本文介绍了两种实验方案：1）针对联邦濒危物种迈阿密蓝蝶（Cyclargus thomasi bethunebakeri）的实验室人工繁育，以及 2）评估其基本生活史信息，例如未成熟阶段的发育时间及幼虫龄期数量。这两种方法均可根据需要调整，适用于其他迁地保护项目。
本文内容
摘要
摘要
提高对濒危蝴蝶迁地保护最佳实践的认识，对于实现成功的保护和恢复项目成果至关重要。对这类人工饲养种群的研究还可提供宝贵数据，有助于填补目标分类群在行为、生活史及生态学方面的关键信息空白。本文描述了一种针对联邦濒危物种贝氏托马斯蓝灰蝶（Cyclargus thomasi bethunebakeri）的人工繁育方案，该方案可作为其他濒危蝴蝶迁地保护项目的参考模型，尤其适用于灰蝶科（Lycaenidae）物种。此外，我们还提供了一套简单明了的记录多种生活史参数的方法，这些参数不仅有助于优化迁地保护技术，也可适用于其他鳞翅目（lepidoptera）昆虫的实验室研究。
引言
越来越多的研究表明，全球蝴蝶种群正在经历广泛而严重的衰退1,2,3,4,5，其中包括绝大多数濒危物种。为减缓此类衰退而设计的保护项目通常采用多种策略相结合的方式，包括种群监测、栖息地管理与恢复、科学研究、人工繁育以及个体迁移6。仅在美国及其属地范围内，就有共计30个蝴蝶分类单元被《濒危物种法案》（ESA）列为受威胁或濒危物种，其中21个已制定获批的草案或最终恢复计划。对于这些分类单元，超过一半已确定的恢复策略建议实施人工繁育，或明确指出应评估开展人工繁育的可行性7。近年来，针对蝴蝶的迁地保护工作显著增加8,9，并有望成为支持恢复工作的一项关键工具10。目前，众多机构、组织和政府部门正参与至少11个列入ESA的蝴蝶分类单元（即 Cyclargus thomasi bethunebakeri, Euphydryas editha quino, Euphydryas editha taylori, Heraclides aristodemus, Hesperia dacotae, Lycaeides melissa samuelis, Oarisma poweshiek, Pyrgus ruralis lagunae 和 Speryeria zerene hippolyta）以及其他多个濒危分类单元（例如 Callophrys irus, Euphydryas phaeton, Speyeria idalia 和 Eumaeus atala）的迁地保护工作11。尽管已有大量坚实且成功的保护实践，但各项目之间以及保护从业人员之间的常规交流仍然不足，缺乏思想、数据、有效方法和成果的共享。此类知识共享至关重要，有助于最大限度减少重复劳动，提升整体最佳实践水平，并增强保护成效。目前，针对濒危蝴蝶分类单元的提前孵化、人工饲养、繁殖或养护方案中，公开发布的操作规程极为有限，且其中许多缺乏足够的叙述性细节和/或图示说明。这些资料通常仅提供概括性信息，缺少详细的分步操作指导及配套图像，导致难以复制，或难以评估其在其他分类单元中的适用性12,13,14,15。许多现有规程在某些方面存在局限：它们仅存在于灰色文献中，或详细程度不一、出版时间久远，或仅作为研讨会论文集、机构/资助方报告或内部手册中的部分内容出现16,17,18,19,20,21,22,23,24。
对于大多数保护项目而言，圈养繁殖主要用于支持保护性迁移，包括再引入、种群强化（即增补）以及引种25,26。这些活动应作为整体恢复策略的组成部分，有计划地实施，以帮助防止某一列入保护名录的物种、亚种或种群灭绝。然而需要注意的是，这只是此类迁地保护项目可能发挥的多种作用之一。其他作用还包括维持保险种群（即避难种群）、临时性个体救助、支持与恢复相关的研究和/或培训，以及促进与保护相关的教育和公众意识提升27,28。无论迁地保护项目具有单一明确目标还是多重目标，保护实践者都应尽可能充分利用机会收集数据，以填补关键的信息空白。这一点尤为重要，因为在野外种群数量显著下降之前，绝大多数受威胁分类单元通常缺乏充分的研究。由此获得的有关目标分类单元在行为、生态或生活史等方面更深入的知识，有助于推动有效的物种保护与管理29。
