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方法文章

利用阵列文库中通量筛选和双荧光素酶报告系统鉴定转录因子调控因子

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DOI：

10.3791/60582

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2020年3月27日

 , 
1Department of Molecular & Cellular Physiology, Albany Medical College

本文内容

摘要

为了鉴定转录因子的新调控因子，我们开发了一种方法，利用基于双荧光素酶的转录报告基因检测技术，对排列式慢病毒或逆转录病毒RNAi文库进行筛选。该方法能够在单次实验中快速且相对低成本地筛选数百个候选基因。

摘要

转录因子可以改变大量靶基因的表达，从而影响多种下游过程，因此是抗癌治疗的理想靶点。然而，直接靶向转录因子通常较为困难，如果该转录因子在一种或多种成体组织中具有必要功能，则可能引发不良副作用。识别在癌细胞中异常激活转录因子的上游调控因子提供了一种更为可行的替代策略，特别是当这些蛋白易于作为药物靶点时。本文介绍了一种实验方案，可结合阵列式中等规模的慢病毒文库与基于双荧光素酶的转录报告基因检测方法，用于鉴定癌细胞中转录因子的新调控因子。该方法能够在单次实验中快速、简便且低成本地检测数百个基因。为展示该方法的应用，我们对一个阵列式慢病毒RNA干扰文库进行了筛选，该文库包含多个Yes相关蛋白（YAP）和含PDZ结合基序的转录共激活因子（TAZ）的调控因子——YAP和TAZ是Hippo信号通路的下游效应转录共激活因子。然而，该方法也可经修改后用于筛选几乎任何转录因子或共因子的调控因子，并可用于CRISPR/Cas9、cDNA或ORF文库的筛选。

引言

本实验的目的是利用病毒文库以相对快速且经济的方式鉴定转录因子的调控因子。异常的转录活性与癌症及转移密切相关1,2,3,4,5,6，因此靶向癌细胞中的转录因子是一种有前景的治疗策略。然而，转录因子通常难以通过药物进行靶向干预7，且其中许多因子在成体组织的正常细胞功能中具有重要作用8,9,10。相比之下，靶向那些异常激活转录因子并驱动疾病进展的癌症相关通路是一种更为可行的策略，且可能带来较轻微的副作用。目前市场上已有阵列化的慢病毒和逆转录病毒RNAi、CRISPR/Cas9、cDNA或ORF文库，使研究人员能够在单次实验中评估大量基因的功能重要性。然而，该方法需要一种可靠的检测手段来反映转录活性的变化。

本文描述了一种基于双荧光素酶的转录报告基因检测方法，并结合阵列式慢病毒文库，用于鉴定调控癌细胞中转录因子的蛋白质。在该检测中，靶向癌症相关基因的shRNA通过慢病毒转导递送至哺乳动物癌细胞，并利用嘌呤霉素筛选获得稳定整合的细胞。随后，将细胞转染一种报告基因质粒，该质粒包含由特定启动子驱动的萤火虫荧光素酶，该启动子针对所研究的转录因子；同时转染一种对照质粒，该质粒包含由组成型活性启动子驱动的Renilla荧光素酶，且该启动子不受所研究的转录因子调控。我们以YAP和TAZ调控因子的原理验证性筛选为例展示该方法，YAP和TAZ是Hippo信号通路的关键下游效应分子8,10,11。YAP和TAZ的异常活性可促进转移级联反应的多个步骤11，并在多种癌症中被观察到11,12,13。然而，YAP和TAZ在某些癌细胞中如何发生异常激活尚不完全清楚。YAP和TAZ本身不直接结合DNA，而是通过与其他转录因子相互作用被招募至启动子区域。TEA结构域（TEAD）家族转录因子是YAP和TAZ的主要结合伙伴，对大多数YAP/TAZ依赖性功能至关重要。我们的报告基因质粒采用YAP/TAZ-TEAD响应性启动子驱动萤火虫荧光素酶表达，既往研究已证实该系统能够准确检测YAP-TEAD和TAZ-TEAD转录活性的变化2,14,15。

该方法快速、通量中等，无需筛选设备、自动化机器人或对混合文库进行深度测序。成本相对较低，且有多种市售文库可供选择。所需仪器和试剂在大多数实验室中也较为常规。只要存在或可构建基于荧光素酶的报告系统，该方法即可用于筛选几乎任何转录因子的调控因子。我们使用该方法在癌细胞中筛选shRNA，但任何转染效率合理的细胞系均可用于此类筛选，并可搭配任意类型的阵列文库使用。

