本文介绍了一种在自动化微型生物反应器中进行实验设计，随后通过蛋白A柱进行细胞收获和蛋白质定量的详细操作流程。
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本文内容
摘要
摘要
优化生物工艺以提高目标产物的产量在生物制药行业中具有重要意义。这可以通过菌株筛选和优化生物工艺参数来实现。摇瓶已被用于此目的，但其无法控制pH值和溶解氧（DO）等工艺参数。该局限性可通过使用自动化微型生物反应器得以克服。这些生物反应器可模拟更大规模的培养过程。该系统的主要优势之一是将实验设计（DOE）集成于软件之中。此集成功能可建立一种实验方案，使多个工艺参数能够同时变化，并可在软件内分析关键工艺参数及最优生物工艺条件。本文所展示工作的重点是向用户介绍在软件中进行工艺设计的步骤，以及在培养运行过程中整合DOE的方法。
引言
2018年，全球生物制药市场的价值超过2500亿美元，并持续扩大1。制药公司正逐步从生产小分子药物转向生物技术生产的治疗性产品，例如重组蛋白。仅重组蛋白一项就带来了超过1500亿美元的收入1。目前，哺乳动物细胞被广泛用于生产这类药用重组蛋白。在已获批的68种由哺乳动物细胞生产的药物中，有57种由中华仓鼠卵巢细胞（CHO）生产2。CHO细胞特别适用于需要翻译后修饰的重组蛋白的生产。由于CHO细胞可在悬浮培养中生长，因此可在无血清且化学成分明确的培养基中实现可重复的实验结果，这是其被优先选用的原因之一3,4。使用CHO细胞的另一优势在于，其产物的糖链结构与人源单克隆抗体（mAb）相似，且由于基因扩增，可获得更高的重组蛋白产量和特异性生产率5。
过去二十年中，重组CHO（rCHO）细胞培养的产量已提高了近百倍。这一进步归因于工艺参数的优化、补料策略的改进以及无血清化学成分明确培养基的开发6。随着对药品需求的不断增加，药品生产工艺在成本和时间效率方面面临更大压力7。为了在确保产品质量的....
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方案
1. 预培养步骤
注意：本实验方案使用活细胞浓度为 1 x 107 个细胞/mL 的重组 CHO DG44 细胞。
- 将含有 1.2 mL 细胞的冻存管置于室温下解冻，并立即把细胞悬液转移至含有 10 mL 冷却的种子培养基的 15 mL 圆锥形离心管中。
- 在室温下以 190 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
- 在 500 mL 摇瓶中预热 150 mL 种子培养基至 36.8 °C。
- 用 10 mL 预热的种子培养基轻柔重悬细胞沉淀，并将细胞转移至摇瓶中。
- 从摇瓶中取 1 mL 样品，使用细胞计数仪测定初始活细胞浓度（VCC）和细胞活力。
注意：解冻后细胞活力应高于 70%，以确保培养成功。 - 将摇瓶置于轨道摇床（摇床直径 19 mm）中，在 36.8 °C、7.5% CO2 条件下以 120 rpm 振荡培养。
注意：这些条件根据细胞株和培养基的不同可能有所变化。 - 传代培养三天后，从摇床上取出摇瓶并置于超净工作台内。取 1 mL 样品测定最终细胞浓度。根据测定结果计算需转移至新鲜预热种子培养基中的体积，使新传代培养的初始细胞浓度为 2 × 10
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结果
本研究中进行的培养概述见图2。
图2：在培养装置中测试 pH 值与搅拌速度条件的实验示意图。该图还展示了容器的正确放置布局。请点击此处查看此图的放大版本。
自动微型生物反应器中的细胞生长情况与可重复使用生物反应器相当，如
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讨论
在生物制药行业中，优化工艺以提高产量至关重要。摇瓶可用于菌株筛选，但无法在瓶中监测pH和溶氧（DO）等工艺参数。微型生物反应器具有优势，因其可实现对工艺参数的连续监测与控制。微型生物反应器中的这些控制回路还能提供与较大规模相似的培养条件，从而获得与大型生物反应器可比的结果。微型生物反应器的另一优势在于，相较于台式生物反应器，在相同时间内可测试更广泛的条件，且成本更低、耗时更少、人力需求更小12,13。由于底物用量减少以及并行操作所需空间更小，微型生物反应器体积较小也带来了运行成本降低的优势；然而，容器本身的成本也需考虑，因为使用一次性微型生物反应器进行培养可能比使用可重复使用的台式生物反应器更昂贵。
尽管该系统具有多项优势，但使用微型生物反应器也存在一些明显的缺点。可以在同一培养站内对每个容器的pH和溶氧（DO）进行调节；然而，无法对单个容器的搅拌速度和温度进行独立调控。这导致需要开展更多实验以确定最佳的搅拌速度和温度条件。在线检测仅限于pH和溶氧（DO）参数。对温.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢德国联邦教育与研究部（Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF）以及德国赛多利斯斯泰迪姆生物技术有限公司（Sartorius Stedim Biotech GmbH）的生物工艺团队提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 一次性无菌移液器吸头 | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0040 | |
| 200 mM L-谷氨酰胺 | Corning, Merck | 25-005-CV | |
| 24 孔深孔板 | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0038 | |
| 5 mL 一次性无菌移液器吸头 | Sartorius Stedim Biotech GmbH | A-0039 | |
| ambr 15 自动化微型生物反应器系统 | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-2804 | |
| ambr 15 细胞培养 24 孔一次性生物反应器 - 鼓泡式 | Sartorius Stedim Biotech GmbH | 001-1B86 | |
| Antifoam C 乳液 | Sigma-Aldrich, Merck | A8011 | |
| 瓶顶式无菌滤器 | Corning, Merck | CLS431474 | 0.1 μm 孔径 |
| CEDEX 清洗剂（3% Mucosol） | Roche Innovatis AG | 05-650-658-001 | |
| 细胞计数仪 | Roche Innovatis AG | 05-650-216-001 | CEDEX HiRes |
| CHO DG44 细胞系 | Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH | ||
| CHOKO 补料培养基 A（FMA） | Sigma-Aldrich, Merck | CR80025 | |
| CHOKO 补料培养基 B（FMB） | Sigma-Aldrich, Merck | CR80026 | |
| CHOKO 生产培养基 | Sigma-Aldrich, Merck | CR80027 | |
| CHOKO 储存培养基 | Sigma-Aldrich, Merck | CR80028 | |
| Chromaster 高效液相色谱系统 | VWR International | ||
| 锥形离心管 | Corning, Merck | SIAL0790 | |
| 乙醇 | Merck | 1070179026 | |
| 甘氨酸 | Carl Roth | 56-40-6 | |
| HPLC 小瓶 | VWR International | SUPLSU860181 | |
| PBS | Sigma-Aldrich,Merck | P4417 | |
| Protein A 色谱柱 | Thermo Fisher Scientific | 1502226 | POROS™ A 1.7 mL |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich,Merck | 7647-14-5 | |
| 无水磷酸氢二钠 | Sigma-Aldrich,Merck | 7558-79-4 | |
| 台盼蓝 | VWR International | VWRVK940 | |
| YSI | YSI Inc | 2900D | YSI 2900 Select |
参考文献
- Langer, E. S. 15th Annual report and survey of Biopharmaceutical Manufacturing Capacity and Production: A study of Biotherapeutical Developers and Contract Manufacturing Organizations. Bioplan Associates. , Available from: http://bioplanassociates.com/wp-content/uploads/2018/07/15thAnnualBiomfgReport_TABLEOFCONTENTS-LR.pdf (2019).
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks 2018.....
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