本文详细描述了为联邦濒危物种迈阿密蓝蝶（Cyclargus thomasi bethunebakeri）（补充图1）所开发的人工繁育方案，该方案是更大规模保护与恢复计划的一部分。在此情况下，人工繁育项目具有三个明确的功能：1）作为现有野生种群一旦消失时的保险种群；2）作为研究种群，旨在填补已知的生态学与生活史知识空白，从而为恢复和/或管理提供科学依据；3）生产具有生存能力的个体，用于在该分类单元历史分布范围内的保护性迁移。该方案经过充分验证并已被证明有效，已持续使用并不断优化超过十年。因此，我们认为所描述的技术与方法代表了一种可行的模式，可直接应用于或易于调整后适用于其他迁地保护的濒危蝴蝶项目，特别是涉及灰蝶科（Lycaenidae）或相关类群的项目。尽管我们并不认为所描述的方案优于其他方案，但我们认为其中部分方法具有更广泛的应用潜力，有助于提升繁殖效率、个体护理水平或操作效率。这一点尤其重要，因为我们的大部分繁殖工作是在室内实验室条件下进行的，空间有限，这与涉及 Euphydryas editha taylori 和 Speryeria zerene hippolyta17,23 的保护项目类似。许多其他方案常使用盆栽植物用于产卵或幼虫饲养，这有时会带来一系列复杂问题，例如天敌控制、环境控制（如湿度、温度）、个体监测、数据收集、植物病虫害以及空间占用等21,22。最后，本文所述方案重点介绍人工繁殖的方法。许多其他濒危蝴蝶保护项目则采用提前孵化（head-starting）或人工饲养策略，其代表性方案也反映了这些差异。尽管这些差异通常较小，但我们认为这有助于拓宽可供其他项目参考的信息资源。这一点至关重要，因为大多数迁地保护项目均为开创性尝试，旨在促进稀有且常缺乏研究的分类单元的恢复。现有方案可作为极佳的起点，为提供宝贵见解、减少重复劳动以及推动创新发挥重要作用。由于"蝴蝶物种间在行为、生活史特征及生态需求方面存在广泛差异，加之各保护项目的设施条件、预算、实践者专业水平"及其他内在因素常有显著不同，即使对于亲缘关系较近的类群，依赖单一方法通常也具有局限性且不合理30。因此，必须强调根据特定物种或项目的需求灵活优化或开发新方案，这对成功至关重要。此外，我们还描述了在人工饲养条件下收集个体发育指标的实验室技术，包括幼虫龄期数量、各发育阶段持续时间、总发育时长以及幼虫和蛹的体长。这些技术在鳞翅目昆虫生活史研究中具有广泛适用性，可用于优化迁地保护方案或补充野外数据。
方案
1. 确保成虫成功求偶与交配
- 成功羽化后，将健康的成虫蝴蝶释放到温度可控温室内的安全步入式纱网飞行笼中（补充图2）。
注意：若需区分特定个体，例如用于分离不同遗传品系、种群来源，或与个体寿命、行为等相关的特定数据采集，可用永久性记号笔在翅膀腹面进行标记。- 虽然飞行笼的具体尺寸可有所变化，但应确保有足够的空间容纳充足的蜜源植物材料，以满足所饲养成虫密度的需求，同时为人员提供可自由站立和转身的空间。
- 除温度调控外，应确保温室结构安全，以提供第二层生物 containment，并防止恶劣天气（如大雨、强风）的影响。
- 将盆栽蜜源植物抬高，使笼内顶部与最高开花部位之间的距离不超过30 cm（补充图2）。这有助于成虫最优化地获取可利用的花蜜资源，提供充足的停落位置，并减少不必要的飞行活动。
- 在飞行笼内放置一盆寄主植物。此举可确保即使遗漏了交配对，其产下的卵仍可被收集。
- 提供持续的空气流动。这有助于增强求偶行为和提高交配成功率。在温室环境中，使用鼓风机或固定安装的循环风扇最有利于改善通风和空气流动。小型便携式通风设备（如箱式风扇或台式风扇）也可使用。
- 将温室内温度维持在27 °C至32 °C之间，以促进成虫的最佳活动状态和交配成功率。笼内温度通过可追溯的记忆型温控监测仪进行监控。
- 定期（约每2小时一次）使用手动喷雾泵、塑料储液喷雾器或花园软管向纱网飞行笼喷水雾。
- 使用50 dram透明塑料带盖小瓶（材料表）从纱网飞行笼中轻柔地采集单个交配对，每瓶放置一至两对，并转移至室内饲养室或实验室（补充图3）。
2. 最大化卵产量
- 组装产卵室。