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方案

注意：本方案的示意图总结见图1。

1. 慢病毒载体文库制备

注意：本实验所用的筛选方法采用了以甘油菌形式购入的96孔板装阵列式shRNA文库，但文库也可根据候选基因列表手动构建。任何文库都应考虑并包含适当的对照，包括非靶向对照shRNA（shNTC）、靶向所研究转录因子的对照shRNA，以及如有可能，靶向萤火虫荧光素酶的shRNA。

  1. 向96孔深孔板的每个孔中加入1.3 mL含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基（1% 胰蛋白胨、0.5% 酵母提取物、1% NaCl，pH 7.5）。每个孔接种2 µL甘油菌种，并在37 °C下以225 rpm持续振荡培养过夜。
  2. 将每种细菌培养物转移至1.5 mL离心管中，在4 °C下以21,000 × g 离心10分钟，使细菌沉淀。
  3. 按照试剂盒生产商提供的操作说明，使用细菌质粒小提试剂盒纯化每种载体。
  4. 使用分光光度计测定每种载体的浓度。
  5. 将质粒在-20 °C保存。
    注意：本实验流程可在此处暂停。

2. 阵列式慢病毒文库的包装

注意：所有涉及慢病毒的操作，包括病毒包装、感染以及感染后细胞的培养，均须严格遵守所在机构的生物安全规章制度。

  1. 使用完全生长培养基（含4 mM L-谷氨酰胺、4,500 mg/L葡萄糖和丙酮酸钠的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），并补充10%胎牛血清（FBS）、100单位/mL青霉素、100 µg/mL链霉素和2 mM L-谷氨酰胺）扩增293FT细胞。
  2. 针对步骤1.4中文库的每个载体，将1 × 105个293FT细胞接种至一个24孔板孔中。
    注意：建议额外包装若干孔对照病毒载体，用于在进入步骤3之前检测病毒滴度（见下文）。
  3. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。
    注意：此前已报道的慢病毒包装通用方案14已按比例缩小至24孔板规模。本方案使用psPAX2进行慢病毒包装，VSVG作为包膜蛋白。若需获得嗜同种病毒，可用携带Eco的载体替代VSVG。强烈建议优化本方案，以获得可使靶细胞感染效率达到30%-70%的病毒滴度（见讨论部分）。所有所用载体列表详见补充表1。
  4. 按照下述方法为步骤1.4中的每种病毒载体配制转染混合物。每次转染应包含250 ng病毒载体、125 ng psPAX2、125 ng VSVG、1.25 µL转染试剂1和23.75 µL转染缓冲液（见材料表）。
    1. 用无核酸酶水将每种慢病毒载体稀释至50 ng/µL，然后取5 µL（250 ng）加入96孔PCR板的一个孔中。
    2. 通过混合1.25 µL * X的转染试剂1与23.75 µL * X的预温转染缓冲液配制转染超级混合液，其中"X"为总转染次数加上若干额外量，以补偿移液过程中的体积损失。
    3. 将转染超级混合液在室温下孵育5分钟。
    4. 向步骤2.4.3中的转染超级混合液管中加入125 ng * X的psPAX2和125 ng * X的VSVG，轻轻吹打混匀。立即进入步骤2.4.5。
    5. 立即将步骤2.4.4中的混合液分装至PCR条板的各管中，然后使用多通道移液器将25 µL混合液转移至含有步骤2.4.1中病毒载体的各个孔中。
    6. 在室温下孵育20分钟。
    7. 将步骤2.4.6中每个96孔内的全部30 µL液体转移至含有步骤2.3中293FT细胞的24孔板孔中。
  5. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时，然后将24孔板中每孔的培养基更换为500 µL新鲜完全生长培养基。继续在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。
  6. 使用多通道移液器从每个孔中收集病毒上清液，并将220 µL（足够步骤3中一次感染使用并留有余量）分装至两个96孔中。这些即为阵列式病毒上清液板。
  7. 将阵列式病毒上清液板储存于-80 °C。
    注意：此处可暂停本实验流程。也建议在进入步骤3之前，使用前述包装的部分额外对照病毒对将要感染的细胞进行测试，以确保病毒滴度足以实现至少30%的感染效率。

3. 筛选实验的细胞感染

注意：本实验以人黑色素瘤细胞（A375）为例展示该方法，但该方法适用于任何可被慢病毒感染的贴壁细胞。然而，每种细胞系的细胞培养和铺板条件均需进行优化（见讨论部分）。

