使用"彩虹"和"延时共聚焦成像"可视化活斑马鱼中发育中的脑

Summary

体内成像是一种强大的工具，可用于研究神经系统发育背后的细胞机制。在这里，我们描述了一种技术，使用延时共聚焦显微镜，以可视化大量的多色彩虹标记细胞在发展中的斑马鱼神经系统实时。

Abstract

脊椎动物神经系统的发展需要复杂的细胞行为和相互作用的精确协调。在体内使用高分辨率成像技术可以为活生物体中的这些过程提供一个清晰的窗口。例如，在神经系统形成时，分裂细胞及其后代可以实时跟踪。近年来，多色技术的进步扩大了可以调查的问题类型。多色Brainbow方法不仅可用于区分像细胞一样，还可用于对相关细胞的多个不同克隆进行颜色编码，每个克隆来自一个祖细胞。这允许在开发期间同时对许多不同的克隆及其行为进行多路复用线分析。在这里，我们描述了一种技术，使用延时共聚焦显微镜在发展中的斑马鱼神经系统中实时可视化大量多色彩虹标记细胞。这对于关注细胞之间的细胞相互作用特别有用，因为细胞很难使用传统的启动器驱动颜色进行差异标记。我们的方法可用于同时跟踪多个不同克隆之间的系系关系。使用此技术生成的大型数据集提供了丰富的信息，可以定量地比较基因或药理学操作。最终，所产生的结果有助于回答有关神经系统如何发育的系统问题。

Introduction

在发育的早期阶段，专门的祖细胞池在增殖区反复分裂，产生不同的子细胞阵列。然后，在这个发育期出生的细胞将分化和旅行，形成新生的器官。在神经系统中，前视像状胶质在心室区产生不成熟的神经元。当神经元从心室迁移并成熟时，膨胀的组织最终形成大脑高度复杂的结构^1,21，2，3，4，5，6。^,3,4,5,6前祖的分裂与神经元的分化和迁移之间的协调将决定大脑的最终大小、形状和功能，直接影响行为^{77、8、9、10。8,9,10}虽然严格控制这些过程显然对于正常的大脑发育至关重要，但监管这些动力学的全球机制并不十分了解。在这里，我们描述了一个工具，以细胞分辨率研究神经系统的发展，允许研究人员可视化在发育中的斑马鱼大脑中与B彩虹的祖细胞和神经元，并通过延时共聚焦显微镜¹¹

Protocol

涉及动物主题的程序已获得刘易斯和克拉克学院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 斑马鱼胚胎的微注射

1. 设置野生类型，成年斑马鱼在性别分离的交配池前，下午进行微注射^{39，40。39,}
2. 在微注射的早晨准备DNA溶液。稀释hsp:Zebrabow¹¹质粒DNA浓度为±10 ng/μL，浓度为0.1 mM KCl，以及2.5%苯酚红色和3.75U克雷重组酶。
3. 在受精45分钟内将DNA溶液微注射到单细胞斑马鱼胚胎^{中39，41。,41}将大约4.2 nL这种溶液注入每个胚胎，相当于42皮克质粒DNA。
   注:如果将转基因、表达的斑马线交配，如Tg（ubi:Zebrabow）15¹⁵和Tg（神经:斑马弓^）18，微注射步骤可以省略。执行微注射可能是有益的，因为它允许研究人员对拷贝数和标签密度进行定位。此外，第二个DNA结构，标记或操纵一个特定的基因产物可以....

Results

本节演示了使用本文描述的体内多色延时成像方法可以获得的结果示例。我们显示，在发育中的斑马鱼后脑¹⁴的增殖心室区，B彩虹颜色编码的细胞克隆（图1）。

通常，当B彩虹标记的细胞排列在特定的径向光纤上时，它们共享相同的颜色（图1D），可以量化为相对RGB通道权重（图1E）。这表明，这些径向群是分裂细胞的克隆，其相似的颜色可以用来识别它们与斑马鱼、小鼠和小鸡^14、15,15的先前研究有关。当Brainbow标记密度相对稀疏时，这种颜色编码可用于清晰地可视化和跟踪活脊椎动物大脑增殖区域内的许多不同径向克隆。

定量颜色分析表明，子细胞表达的颜色与母细胞（祖代）细胞（

Discussion

该协议描述了一种方法，可视化在发育中的斑马鱼后脑中，前祖细胞和神经元的克隆，并跟随它们在体内使用B彩虹和延时共聚焦显微镜^11。与体外或活体研究相比，该协议的主要优点是能够长期直接观察脊椎动物大脑的自然环境中的增殖区。这项技术建立在以前使用逆转录病毒载体标记单个克隆的研究的基础上。相反，使用hsp:Zebrabow 同时构造了许多克隆的颜色代码，允许多路线跟踪，并专注于克隆^{人 11}之间的动态。可以修改此协议以专注于其他系统或单元类型的开发。例如，不同的蓝彩虹结构可以在斑马鱼胚胎中表达。在hsp:Zebrabow中使用斑马鱼hsp70促进剂，将导致在热休克后对各种细胞类型的马赛克标记，包括神经祖细胞和神经元^11，并给予研究人员对基因表达²⁹的时间控制。需要注意的是，使用热冲击促进器一致地标记颜色编码的克隆，而其他促进者可能无法以这种方式清楚地划定细胞系。当克隆体标识不是感兴趣的因素时，利用其他启动器的构造可用于标记特.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL 移液管（细吸头）	Globe Scientific， Inc.	134020
1-苯基-2-硫脲 （PTU）	Alfa Aesar	L06690	用 E3 稀释至 0.2 mM 以防止胚胎色素沉着
50 mL 锥形管	Corning	352070	用于热休克胚胎
6 磅尼龙钓鱼线	SecureLine	NMT250	用于制作胚胎作器
7.5 mL 移液管	Globe Scientific， Inc.	135010
CaCl2	Sigma	C3881	用于 E3
棉签	Puritan	867-WC 无胶	用于制作胚胎纵器
Cre 重组酶	New England Biolabs	M0298M
数字干浴	Genemate	490016-616	用于将 LMA 储存在 42 °C
落射荧光解剖镜
玻璃毛细管	World Precision Instruments	TW100F-4
培养箱	Forma Scientific	3158	将胚胎维持在 28 °C
注射板模具	适应性科学工具	TU-1
等温水浴	Fisher Scientific	2320	用于热休克胚胎
KCl	AMRESCO	0395	用于 E3 和注射用 DNA 溶液
激光扫描共聚焦显微镜	蔡司	LSM710
LE 琼脂糖	Genemate	E3120	创建琼脂糖注射板
低熔点琼脂糖 （LMA）	AMRESCO	J234
交配槽	Aquaneering， Inc.
亚甲蓝	Sigma	M9140	用于 E3
MgSO4	Sigma	9397	用于 E3
显微作器	世界精密仪器	M3301
微量移液器拉拔器	萨特仪器有限公司	P-97
MS-222 三卡因 S	西部化学公司		在反渗透 （RO） 水中以 4 mg/mL 制备原液，然后滴加到 E3 中至终浓度为 0.2 mM 以麻醉胚胎
NaCl	JT Baker	4058-01	用于 E3
培养皿（90 mm、60 mm）	Genesee Scientific	32-107G	容纳胚胎并创建成像室 （60 mm）
酚红	Sigma	P0290
软针环标记	Clover Needlecraft 公司	354	用于用培养皿创建成像室
强力胶（超凝胶控制）	乐泰	1363589	用于制作胚胎纵器
注射器针头	Beckton Dickinson	BD329412	用于去绒膜胚胎