- 取一个12盎司的 plain white 纸杯，使用 snap blade 工具刀在纸杯两侧相对的位置各做两条水平切口。每条切口应位于杯口下方约1 cm处。
- 将一根棉签剪成两半，将每半的杆部插入纸杯两侧的水平切口中，使棉签的棉头部分向杯内延伸约2 cm。
- 使用 snap blade 工具刀在纸杯底部做两个"X"形切口。每条斜切口长度约为1 cm。
- 取一个9盎司的塑料杯，在底部加入约2 cm的自来水。
- 取一段约15 cm长的新鲜幼虫寄主植物顶端嫩枝，将其茎部穿过纸杯底部的一个"X"形切口插入纸杯中。推动茎部穿过切口，使其底部伸出约4–5 cm。
- 将装有寄主植物材料的纸杯放入塑料杯中，确保植物茎部浸入水中。
- 用1 ml的皮下注射器（0.45 mm × 16 mm）吸取风味运动饮料，润湿纸杯中的两根棉签。这些棉签充当人工花朵。
注：甜瓜味和水果宾治味的运动饮料是最佳的花蜜替代品。 - 待每对交配完成分离后，将2–3只 gravid 雌蝶放入组装好的杯式结构（即产卵室）中。
- 用一块约15 cm × 15 cm的黑色薄纱布片覆盖杯口，并用橡皮筋固定在杯口周围（补充图4）。黑色薄纱可提供最佳的观察视野，便于识别偶尔产在纱布上的卵。
- 刺激成蝶活动与产卵。
- 将每个产卵室放置在实验台或桌面上，置于一个带有铝制反光罩的8.5英寸（21.59 cm）夹式灯具正下方约19 cm处，灯内安装40 W白炽灯泡（补充图5）。
注：白炽灯提供刺激成蝶活动和产卵所需的辐射热。 - 在灯具旁放置一个可追溯记忆的温度监测计，并将温度传感器放置在正对夹灯下方的产卵室顶部。
注：目标温度范围为27.5 °C–29 °C。 - 根据部署的产卵室总数，按需增加额外的夹式灯具。
- 将夹式灯具插入一个可编程的15安培24小时室内机械定时插座（双插座，可按30分钟间隔编程）。
- 设置定时器，使夹式灯每30分钟开启一次（即重复循环：开启30分钟，关闭30分钟）。
注：此光照周期通过提供可重复的光照时段以刺激成蝶活动和产卵，随后给予短暂黑暗休息期，有助于最大化产卵量。 - 每隔约2–3小时或根据需要，使用皮下注射器为每个杯中的棉签补充风味运动饮料，并用塑料喷雾瓶定期喷水雾。
注：此举可为蝴蝶提供充足的人工花蜜和湿度，使其自由取食，从而在难以使用活体开花植物材料的实验室条件下，延长成虫寿命并提高产卵效率。 - 定期检查杯体，并根据需要更换寄主植物为新鲜枝条。
- 当卵开始孵化或卵密度过高时，将雌蝶转移至装有新鲜寄主植物的新杯中，并对初孵幼虫启动幼虫培养方案。
- 将每个产卵室放置在实验台或桌面上，置于一个带有铝制反光罩的8.5英寸（21.59 cm）夹式灯具正下方约19 cm处，灯内安装40 W白炽灯泡（补充图5）。
3. 幼虫的护理与维持
- 重复步骤 2.3–2.6，组装用于幼虫的培养杯。
- 当卵开始孵化时，将带有卵和初孵幼虫的寄主植物材料转移至新组装的杯中，将茎穿过第二个孔 "X" 确保植物茎部浸入水中，且叶片接触相邻的新鲜寄主切段。
- 当幼虫处于低龄期（初孵至2龄）时，每天检查幼虫杯中寄主植物材料的新鲜程度，并观察是否有霉菌或过多的粪便。
注意：幼虫早期不建议每天更换寄主材料，因为操作可能导致生物体受伤和/或不必要地消耗新鲜寄主材料。 - 若寄主材料萎蔫或处于其他不良状态，可将另一份新鲜寄主材料放入杯中，使其接触原有叶片，让幼虫自行迁移至新的寄主上。
- 幼虫达到3龄后rd 幼虫龄期，每日更换纸杯并添加新鲜寄主材料。
- 使用小型驼毛水彩画笔将幼虫从旧的寄主材料或杯壁表面轻轻转移至新杯子中的新鲜寄主材料上。
- 将旧的寄主材料放入一个空的矩形塑料食品储存盒中。
- 每日重复步骤 3.5–3.7，直至所有含幼虫的杯子均处理完毕。
- 完成后，在食物储存容器内的植物废弃物上方添加少量新鲜的寄主材料，并将盖子 loosely 盖上。
注意：此步骤可作为安全措施，以防在日常处理过程中遗漏任何幼虫，因为这些幼虫会爬到植物废料上方的新寄主材料上，可在第二天清除。 - 将培养杯置于25 °C–28 °C的实验室温度下，以保证幼虫的最佳活动状态和发育（补充图6).
