产量在生物制药行业中具有重要意义。这可以通过菌株筛选和优化生物工艺参数来实现。摇瓶已被用于此目的，但其无法控制pH值和溶解氧（DO）等工艺参数。该局限性可通过使用自动化微型生物反应器得以克服。这些生物反应器可模拟更大规模的培养过程。该系统的主要优势之一是将实验设计（DOE）集成于软件之中。此集成功能可建立一种实验方案，使多个工艺参数能够同时变化，并可在软件内分析关键工艺参数及最优生物工艺条件。本文所展示工作的重点是向用户介绍在软件中进行工艺设计的步骤，以及在培养运行过程中整合DOE的方法。

引言

2018年，全球生物制药市场的价值超过2500亿美元，并持续扩大1。制药公司正逐步从生产小分子药物转向生物技术生产的治疗性产品，例如重组蛋白。仅重组蛋白一项就带来了超过1500亿美元的收入1。目前，哺乳动物细胞被广泛用于生产这类药用重组蛋白。在已获批的68种由哺乳动物细胞生产的药物中，有57种由中华仓鼠卵巢细胞（CHO）生产2。CHO细胞特别适用于需要翻译后修饰的重组蛋白的生产。由于CHO细胞可在悬浮培养中生长，因此可在无血清且化学成分明确的培养基中实现可重复的实验结果，这是其被优先选用的原因之一3,4。使用CHO细胞的另一优势在于，其产物的糖链结构与人源单克隆抗体（mAb）相似，且由于基因扩增，可获得更高的重组蛋白产量和特异性生产率5。

过去二十年中，重组CHO（rCHO）细胞培养的产量已提高了近百倍。这一进步归因于工艺参数的优化、补料策略的改进以及无血清化学成分明确培养基的开发6。随着对药品需求的不断增加，药品生产工艺在成本和时间效率方面面临更大压力7。为了在确保产品质量的同时减轻这种压力，制药行业已将重点转向“质量源于设计”（Quality by Design，QbD）。QbD有助于深入理解产品生产及其工艺过程。在QbD中使用的一项关键工具是实验设计（Design of Experiment，DOE）。该方法通过揭示各种输入变量与输出结果之间的关系，提升对工艺过程的理解。在项目早期阶段应用DOE方法优化生物工艺，有助于整合工艺条件，并提高产物的滴度数量与质量。与传统的“一次改变一个因素”（one-factor-at-a-time，OFAT）策略相比，该方法具有显著优势。采用经典法、Shainin法或田口法（Taguchi）等统计学方法进行DOE，其效果远优于OFAT8。

过程和培养基优化可在摇瓶中进行。摇瓶相对便宜，但无法控制温度、pH值和溶解氧（DO）等参数。为克服这些缺点，可使用工作体积为0.5 L至5 L的可重复使用台式生物反应器。这类反应器可实现广泛的在线监测和过程控制。然而，可重复使用生物反应器的使用较为耗时且劳动强度大。为了克服这些不足，现采用一种新型的一次性生物反应器，它结合了台式生物反应器全面的过程监测能力和摇瓶的简便操作特性。高通量筛选系统与一次性技术的应用显著提高了工艺性能与开发效率9。

本文列出了在自动微型生物反应器（AMBR）软件中加载实验方案的操作指南。本实验研究了不同搅拌速度和pH值对活细胞浓度（VCC）和滴度的影响。实验结果与数据分析采用实验设计软件MODDE 12进行。产品分析采用配备Protein A柱的高效液相色谱（HPLC）系统进行，其原理基于单克隆抗体（mAb）的Fc区与Protein A具有高亲和力10,11。利用该方法可实现对mAb的鉴定与定量，定量依据为在280 nm处测得的洗脱峰面积。