  1. 在完全培养基中扩增待感染的细胞。
  2. 在24孔板中每孔接种1 × 105个细胞，加入0.5 ml完全培养基。为每种待检测的病毒载体（包括对照）各接种一孔，并额外设置一个不进行感染的孔，作为第3.7步药物筛选的对照。
  3. 将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养24小时。
  4. 使用来自冻存阵列慢病毒上清液的不同病毒上清液，分别感染第3.2步中的各孔，操作如下：
    1. 配制含有20 µg/mL polybrene的完全培养基。
    2. 将第2.7步中阵列化的慢病毒文库上清液解冻至室温。
    3. 吸除第3.2步24孔板中的培养基，立即向每孔加入200 µL含polybrene的完全培养基。
    4. 使用多通道移液器，将第3.4.2步中每个96孔板的200 µL病毒上清液转移至第3.4.3步的24个孔中。
  5. 将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养24–48小时。
    注：某些细胞系可能需要超过24小时才能表达shRNA并获得嘌呤霉素抗性。此处使用的病毒载体携带一个Turbo-GFP-IRES-puroR结构，其中miR30为基础的shRNA位于puroR的3'UTR区域（图1）。通过绿色荧光蛋白监测病毒感染效率以及嘌呤霉素抗性基因和shRNA的表达情况。
  6. 配制含有2.5 µg/mL嘌呤霉素的完全培养基。
    注：不同细胞系对嘌呤霉素的筛选浓度有所不同。建议在筛选前对每种待测细胞系进行抗生素致死曲线实验，以确定最佳筛选浓度。
  7. 吸除各孔中的培养基，更换为500 µL含嘌呤霉素的完全培养基。
    注：务必同时向一个未感染的对照孔中添加嘌呤霉素，以便在后续步骤中确认嘌呤霉素筛选已完全发挥作用。
  8. 将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养48小时。
    注：建议筛选时间为48小时，因此应优化接种密度和病毒滴度，确保细胞在48小时前不过度融合。
  9. 在进行第4步前，需在荧光显微镜下确认感染的细胞呈现绿色荧光，且经嘌呤霉素处理的未感染对照孔中的细胞全部死亡。

4. 双荧光素酶报告基因转染的细胞接种

注意：对于每一种新细胞系，应进行预实验转染以确定最佳接种密度。

  1. 将第3.9步中的每个孔进行胰蛋白酶消化，并将约1 × 105个细胞转移至新的24孔板中对应位置的孔中，具体操作如下。
    注意：本实验方案适用于包含数百种shRNA文库的筛选，因此无法对每个感染孔的细胞进行精确计数。因此，采用以下步骤估算每个孔中的细胞数量，以帮助确保接种密度大致相等。
    1. 将第3.9步中的各孔分为3–4组，使每组内的所有孔具有相似的细胞密度。
    2. 从每组中选取一个代表性孔，加入200 µL含EDTA的胰蛋白酶溶液（含0.5 mM EDTA和0.1%胰蛋白酶的1×PBS），在37 °C孵育5分钟。然后加入400 µL含嘌呤霉素的完全培养基以中和胰蛋白酶-EDTA溶液。
    3. 对每个代表性孔进行细胞计数，确定总细胞数，并用完全培养基将每个代表性孔的细胞悬液稀释至2 × 105个细胞/mL。
    4. 将第4.1.3步中每个孔的0.5 mL细胞悬液（含1 × 105个细胞）接种至新的24孔板的对应孔中，并将该24孔板置于37 °C、5% CO2条件下培养24小时。
    5. 针对第4.1.1步中的每组，利用第4.1.3步测定的总细胞数，计算向每个孔中应加入的胰蛋白酶-EDTA溶液体积，使最终细胞悬液浓度达到1 × 106个细胞/mL。
    6. 向每个孔中加入相应体积的胰蛋白酶-EDTA溶液，并在37 °C孵育5分钟。
      注意：对于较大规模的筛选，建议将24孔板分组进行胰蛋白酶消化和重新接种，而不是一次性处理所有孔，以确保细胞活性。
    7. 在上述孵育过程中，使用多通道移液器向新的24孔板中对应孔加入400 µL含嘌呤霉素的完全培养基。
    8. 从每个孔中转移100 µL细胞悬液（约含1 × 105个细胞）至第4.1.7步准备好的新24孔板的对应孔中。
    9. 对第4.1.1步中分组的所有24孔板，依次重复第4.1.6至4.1.8步，每次处理一块板。
  2. 将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养24小时。

