利用阵列文库中通量筛选和双荧光素酶报告系统鉴定转录因子调控因子

摘要

为了鉴定转录因子的新调控因子，我们开发了一种方法，利用基于双荧光素酶的转录报告基因检测技术，对排列式慢病毒或逆转录病毒RNAi文库进行筛选。该方法能够在单次实验中快速且相对低成本地筛选数百个候选基因。

摘要

转录因子可以改变大量靶基因的表达，从而影响多种下游过程，因此是抗癌治疗的理想靶点。然而，直接靶向转录因子通常较为困难，如果该转录因子在一种或多种成体组织中具有必要功能，则可能引发不良副作用。识别在癌细胞中异常激活转录因子的上游调控因子提供了一种更为可行的替代策略，特别是当这些蛋白易于作为药物靶点时。本文介绍了一种实验方案，可结合阵列式中等规模的慢病毒文库与基于双荧光素酶的转录报告基因检测方法，用于鉴定癌细胞中转录因子的新调控因子。该方法能够在单次实验中快速、简便且低成本地检测数百个基因。为展示该方法的应用，我们对一个阵列式慢病毒RNA干扰文库进行了筛选，该文库包含多个Yes相关蛋白（YAP）和含PDZ结合基序的转录共激活因子（TAZ）的调控因子——YAP和TAZ是Hippo信号通路的下游效应转录共激活因子。然而，该方法也可经修改后用于筛选几乎任何转录因子或共因子的调控因子，并可用于CRISPR/Cas9、cDNA或ORF文库的筛选。

引言

本实验的目的是利用病毒文库以相对快速且经济的方式鉴定转录因子的调控因子。异常的转录活性与癌症及转移密切相关^1,2,3,4,5,6，因此靶向癌细胞中的转录因子是一种有前景的治疗策略。然而，转录因子通常难以通过药物进行靶向干预⁷，且其中许多因子在成体组织的正常细胞功能中具有重要作用^8,9,10。相比之下，靶向那些异常激活转录因子并驱动疾病进展的癌症相关通路是一种更为可行的策略，且可能带来较轻微的副作用。目前市场上已有阵列化的慢病毒和逆转录病毒RNAi、CRISPR/Cas9、cDNA或ORF文库，使研究人员能够在单次实验中评估大量基因的功能重要性。然而，该方法需要一种可靠的检测手段来反映转录活性的变化。

本文描述了一种基于双荧光素酶的转录报告基因检测方法，并....

方案

注意：本方案的示意图总结见图1。

1. 慢病毒载体文库制备

注意：本实验所用的筛选方法采用了以甘油菌形式购入的96孔板装阵列式shRNA文库，但文库也可根据候选基因列表手动构建。任何文库都应考虑并包含适当的对照，包括非靶向对照shRNA（shNTC）、靶向所研究转录因子的对照shRNA，以及如有可能，靶向萤火虫荧光素酶的shRNA。

1. 向96孔深孔板的每个孔中加入1.3 mL含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基（1% 胰蛋白胨、0.5% 酵母提取物、1% NaCl，pH 7.5）。每个孔接种2 µL甘油菌种，并在37 °C下以225 rpm持续振荡培养过夜。
2. 将每种细菌培养物转移至1.5 mL离心管中，在4 °C下以21,000 × g 离心10分钟，使细菌沉淀。
3. 按照试剂盒生产商提供的操作说明，使用细菌质粒小提试剂盒纯化每种载体。
4. 使用分光光度计测定每种载体的浓度。
5. 将质粒在-20 °C保存。
   注意：本实验流程可在此处暂停。

2. 阵列式慢病毒文库的包装

注意：所有涉及慢病毒的操作，包括病毒包装、感染....

结果

我们的YAP/TAZ-TEAD报告基因构建体（pGL3-5xMCAT (SV)-49^2,14,15）包含一个最小SV-49启动子，其含有5个重复的经典TEAD结合元件（MCAT）¹⁵，驱动萤火虫荧光素酶基因的表达（图1）。该构建体与PRL-TK对照载体（Promega）共转染入细胞，后者通过组成型活性的HSV TK启动子表达Renilla荧光素酶（图1）。确保YAP/TAZ-TEAD报告基因构建体在所测试的细胞系中表现符合预期至关重要。因此，我们首先将PRL-TK和pGL3-5xMCAT (SV)-49构建体共转染至稳定表达对照载体、高度活性且对LATS不敏感的YAP突变体（YAP^2SA