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方案

1. 预培养步骤

注意：本实验方案使用活细胞浓度为 1 x 107 个细胞/mL 的重组 CHO DG44 细胞。

  1. 将含有 1.2 mL 细胞的冻存管置于室温下解冻，并立即把细胞悬液转移至含有 10 mL 冷却的种子培养基的 15 mL 圆锥形离心管中。
  2. 在室温下以 190 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
  3. 在 500 mL 摇瓶中预热 150 mL 种子培养基至 36.8 °C。
  4. 用 10 mL 预热的种子培养基轻柔重悬细胞沉淀，并将细胞转移至摇瓶中。
  5. 从摇瓶中取 1 mL 样品，使用细胞计数仪测定初始活细胞浓度（VCC）和细胞活力。
    注意：解冻后细胞活力应高于 70%，以确保培养成功。
  6. 将摇瓶置于轨道摇床（摇床直径 19 mm）中，在 36.8 °C、7.5% CO2 条件下以 120 rpm 振荡培养。
    注意：这些条件根据细胞株和培养基的不同可能有所变化。
  7. 传代培养三天后，从摇床上取出摇瓶并置于超净工作台内。取 1 mL 样品测定最终细胞浓度。根据测定结果计算需转移至新鲜预热种子培养基中的体积，使新传代培养的初始细胞浓度为 2 × 105 个细胞/mL。
  8. 在转移至生物反应器进行主培养前，共需完成 5 次细胞传代。

2. 主要培养

  1. 测定种子培养物的最终细胞浓度。计算需转移至生物反应器中的体积，使反应器中的初始细胞浓度为 3 x 105 个细胞/mL。
  2. 在接种前一天用生产培养基填充反应器，以平衡反应器，并设定温度、pH 和溶氧（DO）等工艺参数。
    注意： 培养条件为 36.8 °C 和 60% 溶氧浓度（DO）。我们测试了 1050 rpm 和 1300 rpm 的搅拌速度，以及 pH 6.9、7.1 和 7.3。培养总时长为 12 天，直至收获细胞。批次培养运行 72 小时后，每隔 24 小时添加一次补料培养基。培养所用的具体操作方案详见下一部分。