5. 双荧光素酶报告基因的转染

  1. 按照以下步骤，用双荧光素酶报告基因载体转染第4.2步中的每个孔。
    注意：在开始本实验前，应预先确定总DNA用量以及萤火虫荧光素酶报告基因载体与对照Renilla荧光素酶载体之间的最佳比例。本实验中使用了400 ng DNA混合物，其中包含20份萤火虫荧光素酶报告基因和1份对照Renilla荧光素酶。
    1. 通过将每种试剂的指定体积（见材料表）乘以总的转染孔数（另加若干额外量），分别配制转染稀释液（A管）和报告基因稀释液（B管）。
      注意：本方案已针对转染试剂2进行优化（见材料表）。若使用其他转染试剂，应在本步骤前完成转染条件的优化。
    2. 将转染稀释液（A管）与报告基因稀释液（B管）混合，室温孵育15分钟，以制备转染混合液。
    3. 在上述孵育期间，用0.25 mL磷酸盐缓冲液（PBS）清洗第4.2步中的每个24孔板孔，并向每孔加入447 µL完全培养基。
    4. 孵育15分钟后，使用多通道移液器将53 µL转染混合液加入24孔板的每个孔中。
  2. 将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。

6. 双荧光素酶活性的定量分析

  1. 使用酶标仪和双荧光素酶报告基因检测试剂盒测量荧光素酶活性，具体步骤如下。
    注意：本方案针对指定的报告基因检测试剂盒进行了优化（参见材料表），并遵循制造商推荐的操作流程。
    1. 通过将5倍浓度的被动裂解缓冲液（试剂盒提供）用去离子水按1:5比例稀释，配制足够量的1倍浓度被动裂解缓冲液（每孔需要75 µL），并额外多准备几孔用量。同时将试剂A和试剂B缓冲液（试剂盒提供，每孔各需100 µL）解冻。
    2. 从第5.2步的24孔板中各孔吸除培养基。
    3. 向每孔加入75 µL的1倍浓度被动裂解缓冲液，在室温下孵育30分钟，并偶尔轻轻振荡。
    4. 通过将50倍浓度的试剂B底物（试剂盒提供）与已解冻的试剂B缓冲液按1:50比例稀释，配制试剂B。
    5. 向4个孔中各加入30 µL的1倍浓度被动裂解缓冲液作为空白对照（参见补充表2）。
    6. 将第6.1.3步获得的裂解液各取30 µL转移至96孔白色平底检测板中的复孔内。
    7. 使用多通道移液器向每孔加入50 µL试剂A，并用酶标仪读取萤火虫荧光素酶信号。
    8. 使用多通道移液器向每孔加入第6.1.4步配制的试剂B 50 µL，并用酶标仪读取Renilla荧光素酶信号。
  2. 按以下方式处理原始数据（详细说明参见补充表2）。
    1. 排除Renilla荧光素酶信号极低的样品，因为低信号值表明病毒构建体具有毒性，或转染细胞数量过少。
      注意：如讨论部分所述，显著"偏低"的Renilla荧光素酶信号可能导致异常结果。本研究中，排除了Renilla荧光素酶信号低于平均值超过1个标准差的孔（参见补充表2）。该标准基于此前在这些细胞中使用该报告系统的研究14，但在其他细胞系中可能有所不同。
    2. 将每孔的原始萤火虫荧光素酶值除以同一孔的原始Renilla荧光素酶值，计算萤火虫/Renilla比值。
    3. 计算所有重复对照孔的萤火虫/Renilla比值的平均值，再将其他各孔的萤火虫/Renilla比值除以该平均值，得到相对变化倍数。
    4. 设定对照样品，并将其萤火虫/Renilla比值设为1。
    5. 对复孔的萤火虫/Renilla比值取平均值，并以标准差表示。
      注意：此处标准差不用于统计学分析，而是用于识别复孔间差异显著的孔。

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结果

我们的YAP/TAZ-TEAD报告基因质粒（pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) 包含一个带有5个经典TEAD结合元件（MCAT）重复序列的最小SV-40启动子15 驱动萤光素酶基因（图1）。它与PRL-TK对照载体（Promega）共转染入细胞，该载体表达 海肾 来自组成型活性HSV TK启动子的荧光素酶（图1）。必须确保YAP/TAZ-TEAD报告基因构建体在所测试的细胞系中表现符合预期。因此，我们首先将PRL-TK和pGL3-5xMCAT(SV)-49质粒共转染至稳定表达对照载体或一种高活性、LATS不敏感型YAP突变体（YAP2SA），或YAP的突变体

