使用阵列库的中等通量筛选和基于双 Luciferase 的分录报告器识别转录因子稳压器

Summary

为了识别新的转录因子调节器，我们开发了一种使用基于双透明酶的转录报告器测定筛选排列的慢病毒或逆转录病毒RNAi库的方法。这种方法提供了一种快速且相对便宜的方法，在单个实验中筛选数百名候选人。

Abstract

转录因子可以改变许多目标基因的表达，这些基因影响各种下游过程，使它们成为抗癌治疗的良好目标。然而，直接瞄准转录因子通常是困难的，并可能导致不良的副作用，如果转录因子是必要的一个或多个成人组织。识别癌细胞中异常激活转录因子的上游调节器提供了一个更可行的替代方案，特别是如果这些蛋白质容易被药物。在这里，我们描述了一种协议，可用于组合阵列的中等尺度慢病毒库和基于双透明酶的转录报告器测定，以确定癌细胞转录因子的新调节器。我们的方法提供了一种快速、简单且廉价的方法，在单个实验中测试数百个基因。为了证明这种方法的使用，我们执行了一个阵列的慢病毒RNAi库的屏幕，该库包含几个调节器的Yes相关蛋白（YAP）和带PDZ结合图案（TAZ）的转录共活化器，两个转录共激活器，是Hippo通路的下游效应器。但是，这种方法可以修改为几乎所有转录因子或共因子的调节器进行筛选，也可用于筛选 CRISPR/CAS9、cDNA 或 ORF 库。

Introduction

此测定的目的是使用病毒库，以相对快速和廉价的方式识别转录因子的调节器。异常转录活性与癌症和转移^{11、2、3、4、5、62,3,4,5,6}相关，因此靶向癌细胞中的转录因子是一种很有前途的治疗方法。然而，转录因子往往难以瞄准药理学⁷和许多需要正常细胞功能在成人组织^{8，9，10。9,108}靶向癌症相关途径，异常激活转录因子驱动疾病是一种更可行的方法，有可能有不太严重的副作用。阵列慢病毒和逆转录病毒RNAi、CRISPR/CAS9、cDNA或ORF库的商业可用性使研究人员能够在单个实验中测试许多基因的重要性。但是，需要为更改的转录活动进行可靠的读出。

在这里，我们描述了使用基于双透明酶的转录报告器测定和排列的慢病毒库来识别调节癌细胞转录因子的蛋白质。在此测定中，针对癌症相关基因的shRNA通过慢病毒转导输送到哺乳动物癌细胞，并且选择细胞使用紫杉霉素进行稳定整合。细胞的下一个转染与一个记者构造，表达萤火虫透明酶驱动特定到被调查的转录因子和对照结构，表达雷尼拉透明化从一个产生活性的促进剂，对被调查的转录因子不响应。我们演示了这种方法，为YAP和TAZ的监管机构提供了概念验证屏幕，这是Hippo通路^{8、10、1110,}的关键下游⁸效应器。¹¹YAP和TAZ的异常活动促进转移级联¹¹的几个步骤，并观察到在许多癌症11，12，13。^11,12,13然而，YAP和TAZ如何变得异常激活在一些癌细胞还没有完全了解。YAP 和 TAZ 不绑定 DNA，而是通过其他转录因子招募给促进者。TEA 域 （TEAD） 转录因子系列的成员是 YAP 和 TAZ 的主要绑定合作伙伴，对于大多数 YAP 和 TAZ 相关函数至关重要。本报记者从YAP/TAZ-TEAD反应促进器中构建了萤火虫荧光酶，以往的研究表明，它忠实地检测了YAP-TEAD和TAZ-TEAD转录活动^{22、14、1514,15}的变化。

我们的方法快速、中等吞吐量，不需要筛选设施、自动化机器人或池库的深层测序。成本相对较低，有许多商业上可用的图书馆可供选择。在大多数实验室中，所需的设备和试剂也相对标准。如果存在或生成基于荧光酶的分录器，它可用于筛选几乎任何转录因子的监管机构。我们使用这种方法在癌细胞中筛选shRNA，但任何能以合理效率转染的细胞系都可以用于任何类型的阵列库。

Protocol

注: 该协议的原理图摘要如图1所示。

1. 伦迪病毒病媒库制备

注:演示的屏幕使用在 96 孔板中作为甘油库存购买的阵列 shRNA 库，但库也可以根据候选列表手动组装。应考虑适当的控件并将其包含在任何库中。这包括非目标控制shRNA（shNTC），一种针对被调查的转录因子的控制shRNA，如果可能的话，一个针对萤火虫荧光酶的shRNA。