3. 在自动化微型生物反应器软件中编写实验方案

注意：在 AMBR 细胞培养软件中编写配方有两种方法：一种是使用向导创建，另一种是手动添加每一步骤。本实验方案以使用向导的操作步骤为例进行说明。

  1. 创建新实验
    1. 打开 AMBR 细胞培养软件，在 介绍 选项卡中点击 创建新实验。
  2. 加载实验方案
    1. 在 新实验 选项卡中，输入实验名称以及计划进行实验的日期。
      1. 激活用于培养的培养站和反应器的复选框。同时激活 自动添加 DOE 标签，以便在编程 DOE 实验时实现顺畅过渡。点击 下一步 进入下一个选项卡。
    2. 设置向反应器中添加培养基、消泡剂、接种物、补料和葡萄糖的相关信息。
      1. 激活 添加培养基板 复选框。定义含有培养基的板的类型、名称和位置。
        警告：根据板的类型以及板是否带有盖子，需激活 带盖 选项，以确保液体处理系统的正常运行
      2. 点击 向反应器添加培养基。输入要加入反应器的培养基体积。定义从板到反应器的培养基转移路径。点击 下一步 进入下一个选项卡。
    3. 设置反应器中的培养条件。
      1. 在软件中输入培养基信息后，设定培养条件。点击 培养基预处理，填写温度、目标溶氧（DO）、pH 上限值以及搅拌转速（向上搅拌或向下搅拌）。
    4. 设置向反应器中添加接种物。
      1. 激活 添加细胞板。定义含有细胞的板的类型、名称和位置。
      2. 点击 向反应器添加细胞。输入接种时间以及要加入反应器的培养基体积。
      3. 定义液体处理系统从板向反应器转移细胞的路径。点击 下一步 进入下一个选项卡。
        注意：确保 重复使用移液吸头 处于未激活状态，以避免交叉污染和初始活细胞浓度不准确。
    5. 设置补料、葡萄糖和消泡剂的添加。
      注意：补料、葡萄糖和消泡剂的添加流程基本相同。本方案以“补料”为例进行说明，该流程可同样适用于葡萄糖和消泡剂。
      1. 激活 添加补料板 并定义板的类型、名称和位置。点击 向反应器添加补料，输入要加入反应器的补料体积。定义从板到反应器的补料转移路径。
      2. 根据培养需求，设置补料添加次数。本实验中，反应器在接种后 72 小时开始，每隔 24 小时进行一次补料。
      3. 通过在 细胞添加后延迟时间 中输入数据，手动设置每次补料之间的时间延迟。第一次补料在接种后 72 小时，第二次在 96 小时，依此类推。
        注意：消泡剂的添加程序设定为每天添加一次，以防止培养过程中产生泡沫。
    6. 设置培养过程中的取样。
      1. 激活 添加取样板 并定义板的类型、名称和位置。
      2. 勾选 从反应器取样，输入从反应器中取出的样品体积。定义从反应器到板的样品转移路径。确保在整个培养过程中，反应器内体积不低于 10 mL。
      3. 设置培养期间需采集的样品数量。与补料类似，为每个取样时间点输入样品从反应器中取出的具体时间。
    7. 保存该流程。此时流程已准备就绪，可供执行。
      注意：为确保协议顺利运行，请切换至 AMBR 细胞培养软件中的 流程步骤 选项卡，并选择 流程步骤视图，以可视化整个实验方案的流程。
  3. 在自动微型生物反应器中进行实验设计
    1. 为运行生物反应器的 DOE 软件，请确保主软件中的实验方案已保存并可使用。
    2. 打开 AMBR 15 DOE 软件，点击 研究 并选择 新建。
      1. 在 创建研究 对话框中输入新的 DOE 研究名称。
      2. 为将实验分配至 DOE 研究中，请打开先前创建的用于研究不同参数的实验方案。点击 浏览 并选择相应的实验。
    3. 定义 DOE 因子。
      1. 反应器标签已列在对应列中。为定义所需的 DOE 因子，请选择参数并点击标有 DOE 因子 的列。选择 新建，并添加因子的单位、缩写、下限和上限（例如：温度、DO、pH）。
    4. 定义响应因子。
      1. 在定义完 DOE 因子后，需定义用于构建实验分析基础的响应因子。
      2. 在 响应 选项卡中，定义用于数据分析的数值。
      3. 点击 编辑 DOE 响应，定义响应名称、缩写、单位、最小值和最大值（例如：滴度、活细胞浓度）。
      4. 定义响应后，为每个响应选择 AMBR 变量并定义该变量。响应可自动关联至微型生物反应器变量，从下拉列表中选择所需变量。
      5. 根据需要为每个响应更改计算公式。可选选项包括最小值、最大值、首个值、末个值和平均值。
    5. 创建实验设计。
      1. 使用 启动设计向导 来选择实验设计类型，并添加或删除重复次数和中心点数量。
      2. 选择目标，该目标将决定设计和模型的选择：
        筛选：使用线性和交互作用模型以识别关键因子
        优化（RSM）：使用二次和三次模型进行详细建模和优化
        分目标：可分别选择配方因子和工艺因子的模型
      3. 确定目标后，选择模型、设计类型以及中心点和重复次数。
      4. 点击 完成 并切换至下一个选项卡。
    6. 定义实验。
      注意：DOE 因子列在软件右侧列中。选择所需因子后，运行该实验并包含相应参数的反应器将被高亮显示。可通过右键点击反应器并将其拖动至目标位置，调整培养站内反应器的布局。
      1. 创建可导入 AMBR 细胞培养软件的工作包。根据实验数量创建并存储不同的工作包，以供后续实施。
  4. 在 AMBR 控制笔记本电脑上执行所创建工作包中的实验
    1. 在 实验 选项卡中，点击 创建 DOE 实验，并浏览选择使用 DOE 软件创建的工作包。
    2. 点击 开始 启动流程。
  5. 实验结果分析
    1. 实验执行完毕后，使用 导出 DOE 结果 导出数据。导出 DOE 结果 窗口将打开，表格中列出指示培养反应器和站位的行。
    2. 选择所需行，点击 导出所选行 或 导出实验数据 以存储所有结果，并保存文件用于进一步分析。
    3. 通过切换至 结果 选项卡并选择 导入结果，将数据导入 AMBR DOE 模块。
    4. 浏览选择所需数据文件，点击 分析结果。
    5. 在 MODDE 中进一步分析结果。