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讨论

在本研究中，我们展示了一种中等通量筛选阵列式病毒文库的方法，结合基于双荧光素酶的转录报告基因检测，可用于鉴定和验证转录因子的新调控因子。在开展任何筛选之前，针对每种细胞系对报告系统进行表征和优化至关重要。应通过实验确认报告基因对所研究转录因子活性变化具有响应性，并应检测其活性变化幅度相对于对照载体的水平。共转染PRL-TK质粒与报告基因质粒非常重要，因为它有助于校正转染报告基因的细胞数量以及报告基因质粒的拷贝数，这两者均可能影响荧光素酶信号的强度。优化实验还应确保转录因子不会影响组成型启动子驱动的内参报告基因（如TK启动子）的活性 海肾 构建或最小启动子构建，因为这可能会使结果的解释复杂化。文库中应包含的对照也需仔细考虑。本方案适用于 "盲筛" 包含数百个shRNA的文库，由于无法对每个shRNA的有效沉默效果逐一验证，因此可能会出现一定数量的假阳性和假阴性结果。增加筛选过程中的技术重复和/或生物学重复次数有助于减少假阳性和假阴性。然而，这也会显著增加需要培养和检测的孔数，因此需谨慎操作，避免导致培养条件不理想（见下文）。另一种减少假阳性和假阴性的策略是，在同一细胞系或额外的细胞系中重复整个筛选实验，或...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Emily Norton 和 Mikaelan Cucciarre-Stuligross 在 shRNA 载体制备过程中的协助。本工作部分得到了 Susan G. Komen Career Catalyst 基金的支持，该基金授予了 J.M.L.（#CCR17477184）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2.0 ml 96孔深孔聚丙烯板USA Scientific1896-2000用于细菌质粒小提
胰蛋白酶 - 2.50%Gibco15090-046胰蛋白酶-EDTA 的组分
96孔平底白色检测板Corning3922用于双荧光素酶检测
氨苄青霉素 - 100 mg/mlSigma-Aldrich45-10835242001-EA用于细菌质粒小提
胰蛋白胨 - 粉末Sigma-Aldrich95039LB 培养基的组分
双荧光素酶报告基因检测系统，包含 LAR II 试剂（试剂A）、Stop & Glo 底物（试剂B底物）和 Stop & Glo 缓冲液（试剂B缓冲液）- 试剂盒PromegaE1960用于双荧光素酶检测
不含钙、镁和酚红的杜氏磷酸盐缓冲液 - 9.6 g/LHimediaTS1006用于 PBS
EDTA - 0.5 MVWR97061-406胰蛋白酶-EDTA 的组分
乙醇 - 100%Pharmco-AAPER111000200用于细菌质粒小提
胎牛血清 - 100%VWR97068-085完全生长培养基的组分
六亚甲基溴化铵（Polybrene）- 8 mg/mlSigma-Aldrich45-H9268用于病毒感染
HyClone DMEM/高糖 - 4 mM L-谷氨酰胺；4500 mg/L 葡萄糖；丙酮酸钠GE Healthcare life sciencesSH30243.01完全生长培养基的组分
I3-P/i3 多功能微孔板检测仪Molecular devices用于双荧光素酶检测
L-谷氨酰胺 - 200 mMGibco25030-081完全生长培养基的组分
Lipofectamine 3000（转染试剂2）- 100%Life technologiesL3000008用于转染
分子生物学用水 - 100%VWR02-0201-0500用于稀释shRNA载体以进行病毒包装
NaCl - 粉末BDHBDH9286LB 培养基的组分
NanoDrop One 微量紫外-可见分光光度计Thermo scientific用于测定载体DNA浓度
Opti-MEM（转染缓冲液）- 100%Gibco31985-062用于转染
青霉素-链霉素 - 10,000 单位/ml（青霉素）；10,000 µg/ml（链霉素）Gibco15140-122完全生长培养基的组分
PureLink 快速质粒小提试剂盒 - 试剂盒Thermo Fisher ScientificK210010用于细菌质粒小提
嘌呤霉素 - 2.5 mg/mlSigma-Aldrich45-P7255用于感染后的抗生素筛选
TC20 自动细胞计数仪Bio-Rad用于细胞计数
X-tremeGENE 9 DNA转染试剂（转染试剂1）- 100%Roche6365787001用于病毒包装
酵母提取物 - 粉末VWRJ850LB 培养基的组分
P3000（转染试剂3）- 100%Life technologiesL3000008用于转染

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阵列式慢病毒文库双荧光素酶报告基因YAP/TAZ调控Hippo信号通路筛选RNAi文库筛选病毒载体生产荧光素酶活性检测嘌呤霉素筛选
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