1. 在96孔深井板的每个孔中加入1.3毫升的Luria溴酸（1%巴托-特里普顿，0.5%酵母提取物，1%NaCl，pH 7.5），含有100微克/mL的安曲霉素。用2 μL的甘油库存接种每口井，并在37°C下生长，在225 rpm时持续搅拌。
2. 将每种细菌培养物转移到1.5mL离心管中，在4°C下以21，000 x g的离心将细菌颗粒10分钟。
3. 按照制造商的协议，使用细菌迷你制备套件净化每个矢量。
4. 使用分光光度计确定每个矢量的浓度。
5. 将质粒储存在-20°C。
   注: 协议可以在这里暂停。

2. 阵列慢病毒库的包装

注:所有涉及扁病毒的工作，包括包装、感染和随后对受感染细胞的培养，都应严格遵守机构生物安全规则和规定。

1. 使用完整的生长介质（Dulbecco的改良鹰中（DMEM）含有4 mM L-谷氨酰胺、4，500毫克/L葡萄糖和丙酮钠，辅以10%的胎儿牛血清（FBS）、100单位/mL青霉素、100微克/mL链球菌素抗生素和2 mM L-谷氨酰胺。
2. 对于从步骤 1.4 开始库中的每个矢量，用 1 x 10⁵ 293FT 细胞播种一个 24 井。
   注:建议在继续步骤3（见下文）之前，包装控制病毒载体的一些额外井，并用于测试病毒的定位器。
3. 在37°C下孵育细胞，24小时用5%的_CO2孵育。
   注^{:以前描述的}用于包装扁病毒的一般协议已缩减为24口。它使用psPAX2进行慢病毒包装，VSVG作为涂层蛋白。如果需要益智病毒，可以使用提供 Eco 的载体来代替 VSVG。强烈建议此协议经过优化，以实现病毒性点分器，使目标细胞的感染效率在 30%-70% 之间（请参阅讨论）。有关使用的所有矢量的列表，请参阅补充表 1。
4. 设置步骤 1.4 中的每个病毒载体的转染混合物，如下所述。每次转染应包含250纳克的病毒载体，125纳克psPAX2，125纳克VSVG，1.25μL转染试剂1和23.75μL转染缓冲液（见材料表）。
   1. 用无核酸水将每个慢病毒载体稀释至50纳克/μL，然后将5μL（250纳克）转移到96孔PCR板的井中。
   2. 通过混合转染试剂1和23.75 μL ×X的预加热转染缓冲液1.25 μL×X，使转染超级混合，其中"X"是转染的总数，再加上几个额外的，以考虑到移液过程中的体积损失。
   3. 在室温下孵育转染超级混合物5分钟。
   4. 添加 125 ng = X psPAX2 和 125 ng = X VSVG 的转染超级混合管从步骤 2.4.3 和轻轻地移液向上和向下混合。快速继续步骤 2.4.5。
   5. 立即将步骤 2.4.4 中的混合物分出到 PCR 条的每个管中，然后使用多通道移液器将 25 μL 混合物从步骤 2.4.1 转移到每个含有病毒载体的井中。
   6. 在室温下孵育20分钟。
   7. 从步骤 2.4.6 将每个 96 井中的所有 30 μL 转移到包含步骤 2.3 的 293 FT 细胞的 24 井的井中。
5. 在37°C下用5%的_CO2孵育细胞，24小时，然后用500μL的新鲜完整生长介质替换24孔板每个孔中的介质。在37°C下孵育细胞，再孵育5%的_CO2，再孵育24小时。
6. 使用多通道移液器，从每个井收集病毒上清液和从220 μL（足够1感染步骤3加上一些额外的体积）到两个96井每个。这些是阵列病毒上清板。
7. 将阵列病毒上清板储存在-80°C。
   注: 协议可以在这里暂停。还建议在继续步骤 3 之前测试一些被包装在要感染的细胞上的附加控制病毒（见上文）。这是为了确保手足之力足以达到至少30%的感染效率。

3. 屏幕细胞感染

注:人类黑色素瘤细胞（A375）被用来证明这种方法，但这种方法可以应用于任何感染扁病毒的粘附细胞。但是，细胞培养和电镀条件应针对每个细胞系进行优化（请参阅讨论）。

