监测来自一滴外周血的T细胞上结合的PD-1阻断抗体

摘要

我们开发了一种简单的流式细胞术检测方法，用于评估PD-1阻断抗体与T细胞的结合，仅需癌症患者的少量外周血即可完成。

摘要

免疫检查点抑制剂，包括阻断PD-1的抗体，已显著改善多种癌症的治疗效果。由于这些免疫疗法在血液中具有持久的浓度，其药理作用持续时间较长，甚至在停止注射后仍可维持。本文中，我们建立了一种简单的流式细胞术检测方法，用于评估PD-1阻断抗体纳武利尤单抗（nivolumab）和帕博利珠单抗（pembrolizumab）在T细胞上的结合状态。该检测方法类似于血糖检测，仅需一滴外周血即可完成。相较于测定血液中抗体浓度，直接可视化抗体在T细胞上的结合情况更为可靠。此外，如有需要，我们还可对结合了PD-1阻断抗体的T细胞上多种不同的免疫相关标志物进行潜在分析。因此，这是一种简便且微创的策略，可用于分析癌症患者体内PD-1阻断抗体的药理作用。

引言

PD-1阻断抗体已成为治疗多种癌症（包括非小细胞肺癌（NSCLC））的标准选择^1,2,3,4。对于部分对传统细胞毒性化疗无反应的癌症患者，这类抗体显示出显著的治疗效果。然而，免疫检查点抑制剂（ICIs），包括PD-1阻断抗体，可能引发一类独特且多样的不良事件，称为免疫相关不良事件（irAEs）⁵。尽管irAEs几乎可累及所有组织，但最常出现在胃肠道、内分泌腺、皮肤和肝脏，可引起瘙痒、皮疹、恶心、腹泻以及甲状腺功能异常^6,7。通常情况下，大多数irAEs出现在开始使用ICIs治疗后的1至2个月内。但在某些情况下，其发生时间可晚于治疗开始后1年，甚至在治疗停止后出现^6,7。此外，irAEs可导致多种症状，可能难以与其他疾病相鉴别。因此，及时诊断irAEs并给予适当治疗具有挑战性。irAEs可影响全身各种组织，其发生与循环免疫细胞（尤其是结合了PD-1阻断抗体的T细胞）密切相关。因此，在临床实践中，建立一种简便且微创的方法来监测抗体靶向的T细胞具有重要意义。

在此，我们建立了一种简单的方法，利用接受纳武利尤单抗或帕博利珠单抗治疗的癌症患者外周全血一滴，评估PD-1阻断抗体与T细胞的结合情况。通过该方法，我们能够分别监测以下各项：1）抗体与T细胞结合的持续时间；2）治疗性抗体对T细胞PD-1分子的占据程度；3）T细胞的活化状态及免疫学特征。该方法是对先前报道技术的一种改进⁸。所需血液量几乎与血糖检测相当，且该方法无需单个核细胞富集，也无需与PD-1阻断抗体共培养。我们证实，该方法亦可用于冻存样本，包括外周血单个核细胞（PBMCs）以及胸腔积液、心包积液、支气管肺泡灌洗液和脑脊液中的细胞，提示该策略可能适用于多中心研究。该方法有助于免疫相关不良事件（irAEs）的早期诊断，帮助确定适当的免疫抑制治疗方案以控制其症状，并识别在PD-1抑制剂治疗后启动后续治疗的最佳时机。

方案

采样在常规临床操作过程中进行。所有人体样本均在受试者签署知情同意书后获取，符合《赫尔辛基宣言》的要求，并获得日本大阪大学医学研究生院伦理审查委员会（15383 和 752）的批准。