注意：在室内条件下，为达到最佳饲养温度，通常需要将饲养杯置于带有铝制反光罩的40 W白炽灯夹灯下方。随后可使用可追溯记忆型监控温度计实时监测温度，并调节灯的高度以达到最佳饲养条件。
4. 构建化蛹室
- 将单面瓦楞纸卷裁剪成大小相等的 3.8 cm × 3.8 cm 正方形。
- 取一张正方形放入一个 2 盎司透明塑料分装杯中。
- 将杯子放置在透明塑料杯托上（补充图 7）。
5. 准备幼虫化蛹
- 在每日的种群处理过程中，识别即将化蛹的成熟幼虫。
注意：此类幼虫体色将变为均匀的暗黄褐色，失去体节上的V形斑纹，并常常离开寄主四处爬行。 - 使用小型驼毛水彩画笔或镊子轻轻取出每只成熟幼虫，并将其放入一个化蛹室中。
- 将透明塑料盖紧密扣合在化蛹室上。
- 重复步骤5.1–5.3，直至所有准备化蛹的幼虫均被转移至化蛹室，必要时添加新的塑料托盘（补充图8）。
6. 蛹的维持
- 对于每盘蛹室，记录首次化蛹的日期以及所需的其他相关信息（例如，遗传品系、实验批次等）。
- 按日期整理各盘，并将其放置于实验室内的安全位置（补充图8）。
- 每日监测各盘成虫羽化情况。
注意：实验室环境条件（如温度）将显著影响发育时间。 - 在成虫羽化前（通常在首次化蛹后10天内），取下各个蛹室的盖子，将整盘放入一个34.29 cm x 34.29 cm x 60.96 cm的可折叠网状弹出式饲养笼中（补充图9）。
注意：蛹牢固附着在瓦楞纸方块的沟槽内，有助于成虫顺利羽化（补充图10）。 - 对后续人工饲养世代，重复从步骤1.1开始的整个实验流程。
7. 评估未成熟阶段的发育时间及龄期数量
- 将单个幼虫置于解剖显微镜下。使用小型骆毛水彩画笔小心移动和分离幼虫，以避免对生物体造成损伤。
- 将画笔的一根毛蘸取无毒发光涂料（材料表），然后小心地在幼虫背部（背侧）放置一小滴涂料。选择一种与幼虫背景色和图案色形成鲜明对比的涂料颜色（补充图11）。注意避免将涂料涂在幼虫头部。
- 待涂料干燥后（约30秒左右），将每只幼虫分别放入一个2盎司透明塑料分装杯中，杯内放置约1–3片新鲜的末端寄主植物叶片，并在杯体和杯盖上标注唯一的识别编号（补充图12）。
- 每天仔细检查每只幼虫。取出叶片并放置于白色表面，利用解剖显微镜检查杯体、透明杯盖及叶片，观察是否存在幼虫蜕皮（蜕下的皮）和/或头壳。
- 若发现幼虫蜕皮，应将其从杯中取出，并放入已标记对应杯号及日期的微量离心管中（见下文步骤8.1–8.6）。
- 每次蜕皮后重新为幼虫涂标记，并记录蜕皮日期。
- 使用数字卡尺每日测量每只幼虫的总身体长度（从头部至最后一腹节）。测量三次，记录三次测量的平均值，并注明日期和时间。对于早期龄期幼虫，测量时应使用放大镜或解剖显微镜，以确保测量准确。
- 将幼虫放回对应的塑料分装杯中。
- 根据需要添加新鲜寄主材料，并清除所有虫粪及旧的寄主残渣。若发现杯中有霉菌生长，应丢弃该杯并更换新杯，同时在新杯上正确标注相应的唯一识别编号。
- 重复步骤7.5–7.9，直至所有幼虫进入末龄并开始前蛹期。当幼虫停止进食、体色变为均匀的暗黄褐色、失去体表的V形斑纹且常离开寄主植物时，应尽量减少干扰。
- 在杯内放入一小片瓦楞纸（见步骤4.1）。
- 每只幼虫完全化蛹后，参照上述步骤7.8测量其总长度，并记录化蛹日期。此为每只个体的最后一次蜕皮。
- 每天检查蛹的情况，记录每只成虫羽化的日期及其性别。
- 使用数字卡尺测量每只蝴蝶的翅弦长。可用镊子轻轻夹持蝴蝶进行测量。若蝴蝶活动过于频繁难以测量，可暂时将其放入冰箱冷藏30秒或更短时间内，然后再次尝试。
8. 收集幼虫蜕皮
- 当观察到幼虫蜕皮后，用 0.2 µl 甘油填充一个微量离心管。在管盖顶部和侧面标记幼虫编号、蜕皮日期及头壳（H.C.）。
注意：某些鳞翅目幼虫通常会摄食其蜕下的外皮，但头壳应会保留下来。 - 将幼虫蜕皮及其相关的头壳放入透明塑料小杯盖中，并加入数滴乙醇。
- 将幼虫蜕皮置于透明塑料小杯盖中，滴加数滴乙醇，然后在解剖显微镜下进行观察。若幼虫头壳已与蜕皮分离，可在尖头昆虫镊子尖端滴一滴甘油，轻轻接触头壳，将其粘起，随后放入对应的微量离心管中。
- 若头壳仍附着于幼虫蜕皮上，可使用尖头镊子和昆虫针将其从蜕皮中分离。
- 分离后，使用甘油法拾取头壳。若乙醇过多，可用小片纸巾吸除部分液体，但需小心避免误将头壳一同移除。
- 将头壳放入已标记且盛有甘油的样品管中，盖紧管盖。
结果