1. 展开细胞以在完全生长介质中感染。
2. 种子24孔板与1 x 10⁵细胞在0.5ml的完整生长介质每孔。种子一井，每个病毒载体进行测试（包括控制），并包括一个额外的井，不会被感染，将作为在步骤3.7的药物选择的控制。
3. 在37°C下孵育细胞，24小时用5%的_CO2孵育。
4. 感染每一个井从步骤3.2与一个不同的病毒上清，从冷冻阵列扁病毒上清液如下。
   1. 制备含有20微克/mL聚苯乙烯的完整生长介质。
   2. 将阵列的慢病毒库超子体从步骤 2.7 解冻到室温。
   3. 从步骤 3.2 中吸出 24 孔板的生长介质，并立即在每个孔中添加 200 μL 的含聚苯乙烯生长介质。
   4. 使用多通道移液器，从步骤 3.4.3 将每 96 口病毒上清液从步骤 3.4.2 转移到 24 口。
5. 在37°C下孵育细胞，24 - 48小时用5%的_CO2孵育细胞。
   注:某些细胞系可能需要超过 24 小时才能表达 shRNA 并产生抗紫霉素。此处使用的病毒载体在3'UTR的puroR中提供一种涡轮-GFP-IRES-puroR，其基于miR30的shRNA（图1）。通过绿色荧光蛋白监测紫霉素抗药性基因和shRNA的感染效率和表达。
6. 制备含有2.5微克/mL紫霉素的完整生长介质。
   注:紫杉醇素的选择浓度因细胞系而异。建议对屏幕前要测定的每个细胞行执行抗生素杀灭曲线。
7. 从每个井中吸出介质，代之以500μL的含紫霉素的完整生长介质。
   注: 一定要也添加紫霉素到控制非受感染的井，可用于后续步骤，以确保紫霉素的选择完成。
8. 在37°C下孵育细胞，5%CO_2，48小时。
   注:最好选择48小时，因此电镀密度和病毒定位应优化，使细胞在48小时之前不会过度收缩。
9. 确保受感染的细胞在荧光显微镜下是绿色的，并确保控制未感染的细胞在继续步骤 4 之前全部死亡。"

4. 用于转染双透明酶的种子细胞记者

注:应进行测试转染，以确定每个新细胞系的最佳播种密度。

1. 从步骤 3.9 中尝试每个孔，并在新 24 孔板上的相应位置将大约 1 x 10⁵个单元转移到孔中，如下所示。
   注:该协议旨在筛选具有数百个 shRNA 的库，因此无法对受感染细胞的每个井进行计数。因此，以下步骤用于估计每个孔中的细胞数，以帮助确保大致相等的电镀密度。
   1. 将步骤 3.9 中的井组为 3 - 4 组，使组中的所有井具有相似的细胞密度。
   2. 在37°C下，每组有1个代表，每组有200μL的胰蛋白酶-EDTA（1x PBS补充0.5mM EDTA和0.1%胰蛋白酶），5分钟。然后加入含有完整生长介质的400μL的紫霉素，从而中和胰蛋白酶-EDTA。
   3. 对每个代表进行计数，以确定总细胞数，并使用完整的生长介质将每个代表的细胞悬浮液稀释至2 x 10⁵细胞/mL。
   4. 从步骤 4.1.3 到新 24 孔板上的相应位置，将每个孔的 0.5 mL（1 x 10 5 细胞）的种子（1 x 10⁵细胞）孵育到新的 24 孔板上，并在 37 °C 下孵育出此新的 24 孔板，24 小时孵育 5% CO_2。
   5. 对于步骤 4.1.1 中的每个组，使用步骤 4.1.3 中确定的总细胞数计算胰蛋白酶-EDTA 添加到每个孔的体积，以便生成的细胞悬浮液为 1 x 10⁶细胞/mL。
   6. 将适当的胰蛋白酶-EDTA体积添加到每口井中，并在37°C下孵育5分钟。
      注:对于更大的屏幕，建议对24孔板进行试晒和重新镀以组，而不是一次重新镀，以确保细胞的可行性。
   7. 在上述孵化过程中，使用多通道移液器将400μL的含紫霉素的完整生长介质添加到新24孔板的相应孔中。
   8. 将100 μL的细胞悬浮液（约1 x 10⁵细胞）从每个孔转移到步骤 4.1.7 中准备的新 24 孔板上的相应位置。
   9. 步骤 4.1.1.1 的所有板（一次一个板）对所有分组井板重复步骤 4.1.6 到 4.1.8。
2. 在37°C下孵育细胞，24小时用5%的_CO2孵育。