4. 自动化微型生物反应器中的培养操作

注意： 以下步骤由用户借助上述软件中编写的实验方案完成。除非另有说明，所有步骤均由用户执行。

  1. 装载容器
    1. 在超净工作台内打开经γ射线灭菌的培养容器，并按照图示方式置于培养工作站中 图2.
    2. 用70%乙醇和双蒸水清洁夹紧板，然后高压灭菌该板并置于容器顶部。
    3. 将夹紧板与搅拌板安装在一起，确保每个销钉都牢固固定。
    4. 将搅拌板和夹紧板均拧紧到搅拌组件上。
  2. 运行微型生物反应器软件
    1. 使用第 3 节中编写的程序运行培养。
    2. 可视化已计划或已完成的流程步骤 过程 根据需要，在程序运行过程中暂停液体处理仪，然后编辑程序步骤，以调整培养步骤。
    3. 在启动搅拌器之前向容器中加入消泡剂，以确保培养过程中不会产生过多泡沫。消泡剂将定期添加，并通过目视检测泡沫情况。
  3. 向容器中添加培养基
    1. 将无菌培养基手动加入随微生物反应器提供的24孔板中，并将其放置于系统指定的板位上。确保将板放置在程序（第3节）指定的位置。容器的填充将按照第3.2.2节中设计的方式进行。
      注意： 在添加培养基和消泡剂后立即开始控温和搅拌。容器注满后1小时启动传感器读数（开始监测步骤）。一旦读数启动，即开始向各容器通气。培养基需静置平衡至少6小时，然后进行pH重新校准和接种。如第3.2.3节所述，可在软件中调整工艺参数。
  4. 接种
    1. 测量5次后的活细胞浓度th 传代。计算需转移至各培养容器的细胞数量，以确保所有容器中的初始细胞浓度均为 3 x 105 cells/mL
    2. 将细胞转移至24深孔板中，使悬液体积至少为所需体积的1.6倍。若接种液所需体积为2 mL，则向每孔中加入3.2 mL细胞悬液。
    3. 将24孔板放置于指定的板位。按照3.2.4节的方法接种容器。
  5. 每日取样与分析
    1. 移除 a 460 μL 每天使用液体处理仪从容器中取样。稀释 200 µL 样品的 800 µL 加入过滤后的1×PBS缓冲液（5倍稀释），然后放入细胞计数仪中。
    2. 将剩余样品以 190 × g 离心 5 分钟 g 在室温和条件下保存上清液，用于后续分析（葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和谷氨酸）。
    3. 冷冻 100 µL 上清液在 -20 °C 直至培养结束以进行蛋白质定量。
  6. 培养结束
    1. 当过程参数控制（即温度、搅拌、pH 和 DO）结束后，停止对该过程的监测。
    2. 拧下搅拌器底板和夹紧板。
    3. 移去培养容器并清洁培养台。将干燥板放置在培养台上并拧紧。
    4. 同时，用70%乙醇和双蒸水彻底清洗夹板。
    5. 点击 停止 在生物反应器软件中，干燥循环完成后。
  7. 细胞培养收获
    1. 在培养第12天收获细胞，手动将容器中的内容物转移至50 mL离心管中。在190 x g 30 分钟。
    2. 弃去细胞沉淀，将上清液于 -20 °C.

5. 测定单克隆抗体浓度

  1. 在培养过程中，使用1.7 mL的Protein A柱对蛋白质进行定量。
  2. 在解冻样品前，先准备好平衡缓冲液和洗脱缓冲液。
    1. 使用含0.5 M NaCl、pH为7.9的0.5 M Na2HPO4溶液作为平衡缓冲液，使用含0.5 M NaCl、pH为2的100 mM甘氨酸溶液作为洗脱缓冲液。
  3. 将两种缓冲液均通过0.2 µm滤膜过滤，并在用于分析前进行脱气处理。
  4. 用新配制的平衡缓冲液冲洗高效液相色谱系统（HPLC）。
  5. 将Protein A柱连接至HPLC系统。
  6. 以1 mL/min的流速进行层析分析，设置柱温箱温度为30 °C，自动进样器温度为10 °C。
  7. 在室温下解冻冷冻样品，取每份样品225 µL，通过0.22 µm PVDF滤膜过滤；对于目标蛋白浓度较高的样品，用平衡缓冲液按1:20的比例稀释，再经滤膜过滤后放入自动进样器。
  8. 将样品放入自动进样器中。在软件中加载方法和进样序列，并启动运行。
    注意：该方法包含三个阶段（见图1）：前两分钟将样品注入色谱柱；随后用洗脱缓冲液洗脱8分钟；最后用平衡缓冲液再生色谱柱10分钟。