在2003年2月至2010年12月以及2016年11月至今开展的两次独立保护行动中，本方案成功繁育出超过51,052只具有生存能力的个体。根据2018年6月至2019年6月期间为期一年的总体圈养种群繁殖力汇总数据，共繁育出10,166只具有生存能力的个体，平均每月繁育782.00 ± 118.93只，跨越13个世代。类似地，在实验室条件下，每只雌蝶平均产卵量为114.00 ± 26.12枚（n = 12）31。如此显著的个体繁殖效率使本项目成为美国规模最大的迁地保护项目之一，与 Euphydryas editha taylori、Speyeria zerene hippolyta 和 Lycaeides melissa samuelis 的保护项目并列24。部分成功可归因于该蝴蝶在人工饲养条件下可连续繁殖，大约每4–6周即可完成一个世代。而大多数其他保护性繁育项目所涉及的物种通常为一年一代或一年两代。然而，即使对于 Speyeria spp. 等繁殖力极高的类群，每年用于保护性再引入的可存活个体数量通常也仅数千只32。因此，本项目的圈养种群不仅支持了定向科学研究，还实现了对多个关键数据空白的广泛数据采集，有助于优化实验室繁育与饲养管理的最佳实践（图1），并为恢复与管理决策提供科学依据。
从新生幼虫到成虫的平均总发育时间为 28.63 天（表 1）。大多数幼虫经历四次蜕皮（图 2、图 3），但有两例经历五次蜕皮，一例经历六次蜕皮。所有幼虫龄期的平均总体长度为 5.97 mm，幼虫在第四龄期和预蛹期体型最大（表 1）。当仅包含观测值超过 30 个的变量时，第一龄期和预蛹期持续时间最短，蛹期持续时间最长（表 1、图 2）。在所有未成熟阶段中，雌性通常比雄性发育更快，但该差异无统计学意义（p = 0.625）。统计分析使用 RStudio 版本 1.1.463（R Core Team 2016）33 进行。成虫平均翼弦长度为 12.64 mm（表 2），两性之间存在显著差异（p = 0.047）。采用双侧 t 检验评估两性间翼弦长度的差异。针对各生活阶段平均长度的线性回归模型和逐步回归分析显示，蛹期长度是成虫翼弦长度的最佳预测因子（表 3、表 4）。关于发育时间的回归模型表明，第二和第四龄期所经历的天数以及总天数是成虫翼弦长度的最佳预测因子，但仅有第四龄期的天数具有显著性（表 5、表 6）。由于变量为连续型变量，分别建立了两个以成虫翼弦长度为因变量的线性回归模型，用于分析各生活阶段的发育时间和各生活阶段的长度。对这两个回归模型均进行了逐步回归分析，以确定成虫翼弦长度的最佳预测因子。
补充图1：Cyclargus thomasi bethunebackeri成虫标本。（A）成年雄性，背面（左），腹面（右）。（B）成年雌性，背面（左），腹面（右）。请点击此处查看该图的高清版本。
补充图2：置于温控温室中的防逃逸飞行笼。（A）笼内显示盆栽的成年蜜源植物和一株盆栽的幼虫寄主植物。（B）金属货架用于抬高蜜源植物盆栽，使笼体内部顶端与最高开花部位之间的垂直距离不超过30 cm。请点击此处查看该图的高清版本。
补充图3：采集交配中成虫对的操作流程。（A）在纱网飞行笼内交配的成虫对 Cyclargus thomasi bethunebakeri（右侧为雌性，左侧为雄性）。（B）从飞行笼中采集的交配对，置于带盖小瓶中并转移至实验室。请点击此处查看该图的高清版本。
补充图4：产卵室组装步骤。（A）双杯系统，包含末端寄主材料和棉签。（B）一支1 ml皮下注射器（0.45 mm × 16 mm），用于将风味运动饮料滴加至纸杯中的棉签上使其饱和。（C）装有怀卵雌虫的杯子，用黑色网纱固定。 请点击此处查看该图的放大版本。
补充图5：最大化产卵量的实验室设置。（A）产卵室置于实验台面上，上方为带有40 W白炽灯泡的夹式灯具。（B）可追溯记忆型监控温度计放置在灯附近，其温度传感器置于正对夹式灯下方的产卵室顶部。（C）一支1 ml皮下注射器和一个盛有调味运动饮料的小烧杯放置在产卵室旁，以便在全天定期更换棉签时使用。请点击此处查看该图的放大版本。
补充图6：幼虫饲养与维护的实验室装置。（A）双杯系统，每个杯子中均含有新鲜的末端寄主材料和幼虫。（B）通过上方夹持式灯具配备40 W白炽灯泡，将杯子内的温度维持在25 °C–28 °C之间，以保证幼虫最佳的活动性与发育状态。（C）使用带有可追溯记忆功能的监控温度计，将温度传感器直接插入杯中以监测温度。请点击此处查看该图的放大版本。
补充图7：准备好的化蛹室。（A）透明塑料杯托盘上放置的单个塑料分装杯。（B）每个塑料分装杯中放入一块瓦楞纸片。（C）每个准备好的塑料分装杯中将放入一条成熟的幼虫进行化蛹。请点击此处查看该图的放大版本。
补充图8：幼虫化蛹前准备及蛹期维持。（A）已发育成熟的幼虫，准备在瓦楞纸上化蛹。此时体色呈均匀的暗黄褐色，体表的倒V形斑纹已完全消失。（B）化蛹盒已准备好接收成熟幼虫，旁边为正在取食的幼虫培养杯。所有带盖的化蛹盒中均放置了即将化蛹的幼虫。（C）装有蛹的化蛹盒。（D）按日期分类排列的化蛹盒阵列，在实验室条件下进行维持培养。请点击此处查看该图的高清版本。
