利用Brainbow技术和活体斑马鱼延时共聚焦成像可视化大脑发育过程

摘要

活体成像是一种强大的工具，可用于研究神经系统发育背后的细胞机制。本文介绍了一种利用延时共聚焦显微镜实时观察斑马鱼发育过程中大量多色Brainbow标记细胞的技术。

摘要

脊椎动物神经系统的发育需要复杂细胞行为与相互作用的精确协调。高分辨率的活体成像技术可为在活体生物中观察这些过程提供清晰的窗口。例如，可以在神经系统形成过程中实时追踪分裂细胞及其子代细胞。近年来，多色标记技术的进步拓展了可研究的科学问题类型。多色 Brainbow 技术不仅可用于区分形态相似的细胞，还可对源自同一前体细胞的多个不同细胞克隆进行颜色编码。这使得在发育过程中能够同时对多种不同克隆及其行为进行多重谱系分析。本文描述了一种利用延时共聚焦显微镜，在斑马鱼神经系统发育过程中实时可视化大量多色 Brainbow 标记细胞的技术。该方法特别适用于追踪形态相似细胞之间的细胞相互作用，而这类相互作用使用传统的启动子驱动颜色标记难以实现差异化标记。我们的方法可用于同时追踪多个不同克隆之间的谱系关系。利用该技术生成的大量数据提供了丰富的信息，可在遗传或药理学干预之间进行定量比较。最终，这些研究结果有助于系统性地回答神经系统如何发育的相关问题。

引言

在发育的早期阶段，特化的前体细胞池在增殖区域反复分裂，产生多种多样的子代细胞。在这一发育时期产生的细胞随后会分化并迁移，形成新生的器官。在神经系统中，放射状胶质细胞等前体细胞在脑室区产生未成熟的神经元。随着神经元从脑室迁移并逐渐成熟，不断扩展的组织最终形成大脑高度复杂的结构^1,2,3,4,5,6。前体细胞的分裂与神经元的分化及迁移之间的协调，将决定大脑最终的大小、形状及其功能，从而直接影响行为^7,8,9,10。尽管对这些过程进行严密调控显然对正常大脑发育至关重要，但调控这些动态过程的全局机制目前尚不明确。本文介绍一种可在细胞分辨率下研究神经系统发育的工具，使研究人员能够利用Brainbow技术在活体中观察斑马鱼发育中大脑的前体细胞和神经元，并通过延时共聚焦显微镜追踪其随时间变化的行为

方案

涉及动物受试者的实验程序已获得刘易斯机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准 & 克拉克学院

1. 斑马鱼胚胎的显微注射

1. 在进行显微注射前一个下午，将野生型成年斑马鱼按性别分开放置在交配用的鱼缸中^39,40。
2. 在显微注射当天早晨配制DNA溶液。将hsp:Zebrabow¹¹质粒DNA用0.1 mM KCl稀释至浓度约为10 ng/μL，并加入2.5%酚红和3.75 U Cre重组酶。
3. 在受精后45分钟内对单细胞期斑马鱼胚胎进行DNA溶液的显微注射^39,41。每个胚胎注射约4.2 nL溶液，相当于约42 pg质粒DNA。
   注意：如果使用已建立的表达Brainbow的转基因斑马鱼品系进行交配（例如Tg(ubi:Zebrabow)¹⁵和Tg(neurod:Zebrabow)¹⁸），则可省略显微注射步骤。进行显微注射的优势在于研究人员可....

结果

本部分展示了使用此处描述的活体多色延时成像方法可获得的结果示例。我们展示了发育中斑马鱼后脑增殖性室区细胞的Brainbow彩色编码克隆¹⁴（图1）。

通常，当 Brainbow 标记的细胞沿着特定的放射状纤维排列时，它们会呈现相同的颜色（图 1D），该颜色可通过相对的 RGB 通道权重进行量化（图 1E）。这表明这些放射状排列的细胞群为分裂细胞的克隆群体，其相似的颜色可用于识别其克隆来源关系，这与此前在斑马鱼、小鼠和鸡中研究所观察到的结果一致^14,15。当 Brainbow 标记密度相对稀疏时，这种颜色编码可用于在活体脊椎动物大脑的增殖区域中清晰地可视化并追踪多个不同的放射状克隆。

定量.......