5. 转染双透明酶记者

1. 从步骤 4.2 转染每个井与双透明酶报告构造如下。
   注:在开始此测定之前，应确定用于控制雷尼拉透明酶载体的DNA总量和萤火虫透明酶报告载体的最佳比率。在这里，400纳克的DNA混合物，包含20部分萤火虫透明酶记者和1部分控制雷尼拉透明拉。
   1. 通过将每种试剂的指定体积混合（表1），使转染稀释混合物（管A）和报告稀释混合物（管B）乘以转染总数（外加几个额外）。
      注:此协议针对转染试剂 2 进行了优化（参见材料表）。如果使用不同的转染试剂，则应在此步骤之前优化转染。
   2. 将转染稀释混合物（管A）与记者稀释混合物（管B）混合，在室温下孵育15分钟，产生转染混合物。
   3. 在上述孵育过程中，用0.25 mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）从步骤4.2冲洗每个24口，并在每个井中加入447μL的完整生长介质。
   4. 孵育15分钟后，使用多通道移液器将53μL的转染混合物分配到24孔板的每个孔中。
2. 在37°C下孵育细胞，24小时用5%的_CO2孵育。

6. 双透明酶活性的量化

1. 使用板读取器和双透明酶报告器测定套件测量荧光酶活性，如下所述。
   注:此协议针对指示的分料分析套件（参见材料表）进行了优化，并遵循制造商的建议协议。
   1. 通过稀释 5x 无源式水解缓冲液（套件中提供）1 至 5 次，为所有井准备足够的 1x 无源水解缓冲液，外加几个额外的（每口井需要 75 μL）。此外，解冻试剂A和试剂B缓冲液（在套件中提供，每个井需要100μL）。
   2. 从步骤 5.2 中从 24 孔板的每个孔中吸出介质。
   3. 在每个井中加入 75 μL 的 1x 无源滑水器缓冲液，并在室温下孵育 30 分钟，偶尔摇动。
   4. 通过用解冻试剂 B 缓冲液稀释 50x 试剂 B 基板（套件中提供）1:50 制备试剂 B。
   5. 将 30 μL 的 1x 无源式集液缓冲液添加到 4 口中进行消隐（参见补充表 2）。
   6. 从步骤 6.1.3 将 30 μL 的落除剂转移到 96 孔平底白色测定板的重复孔中。
   7. 使用多通道移液器将 50 μL 的试剂 A 添加到每个孔中，并使用板读取器读取萤火虫荧光酶信号。
   8. 使用多通道移液器将步骤 6.1.4 中的 50 μL 试剂 B 添加到每个孔中，并使用板读取器读取Renilla Luciferase 信号。
2. 按照如下方式处理原始数据（有关详细说明，请参阅补充表 2）。
   1. 排除具有极低的Renilla luciferase信号的样品，因为低值表明病毒构造是有毒的，或者被检测的转染细胞太少。
      注:正如讨论中所述，显著"低"的雷尼拉透明酶信号可导致异常结果。在这里，排除了雷尼拉荧光酶信号低于平均值1个标准差的井（见补充表2）。这是基于以前在这些细胞¹⁴中使用这个报告系统进行的研究，但可能不同于其他细胞系。
   2. 将每口井的原始萤火虫透明酶值与同一井的原始雷尼拉透明酶值标准化，以获得萤火虫/雷尼拉比。
   3. 平均所有复制控制井的萤火虫/雷尼拉比率，然后将其他油井的萤火虫/雷尼拉比率除以该数字，以获得折数变化。
   4. 分配控制样本并将其萤火虫/雷尼拉比值设置为 1。
   5. 使用标准差对重复井的萤火虫/雷尼拉比率和绘图平均。
      注: 标准差不用于统计分析，而是用作识别复制物显著差异的井的一种方法。

Results

我们的YAP/TAZ-TEAD记者构造 （pGL3-5xMCAT （SV）-49^{2，,14，,15}） 包含一个最小的SV-49启动器与5个重复的规范TEAD结合元素 （MCAT）¹⁵驱动萤火虫透明酶基因 （图1）。它与PRL-TK控制载体（Promega）一起被共转入细胞中，后者表示来自产生活性HSV TK促进剂的Renilla luciferase（图1）。确保 YAP/TAZ-TEAD 报告器构造在测试的单元行中按预期进行至关重要。因此，我们首先将PRL-TK和pGL3-5xMCAT（SV）-49共转送到A375细胞中，稳定地表示控制向量、高活性LATS不敏感的YAP（YAP^2SA）