补充图9：实验室羽化笼装置。（A）可折叠网状弹出式饲养笼，内含已放置蛹室的容器。（B）移除所有蛹室的盖子，以促进成虫顺利羽化。（C）所有成功羽化的健康成虫将被释放至带筛网的飞行笼中，以确保成功交配。请点击此处查看该图的高清版本。
补充图10：雄性成虫蝴蝶成功从蛹中羽化，位于瓦楞纸方块上。（A）成虫从蛹中羽化。（B）成虫完全脱离蛹壳。（C）成虫处于展开翅的位置。（D）成虫正在展开翅。请点击此处查看该图的高清版本。
补充图11：用无毒发光颜料标记的五龄幼虫。（A）使用画笔将一小滴对比明显的红色无毒发光颜料涂于幼虫背部，成功实现标记。请点击此处查看该图的放大版本。
补充图12：生活史研究的饲养装置。（A）带有唯一编号的2盎司透明塑料分装杯。（B）每个杯子中隔离饲养一条幼虫。（C）所有幼虫从初生幼虫到成蝶的各个发育阶段均被单独追踪记录。请点击此处查看该图的高清版本。
图1：在温控温室中设置的步入式防虫飞行笼内，不同温度（°C）下记录到的正在交配的成对个体数量。 温度数据记录于成功配对事件开始的前2分钟内（n = 411）。所得数据用于优化受控环境条件，以最大限度提高交配成功率，进而提升人工繁育的整体效率。请点击此处查看此图的高清版本。
图 2：各未成熟生命周期阶段的平均发育时间（天数）。（A）柱状图表示各组的平均值，误差线表示每组的上下标准差值。（B）深蓝色柱代表雌性，浅蓝色柱代表雄性。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：使用生活史方案从个体#25采集的头壳。 头壳由Johnathan Bremer使用自动层叠成像系统拍摄。请点击此处查看此图的放大版本。
| 发育阶段 | 平均体长（mm） | 体长标准误 | 平均发育时间（天数） | 发育时间标准误 |
| 一龄幼虫 | 1.69478261 (n=23) | 0.02152643 | 2.90625 (n=32) | 0.08229783 |
| 二龄幼虫 | 2.77248958 (n=32) | 0.04302826 | 3.375 (n=32) | 0.16649857 |
| 三龄幼虫 | 5.45751042 (n=32) | 0.12120829 | 3.5 (n=32) | 0.20080483 |
| 四龄幼虫 | 10.2369688 (n=32) | 0.23653991 | 3.875 (n=32) | 0.18917265 |
| 五龄幼虫 | 8.7625 (n=2) | 2.6125 | 1.5 (n=2) | 0.5 |
| 六龄幼虫 | 10.2666667 (n=1) | NA | 3 (n=1) | NA |
| 预蛹 | 11.0858333 (n=24) | 0.23948251 | 2.9375 (n=32) | 0.21504641 |
| 蛹 | 9.0316129 (n=31) | 0.12106792 | 11.6578947 (n=38) | 0.3272288 |
表1：各生活史阶段的平均长度和发育时间。 每个变量均包含标准误差，括号内为样本量。
| 生命阶段 | 平均翅长（mm） | 标准误 |
| 成体 | 12.63895 (n=38) | 0.1365516 |
| 雌性 | 12.960 (n=13) | 0.1465588 |
| 雄性 | 12.472 (n=25) | 0.1863205 |
表2：成年蝴蝶前翅翼弦长度的平均值。 包括雌性、雄性以及所有成年个体（两性合并）的平均值。
| 线性模型 1 | 估计标准误 | t 值 | p 值 |
| 截距 | 1.9179 | 3.128 | 0.0046 ** |
| 二龄幼虫平均长度 | 0.6822 | -1.11 | 0.278 |
| 三龄幼虫平均长度 | 0.2928 | 0.476 | 0.6381 |
| 四龄幼虫平均长度 | 0.1373 | -0.57 | 0.5739 |
| 蛹平均长度 | 0.246 | 3.957 | 0.0005 *** |
| *** p < 0.001；** p < 0.01；* p < 0.05。 | |||
表3：线性回归模型（LM模型1）的系数表，用于评估各生活史阶段平均长度（分析中包含 n > 30 的样本）与成年个体翼弦长度之间的关系。 因变量：成年个体翼弦长度（mm）。
| 系数 | 估计值的标准误差 | t 值 | Pr (>|t|) |
| 截距 | 1.7091 | 3.031 | 0.0053 ** |
