一种改良的小鼠后肢继发性淋巴水肿诱导方法

摘要

该动物模型可诱导小鼠后肢产生具有统计学意义的继发性淋巴水肿，且持续时间至少8周。该模型可用于研究淋巴水肿的病理生理机制，并探索新的治疗方案。

摘要

动物模型在淋巴水肿研究中具有至关重要的作用，不仅有助于理解该疾病的病理生理机制，还可用于探索潜在的治疗方案。该小鼠模型可诱导出持续至少8周的显著淋巴水肿。淋巴水肿通过分次放射治疗联合淋巴管外科切除的方式诱导产生。该模型要求小鼠在手术前后均接受10戈瑞（Gy）的辐射剂量。模型中的手术部分包括结扎三条淋巴管并从小鼠后肢摘除两个淋巴结。由于小鼠解剖结构微小，因此必须具备显微外科工具和显微镜。该模型的优势在于能够产生具有统计学意义的淋巴水肿，为评估不同治疗方法提供了良好基础，同时也是显微外科训练的一种理想且易于获取的方案。该模型的局限性在于操作过程可能耗时较长，尤其对于缺乏前期练习的操作者而言。该模型可在小鼠中产生客观可量化的淋巴水肿，且不会引起严重病态，在三个独立研究项目中已得到验证。

引言

淋巴水肿的特征是淋巴液积聚，导致局部组织肿胀，主要由于淋巴管内淋巴液流动受阻或中断所致¹。感染、阻塞、损伤或淋巴系统的先天性缺陷均可导致淋巴液流动受阻或中断²。这些病因导致淋巴液积聚，引发慢性炎症状态，进而导致纤维化以及脂肪组织沉积³。淋巴水肿可分为原发性淋巴水肿和继发性淋巴水肿。原发性淋巴水肿由发育异常或基因突变引起^2,4。继发性淋巴水肿则由潜在的全身性疾病、手术或外伤引起^2,4。继发性淋巴水肿是全球最常见的淋巴水肿类型²。在发达国家，继发性淋巴水肿最常见的原因是肿瘤治疗，如辅助性放射治疗和淋巴结清扫术⁵。乳腺癌患者中最常发生淋巴水肿，但妇科肿瘤、黑色素瘤、泌尿生殖系统肿瘤或头颈部肿瘤患者也可能发生该病⁶。有研究指出，在所有确诊乳腺癌的女性中，约21%将发展为淋巴水肿⁷。

淋巴水肿在身体和心理上都会给患者带来巨大....

方案

动物饲养于南丹麦大学动物护理设施，遵循机构指南。所有涉及动物实验的程序均已获得丹麦环境与食品部动物实验监察局的批准。

1. 术前照射

注意：术前照射在手术前7天进行。

1. 诱导麻醉。
   1. 将小鼠放入诱导箱中，将蒸发器设置为3%异氟烷，氧气流速为0.8−1.2 L/min，以诱导吸入麻醉。
      注意：也可使用注射类麻醉剂，但由于照射时间较短，吸入麻醉已足够。本研究中所展示结果的实验均使用9周龄雌性C57BL6小鼠。
   2. 通过尾部或足部夹捏测试确认小鼠已完全麻醉。
2. 将小鼠摆放到照射位置。
   1. 若小鼠已完全镇静，将其从诱导箱中移出，仰卧置于辐射源下方，并用胶带轻轻固定后肢。
      注意：在短暂的辐射过程中，小鼠将保持镇静状态。
   2. 放置一块1.5 mm厚的铅板，以确保仅有接受手术的区域（即膝关节周围直径为25 mm的圆形区域）受到照射。
3. 以5.11 Gy/min的剂量率给予10 Gy辐射剂量（100 kVp，10 mA）。
   警告：操作辐射时必须采取安全防护措施。本实验中所有照射均在具有辐射屏蔽的房间内进行，且仅在所有人员离开并封闭房间后才启动辐射源。
4. 将小鼠放回其笼中。
<....

结果

该操作程序此前已在三项独立实验中使用。所有实验均由不同的主要研究者完成，且这些研究者均为本文的共同作者。在这三项实验中，均严格遵循本方案所述的相同操作流程。在所有三项实验中，均在一侧后肢诱导继发性淋巴水肿，而另一侧后肢作为对照。后肢体积是三项实验的主要观察指标。图1展示了研究设计。

所有小鼠在术后数周内均接受了微型计算机断层扫描（µCT），以测量后肢体积。µCT扫描使用多模态临床前扫描仪（材料表）进行，并通过配套软件中的感兴趣区域（ROI）功能测量后肢体积，方法如前所述²⁶。采用既往描述的方法²⁷在三维（3D）轴向图像中定位胫腓远端关节。ROI从胫腓远端关节开始，包含该点远端的所有组织。分析时设定的亨氏单位（Hounsfield）范围为-500至4000。

.......

讨论

本方案中有几个关键步骤。首先，研究人员在操作放射性物质时必须采取安全防护措施。其次，在本方案的手术部分，一旦小鼠麻醉完成，应立即开始手术操作，并且避免不必要的中断，直至手术结束。这一点非常重要，以避免动物经历过长的手术时间，并防止麻醉效果在手术过程中减弱。建议仅给予一次麻醉剂推注，并在一次麻醉过程中完成全部手术操作。另一个关键步骤是，切勿注射过多专利蓝V（Patent Blue V），因为过量的专利蓝V会导致淋巴管周围组织染色。如果周围组织被染色，则几乎无法观察到淋巴管，从而影响手术的进行。即使能够勉强观察到淋巴管，染色的组织也会使操作者难以判断专利蓝V是否已通过结扎部位的近端。这一问题尤为严重，因为操作者必须确认所放置的结扎线确实阻断了淋巴液流动，以确保手术成功。此外，在关闭伤口时应保留2−3 mm的间隙。这种暂时性的皮肤间隙通常用于模拟人类的伤口愈合过程²⁹。

该方法的局限性在于，它是一种耗时较长的操作流程，需要显微镜设备以及先前的显微外科训练。在执行本实验方案的手术部分时，合理规划各手术步骤之间的时间间隔至关重要。大量时间通常消.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10-0 尼龙缝线	S&T	12051-10
6-0 尼龙缝线 - Dafilon	B Braun	C0933112
电凝器 - ICC 50	ERBE
棉签	Yibon medical co
解剖镊	Lawton	09-0190
弹性牵开器	Odense University Hospital
电动剪毛器	Aesculap	GT420
芬太尼 0.315 mg/ml	Matrix
加热垫 - PhysioSuite	Kent Scientific Corp.
异氟烷 1000mg Attane	Scan Vet
异氟烷蒸发器 - PPV	Penlon
微型珠宝镊	Lawton	1405-05
微型持针器	Lawton	25679-14
微型剪刀	Lawton	10128-15
微型打结镊	Lawton	43953-10
Microfine U-40 注射器 0.5ml	BD	328821
Microlance 注射器 25g	BD
Microlance 注射器 27g	BD
咪达唑仑 5 mg/ml (hameln)	Matrix
持针器 - Circle wood	Lawton	08-0065
无纺布纱布	Selefa
Opmi pico 显微镜 F170	Zeiss
专利蓝 V - 25 mg/ml	Guerbet
剪刀 - Joseph	BD	RH1630
西门子 INVEON 多模态临床前成像系统	Siemens pre-clinical solutions
辐射源 - D3100	Gulmay
Stata 统计软件：第 15 版	StataCorp LLC
镇痛新 - 0.2 mg	Indivior
兽用眼膏 - viscotears	Bausch & Lomb