Discussion

在这项研究中，我们演示了一种将基于双透明酶的转录器检测方法结合在一起，用于识别和测试新的转录因子调节器的中通量筛选方法。在任何屏幕之前，对每个单元行的分型和优化报告系统至关重要。应进行实验，以确认报告者对正在调查的转录因子的活动变化有反应，并且应对照对照载体测试活动变化程度。PRL-TK构造与报告器构造的共转导非常重要，因为它有助于控制与报告器一起转染的细胞数和报告器构造的拷贝数，这两种结构都能改变荧光酶信号的大小。优化实验还应确保转录因子不影响组成Renilla构造或最小启动器构造的活动，因为这可能会使结果的解释复杂化。还应仔细考虑要包含在库中的控件。该协议是为具有数百个 shRNA 的库的"盲屏"而设计的，在其中无法确认每个 shRNA 的有效击倒。因此，一些误报和负数是可能的。增加屏幕中的技术和/或生物复制数量有助于减少误报和阴性数。然而，这也将大大增加水井的数量，并因此进行测定，因此应小心谨慎，确保这不会导致文化条件不理想（见下文）。减少误报和负数的另一种方法是在同一细胞线或其他细胞线中重复整个屏幕，或者筛选较小的库，包括仅使用 3 个生物复制的"命中"。在所有情况下，任何命中都应使用除报告器以外的读出进行验证...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.0 ml 96 孔深孔聚丙烯板	USA Scientific	1896-2000	用于细菌小量制备
胰蛋白酶 - 2.50%	Gibco	15090-046	胰蛋白酶-EDTA
96 孔平底白色检测板	康宁	3922	用于双荧光素酶检测
氨苄青霉素 - 100 mg/ml	Sigma-Aldrich	45-10835242001-EA	用于细菌小量制备
细菌胰蛋白胨 - 粉末	Sigma-Aldrich	95039	LB 肉汤的
成分 双荧光素酶报告基因检测系统，包括 LAR II 试剂（试剂 A）、Stop &Glo 底物（试剂 B 底物）和 Stop &Glo 缓冲液（试剂 B 缓冲液） - 试剂盒	Promega	E1960	用于双荧光素酶测定
不含钙、镁和酚红的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 - 9.6 g/L	Himedia	TS1006	用于 PBS
EDTA - 0.5 M	VWR	97061-406	胰蛋白酶-EDTA 乙醇的成分
- 100%	Pharmco-AAPER	111000200	用于细菌小量制备
胎儿牛血清 - 100%	VWR	97068-085	完整生长培养基的成分
溴化己二甲嘧啶（聚凝胺） - 8 mg/ml	Sigma-Aldrich	45-H9268	用于病毒感染
HyClone DMEM/高葡萄糖 - 4 mM L-谷氨酰胺;4500 mg/L 葡萄糖;丙酮酸钠	GE Healthcare 生命科学	SH30243.01	完整生长培养基的成分
I3-P/i3 多模式微孔板/EA	分子装置		用于双荧光素酶测定
L-谷氨酰胺 - 200 mM	Gibco	25030-081	完全生长培养基的组分
Lipofectamine 3000（转染试剂 2）- 100%	Life technologies	L3000008	用于转染
分子生物学 水 - 100%	VWR	02-0201-0500	用于稀释用于病毒包装的 shRNA 载体
NaCl - 粉末	BDH	BDH9286	LB 肉汤的成分
NanoDrop One 微量紫外-可见分光光度计	Thermo Scientific		用于测量载体 DNA 浓度
Opti-MEM（转染缓冲液） - 100%	Gibco	31985-062	用于转染
青霉素 链霉素 - 10,000 单位/ml（青霉素）;10,000 和微量;g/ml（链霉素）	Gibco	15140-122	完整生长培养基的组分
PureLink 快速质粒小量制备试剂盒 - 试剂盒	Thermo Fisher Scientific	K210010	用于细菌小量制备
嘌呤霉素 - 2.5 mg/ml	Sigma-Aldrich	45-P7255	用于感染后的抗生素选择
TC20 自动细胞计数仪	Bio-Rad		用于细胞计数
X-tremeGENE 9 DNA 转染试剂（转染试剂 1） - 100%	罗氏	6365787001	用于病毒包装
酵母提取物 - 粉末	VWR	J850	LB 肉汤
P3000 的成分（转染试剂 3） - 100%	Life technologies	L3000008	用于转染