| 蛹的平均长度 | 0.1878 | 4.414 | 0.0002 *** |
表4：逐步回归分析（逐步回归1）。 因变量：成鸟翼弦长（mm）。
| LM 模型 2 | 估计标准误 | t 值 | p 值 |
| 截距 | 1.1888 | 12.643 | 4.21e-12 *** |
| 一龄幼虫天数 | 0.3486 | 0.937 | 0.3583 |
| 二龄幼虫天数 | 0.2603 | -0.686 | 0.4993 |
| 三龄幼虫天数 | 0.2281 | 1.028 | 0.3141 |
| 四龄幼虫天数 | 0.2048 | 2.378 | 0.0257 * |
| 预蛹期天数 | 0.222 | 1.133 | 0.2686 |
| 蛹期天数 | 0.2495 | 0.616 | 0.5435 |
| 总天数 | 0.1913 | -1.454 | 0.1589 |
| *** p < 0.001；** p < 0.01；* p < 0.05。 | |||
表5：用于评估发育时间与成鸟翼弦长度之间关系的线性回归模型（LM模型2）的系数表。 因变量：成鸟翼弦长度（mm）。
| 系数 | 估计标准误差 | t 值 | p 值 |
| 截距 | 0.89304 | 16.314 | 7.86e-16 *** |
| 二龄幼虫天数 | 0.17974 | -1.809 | 0.0811 • |
| 四龄幼虫天数 | 0.16917 | 2.075 | 0.0473 * |
| 总天数 | 0.04184 | -1.787 | 0.0848 • |
| *** p < 0.001；** p < 0.01；* p < 0.05；• p < 0.1 | |||
表6：发育时间的逐步回归（逐步回归2） 因变量：成年个体翼弦长（mm）。
讨论
本文阐述了这一经过验证的迁地保护繁育方案在濒危蝴蝶大规模繁育中的有效性，并说明了如何将其调整用于科学研究，以帮助填补关键的行为学、生活史或生态学数据空白。例如，通过加深对平均总发育时间（卵至成虫）、各生活阶段平均持续时间以及交配最适温度等方面的了解，可用于优化该方案并提高整体项目的成功率。目前绝大多数现有方案仅详细描述了生物体的饲养方法，而未涉及数据收集、科学研究，或如何利用这些研究成果来指导并可能改进迁地保护方法。
本方案需要每日进行生物饲养管理。通过保持清洁的饲养环境、避免生物过度拥挤以及提供高质量的幼虫寄主植物材料，可使生物的健康状况和繁殖能力达到最佳。在大多数情况下，我们使用一次性饲养用品和容器（例如纸杯和塑料杯），通常定期更换，往往每日更换，且从不重复使用这些材料。这种方法既经济高效，又减少了对饲养材料进行更费力消毒的需求。然而，对于常用工具，如昆虫镊子、水彩画笔、小型弹出式飞行笼，以及所有饲养表面（如桌面和实验台面），则需定期使用5%的次氯酸钠溶液进行消毒。具体的消毒频率在很大程度上取决于使用频率、生物的物候阶段及其他变量，应根据每个迁地保护项目的具体需求进行调整。我们还发现，使用白色牛皮纸覆盖所有饲养表面非常有用。它提供了一种廉价且易于铺设的洁净基底，白色背景有助于发现任何逃逸的个体。在进行日常饲养操作时，所有实验室人员均应始终佩戴一次性检查手套，以最大限度减少污染，并保护人员免受因接触植物或生物可能引起的皮肤刺激。如果任何实验室人员家中饲养需使用外用跳蚤防治药物的宠物，这一点尤为重要。即使微量的活性成分残留也可能对圈养生物造成危害。
此外，应注意尽量减少生物个体的过度拥挤。幼虫密度过高可能导致生物健康状况迅速下降，甚至在某些分类群（尤其是灰蝶科）中出现同类相食现象。根据该物种生活史部分所述，可能需要定期分离幼虫以减少饲养容器内的数量，甚至对个体幼虫进行单独隔离。每个容器中的理想数量因具体分类群以及各项异地保育项目的限制因素（如可用预算、实验室设施和饲养人员总数）而有较大差异。同样建议在盛放幼虫的容器之间留出足够的空间，以尽量减少生物个体在容器间的迁移。最后，对于规模较大的人工种群，强烈建议将种群分置于一个或多个不同的实验室设施中。这种保护性策略有助于降低因疾病或其他不可预见因素导致整个种群毁灭性损失的风险。
幼虫寄主植物的质量和可获得性直接影响畜牧业生产，并显著影响幼虫的发育速度和种群整体健康状况。然而，目前很少有已发表的报告或研究强调这一幕后需求，或讨论最佳的育苗实践方法。成功的迁地保护项目规划必须充分考虑植物的数量供应、生产及养护管理。由于许多幼虫还需要或偏好特定的植物部位（例如顶端嫩芽、花蕾和花序、果实等），因此必须有效调控以确保植物处于适当的物候阶段。