色谱过程图；显示单克隆抗体洗脱；阶段包括：上样、洗脱、柱再生。
图 1：Protein A 色谱图，表示单次运行过程中的不同阶段。 请点击此处查看此图的放大版本。

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结果

本研究中进行的培养概述见图2。

在搅拌速度 1050 与 1300 rpm 下对微孔板中样品进行 pH 分析；实验示意图。
图2：在培养装置中测试 pH 值与搅拌速度条件的实验示意图。该图还展示了容器的正确放置布局。请点击此处查看此图的放大版本。

自动微型生物反应器中的细胞生长情况与可重复使用生物反应器相当，如

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讨论

在生物制药行业中，优化工艺以提高产量至关重要。摇瓶可用于菌株筛选，但无法在瓶中监测pH和溶氧（DO）等工艺参数。微型生物反应器具有优势，因其可实现对工艺参数的连续监测与控制。微型生物反应器中的这些控制回路还能提供与较大规模相似的培养条件，从而获得与大型生物反应器可比的结果。微型生物反应器的另一优势在于，相较于台式生物反应器，在相同时间内可测试更广泛的条件，且成本更低、耗时更少、人力需求更小12,13。由于底物用量减少以及并行操作所需空间更小，微型生物反应器体积较小也带来了运行成本降低的优势；然而，容器本身的成本也需考虑，因为使用一次性微型生物反应器进行培养可能比使用可重复使用的台式生物反应器更昂贵。

尽管该系统具有多项优势，但使用微型生物反应器也存在一些明显的缺点。可以在同一培养站内对每个容器的pH和溶氧（DO）进行调节；然而，无法对单个容器的搅拌速度和温度进行独立调控。这导致需要开展更多实验以确定最佳的搅拌速度和温度条件。在线检测仅限于pH和溶氧（DO）参数。对温...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢德国联邦教育与研究部（Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF）以及德国赛多利斯斯泰迪姆生物技术有限公司（Sartorius Stedim Biotech GmbH）的生物工艺团队提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 一次性无菌移液器吸头Sartorius Stedim Biotech GmbHA-0040
200 mM L-谷氨酰胺Corning, Merck25-005-CV
24 孔深孔板Sartorius Stedim Biotech GmbHA-0038
5 mL 一次性无菌移液器吸头Sartorius Stedim Biotech GmbHA-0039
ambr 15 自动化微型生物反应器系统Sartorius Stedim Biotech GmbH001-2804
ambr 15 细胞培养 24 孔一次性生物反应器 - 鼓泡式Sartorius Stedim Biotech GmbH001-1B86
Antifoam C 乳液Sigma-Aldrich, MerckA8011
瓶顶式无菌滤器Corning, MerckCLS4314740.1 μm 孔径
CEDEX 清洗剂（3% Mucosol）Roche Innovatis AG05-650-658-001
细胞计数仪Roche Innovatis AG05-650-216-001CEDEX HiRes
CHO DG44 细胞系Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH
CHOKO 补料培养基 A（FMA）Sigma-Aldrich, MerckCR80025
CHOKO 补料培养基 B（FMB）Sigma-Aldrich, MerckCR80026
CHOKO 生产培养基Sigma-Aldrich, MerckCR80027
CHOKO 储存培养基Sigma-Aldrich, MerckCR80028
Chromaster 高效液相色谱系统VWR International
锥形离心管Corning, MerckSIAL0790
乙醇Merck1070179026
甘氨酸Carl Roth56-40-6
HPLC 小瓶VWR InternationalSUPLSU860181
PBSSigma-Aldrich,MerckP4417
Protein A 色谱柱Thermo Fisher Scientific1502226POROS™ A 1.7 mL
氯化钠Sigma-Aldrich,Merck7647-14-5
无水磷酸氢二钠Sigma-Aldrich,Merck7558-79-4
台盼蓝VWR InternationalVWRVK940
YSIYSI Inc2900DYSI 2900 Select

参考文献

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