讨论

在本研究中，我们展示了一种中等通量筛选阵列式病毒文库的方法，结合基于双荧光素酶的转录报告基因检测，可用于鉴定和验证转录因子的新调控因子。在开展任何筛选之前，针对每种细胞系对报告系统进行表征和优化至关重要。应通过实验确认报告基因对所研究转录因子活性变化具有响应性，并应检测其活性变化幅度相对于对照载体的水平。共转染PRL-TK质粒与报告基因质粒非常重要，因为它有助于校正转染报告基因的细胞数量以及报告基因质粒的拷贝数，这两者均可能影响荧光素酶信号的强度。优化实验还应确保转录因子不会影响组成型启动子驱动的内参报告基因（如TK启动子）的活性 海肾 构建或最小启动子构建，因为这可能会使结果的解释复杂化。文库中应包含的对照也需仔细考虑。本方案适用于 "盲筛" 包含数百个shRNA的文库，由于无法对每个shRNA的有效沉默效果逐一验证，因此可能会出现一定数量的假阳性和假阴性结果。增加筛选过程中的技术重复和/或生物学重复次数有助于减少假阳性和假阴性。然而，这也会显著增加需要培养和检测的孔数，因此需谨慎操作，避免导致培养条件不理想（见下文）。另一种减少假阳性和假阴性的策略是，在同一细胞系或额外的细胞系中重复整个筛选实验，或.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2.0 ml 96孔深孔聚丙烯板	USA Scientific	1896-2000	用于细菌质粒小提
胰蛋白酶 - 2.50%	Gibco	15090-046	胰蛋白酶-EDTA 的组分
96孔平底白色检测板	Corning	3922	用于双荧光素酶检测
氨苄青霉素 - 100 mg/ml	Sigma-Aldrich	45-10835242001-EA	用于细菌质粒小提
胰蛋白胨 - 粉末	Sigma-Aldrich	95039	LB 培养基的组分
双荧光素酶报告基因检测系统，包含 LAR II 试剂（试剂A）、Stop & Glo 底物（试剂B底物）和 Stop & Glo 缓冲液（试剂B缓冲液）- 试剂盒	Promega	E1960	用于双荧光素酶检测
不含钙、镁和酚红的杜氏磷酸盐缓冲液 - 9.6 g/L	Himedia	TS1006	用于 PBS
EDTA - 0.5 M	VWR	97061-406	胰蛋白酶-EDTA 的组分
乙醇 - 100%	Pharmco-AAPER	111000200	用于细菌质粒小提
胎牛血清 - 100%	VWR	97068-085	完全生长培养基的组分
六亚甲基溴化铵（Polybrene）- 8 mg/ml	Sigma-Aldrich	45-H9268	用于病毒感染
HyClone DMEM/高糖 - 4 mM L-谷氨酰胺；4500 mg/L 葡萄糖；丙酮酸钠	GE Healthcare life sciences	SH30243.01	完全生长培养基的组分
I3-P/i3 多功能微孔板检测仪	Molecular devices		用于双荧光素酶检测
L-谷氨酰胺 - 200 mM	Gibco	25030-081	完全生长培养基的组分
Lipofectamine 3000（转染试剂2）- 100%	Life technologies	L3000008	用于转染
分子生物学用水 - 100%	VWR	02-0201-0500	用于稀释shRNA载体以进行病毒包装
NaCl - 粉末	BDH	BDH9286	LB 培养基的组分
NanoDrop One 微量紫外-可见分光光度计	Thermo scientific		用于测定载体DNA浓度
Opti-MEM（转染缓冲液）- 100%	Gibco	31985-062	用于转染
青霉素-链霉素 - 10,000 单位/ml（青霉素）；10,000 µg/ml（链霉素）	Gibco	15140-122	完全生长培养基的组分
PureLink 快速质粒小提试剂盒 - 试剂盒	Thermo Fisher Scientific	K210010	用于细菌质粒小提
嘌呤霉素 - 2.5 mg/ml	Sigma-Aldrich	45-P7255	用于感染后的抗生素筛选
TC20 自动细胞计数仪	Bio-Rad		用于细胞计数
X-tremeGENE 9 DNA转染试剂（转染试剂1）- 100%	Roche	6365787001	用于病毒包装
酵母提取物 - 粉末	VWR	J850	LB 培养基的组分
P3000（转染试剂3）- 100%	Life technologies	L3000008	用于转染