还需考虑适当的种群 demographics 和遗传管理，并尽量减少圈养可能带来的任何负面影响。我们建议制定一项遗传管理计划，该计划可包括定期引入新的遗传物质、最大化遗传多样性并防止近亲繁殖的策略，定期评估关键生物体的适合度变量，并在一定程度上监测遗传状况，以便与现存种群进行比较并检查圈养种群的健康状况。定期将圈养个体的特征与创始种群的个体进行比较也是必要的34,35。
这些方案代表了经过验证的最佳实践方法，可为各类研究人员和保护实践者提供帮助，使其能够直接应用或调整我们的方法，用于各自的研究以及濒危蝴蝶或其他昆虫的迁地保护与恢复项目。文中具体阐述的人工繁育方案可能最适用于其他灰蝶科、相关分类单元或体型较小的物种。然而，其中许多组成部分，例如确保成功求偶与交配、利用人工花蜜维持成虫生存、最大化产卵量以及幼虫常规护理等，在理论上可更广泛地应用于或调整至更多样的分类单元。如前所述，尽管应强调方案的灵活性，但参考其他已建立的方法学有助于提供有价值的见解，并为调整与创新提供可行的起点。本文所提出用于评估多种生活史特征的方法，例如幼虫发育时间及幼虫龄期数量，理论上也广泛适用于其他保护性繁育项目及濒危物种。我们鼓励其他研究者在条件允许时，协助填补关键的生态学数据空白，并发表经过审定的方案与项目成果。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了美国鱼类及野生动物管理局保护恢复计划（F17AP00467）和迪士尼保护基金的资助。佛罗里达自然历史博物馆和佛罗里达大学昆虫学与线虫学系也提供了额外支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 12 盎司 plain white paper cups（Karat） | Lollicup | C-KC16 | |
| 15安培2插口机械式家用即插式倒计时照明定时器 | Lowes | UTTNI2423 | |
| 1毫升皮下注射器（0.45 毫米 × 16 毫米） | Fisher Scientific | 14-829-10F | |
| 2 盎司透明塑料分装杯杯盖 | 派对城 | #791091 | |
| 2 盎司透明塑料分装杯 | 派对城 | #791088 | |
| 34.29 cm × 34.29 cm × 60.96 cm 可折叠网格式弹出式饲养笼 | Bioquip | 1466BV | |
| 8.5" 1瓦白炽灯夹式工作灯 | Lowes | PTC301L | |
| Adoric 电子数显卡尺 | 亚马逊公司 | B07QX2SK2F | |
| 大孩子选择艺术 & Crafts 刷子套装 - 每包12支，多种尺寸 | 沃尔玛 | #10965135 | |
| 透明塑料杯托 | 前沿科学服务公司 | AG_9040 | |
| Fisher Scientific Traceable 记忆监控温度计 | Fisher Scientific | 15-077-8D | |
| 直头镊子，瑞士风格 #4，不锈钢 | BioQuip | 4531 | |
| Humco 甘油 6 盎司 | 沃尔玛 | #303951037966 | |
| 夜光涂料套装，蓝色、红色、黄色，4 dram | Bioquip | 1166A | |
| 佳得乐劲爽西瓜味或佳得乐水果宾治味运动饮料 | 沃尔玛 | #568456137 | |
| Neoteck 数字式二合一温湿度计 | 亚马逊公司 | NTK026 | |
| 奥林巴斯 0.6 ml 微量离心管，透明，聚丙烯材质，非无菌 | 亚马逊公司 | 24-272C | |
| 塑料储罐喷雾器 | Lowes | #5318 | |
| Q-tips 棉签 | 沃尔玛 | #551398298 | |
| 带盖矩形塑料保鲜盒（Rubbermaid） | 沃尔玛 | #554320171 | |
| Showgard 903 印章镊子，4 5/8 英寸铲形尖端 | 亚马逊公司 | #787793151378 | |
| 单面瓦楞纸卷 | 亚马逊公司 | BXSF12 | |
| 美工刀 | OLFA | #5023 | |
| 9 盎司一次性塑料杯 | 独奏 | SQ950 | |
| Thorton Plastics 50 dram 透明塑料旋盖瓶（6.25 盎司） | 索顿塑料 | #50 | |
| 9 英寸 × 150 英尺 黑色纱布卷 | Jo Ann Fabrics | #16029696 | |
| Zep 32 oz 塑料喷雾瓶 | Lowes | HDPRO36 |
参考文献
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