讨论

本方案描述了一种在斑马鱼后脑发育过程中可视化祖细胞和神经元克隆，并利用Brainbow技术结合延时共聚焦显微镜进行活体追踪的方法¹¹。与体外或离体研究相比，该方案的主要优势在于能够随时间推移在天然环境中直接观察脊椎动物大脑的增殖区域。该技术建立在先前使用逆转录病毒载体标记单个克隆的研究基础之上 。相比之下，hsp:Zebrabow 构建体可同时为多个克隆赋予不同颜色编码，从而实现多重谱系示踪，并聚焦于克隆间的动态关系¹¹。本方案可进行调整，以适用于其他系统或细胞类型的发育研究。例如，可在斑马鱼胚胎中表达不同的Brainbow构建体。在hsp:Zebrabow中使用斑马鱼hsp70启动子可在热激后实现多种细胞类型的嵌合标记，包括神经祖细胞和神经元¹¹，并使研究人员能够对基因表达进行时间控制²⁹。需要注意的是，热激启动子的使用通常能清晰地标记出颜色编码的克隆，而其他启动子可能无法以同样方式明确界定细胞谱系。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 移液管（细尖）	Globe Scientific, Inc.	134020
1-苯基-2-硫脲（PTU）	Alfa Aesar	L06690	用 E3 稀释至 0.2 mM，以防止胚胎色素沉积
50 mL 锥形离心管	Corning	352070	用于胚胎热激处理
6 磅尼龙钓鱼线	SecureLine	NMT250	用于制作胚胎操作装置
7.5 mL 移液管	Globe Scientific, Inc.	135010
CaCl2	Sigma	C3881	用于配制 E3 溶液
棉签	Puritan	867-WC NO GLUE	用于制作胚胎操作装置
Cre 重组酶	New England Biolabs	M0298M
数字干式恒温仪	Genemate	490016-616	用于在 42 °C 下保存低熔点琼脂糖（LMA）
落射荧光解剖显微镜
玻璃毛细管	World Precision Instruments	TW100F-4
培养箱	Forma Scientific	3158	用于将胚胎维持在 28 °C
注射用培养皿模具	Adaptive Science Tools	TU-1
Isotemp 水浴锅	Fisher Scientific	2320	用于胚胎热激处理
KCl	AMRESCO	0395	用于 E3 溶液及注射用 DNA 溶液
激光扫描共聚焦显微镜	Zeiss	LSM710
LE 琼脂糖	Genemate	E3120	用于制作琼脂糖注射板
低熔点琼脂糖（LMA）	AMRESCO	J234
交配用鱼缸	Aquaneering, Inc.	ZHCT100
亚甲蓝	Sigma	M9140	用于 E3 溶液
MgSO4	Sigma	9397	用于 E3 溶液
显微操作仪	World Precision Instruments	M3301
微量移液管拉制仪	Sutter Instrument Co.	P-97
MS-222 三卡因-S	Western Chemical, Inc.		用反渗透（RO）水配制成 4 mg/mL 储存液，然后逐滴加入 E3 溶液中，终浓度为 0.2 mM，用于麻醉胚胎
NaCl	J.T. Baker	4058-01	用于 E3 溶液
培养皿（90 mm，60 mm）	Genesee Scientific	32-107G	用于饲养胚胎及构建成像腔室（60 mm）
酚红	Sigma	P0290
软质缝合环标记	Clover Needlecraft, Inc.	354	用于与培养皿配合构建成像腔室
瞬间胶（超凝胶控制型）	Loctite	1363589	用于制作胚胎操作装置
注射器针头	Beckton Dickinson	BD329412	用于去除胚胎的绒毛膜