1. 全血样本制备与染色

1. 使用含乙二胺四乙酸（EDTA）的采血管采集全血样本。
   注意：可使用常规针头或采血针进行采血。
2. 将20 µL全血样本转移至5 mL圆底聚苯乙烯流式细胞术管中。
   注意：为减少细胞与管壁的非特异性结合，可在加入样本前向管中加入1 mL含2%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS），涡旋振荡10秒。
3. 加入20 µL含2% FBS的PBS溶液。
4. 加入10 µL人源特异性Fc受体阻断试剂。充分混匀，并于室温孵育15分钟。
5. 加入500 µL红细胞裂解缓冲液。充分混匀，并于室温孵育10分钟。
6. 加入4 mL含2% FBS的PBS溶液，于4 °C以400 × g（1,500 rpm）离心5分钟。用移液器吸除上清液。
7. 重复步骤1.6所述的洗涤和吸除操作。
8. 将细胞重悬于100 µL含2% FBS的PBS溶液中，并均分为两管，每管50 µL。
9. 加入表面标志物抗体（表1）。充分混匀，避光孵育20分钟，室温进行。
   注意：在分析T细胞免疫状态时，可根据流式细胞仪的性能增加检测标志物的数量。
10. 按照步骤1.6的方法洗涤样本两次。
11. 将细胞重悬于200 µL含2% FBS的PBS溶液中。

2. 流式细胞术分析

1. 将试管插入流式细胞仪，并基本按照推荐方案获取细胞⁹。
2. 记录10,000个事件作为淋巴细胞门控（图1A），并将流式数据导出为.fcs文件用于分析。
3. 在分析软件中打开文件。在前向散射光（FSC）（A）对侧向散射光（SSC）（A）的图上显示细胞，并圈定淋巴细胞群（图1A）。
4. 利用FSC（H）对FSC（W）和SSC（H）对SSC（W）选择单细胞（图1B），并在CD3对CD8或CD3对CD4图上显示，分别圈定CD8 T细胞和CD4 T细胞（图1C）。
5. 选择已圈定的细胞群，并在PD-1对人IgG4图上显示，根据同型对照确定结合了PD-1阻断抗体的CD8和CD4 T细胞（图1D）。

结果

门控策略与流式细胞术分析（图1）可检测来自非小细胞肺癌（NSCLC）患者外周血一滴血样本中T细胞上PD-1阻断抗体的结合情况。在给予PD-1阻断抗体之前，不存在人IgG4阳性的CD8或CD4 T细胞，而PD-1的表达可通过PD-1检测抗体（EH12.1）加以确认（图2A）。在给予纳武利尤单抗（nivolumab）或帕博利珠单抗（pembrolizumab）后，可通过抗IgG4抗体（HP6025）在T细胞上检测到IgG4（nivolumab、pembrolizumab），而PD-1检测抗体EH12.1则无法识别T细胞上的任何PD-1，因为治疗性PD-1抗体干扰了EH12.1的结合。这意味着我们是通过PD-1检测抗体结合缺失来间接测量PD-1阻断抗体的治疗性结合。代表性数据展示了PD-1阻断抗体不同的结合状态（图2A）。纳武利尤单抗和帕博利珠单抗在T细胞上对PD-1的结合与占据随时间推移而下降

讨论

本文报道了一种利用流式细胞仪检测结合于外周血一滴血来源T细胞上的PD-1阻断抗体的方法，该方法最初为检测纳武利尤单抗（nivolumab）而开发¹⁰。尽管该技术操作极为简便，但为获得准确结果，需注意两个关键点。其一是检测PD-1分子时，应选用能与纳武利尤单抗和帕博利珠单抗（pembrolizumab）竞争结合的合适抗体，此问题已在先前研究中得到评估¹¹。其二是表面染色前必须彻底完成红细胞裂解。只要为每次实验设立同型对照以确定IgG4阳性细胞群的设门范围，其频率便不受影响。然而，根据本方案，若红细胞裂解不充分，则可能导致淋巴细胞门内T细胞计数减少以及各表面标志物荧光强度降低。此外，红细胞裂解步骤必须在表面染色之前进行，否则抗IgG4抗体（HP6025）无法正常发挥作用。

该方法的局限性在于，与PD-1阻断抗体结合的T细胞群体中既包含介导治疗效应的特异性T细胞克隆，也包含引起免疫相关不良事件（irAEs）的克隆；然而，这些特异性克隆在抗体结合群体中的频率相当低。因此，我们仍需利用某些标志物（...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10倍红细胞裂解缓冲液（多物种）	Thermo Fisher Scientific	00-4300-54	50 mL
APC/Cyanine7 抗人 CD4 抗体	BioLegend	300518	克隆株 RPA-T4
BD FACS Canto II 流式细胞仪	BD
Brilliant Violet 510 抗人 CD8a 抗体	BioLegend	301048	克隆株 RPA-T8
杜尔贝科磷酸盐缓冲液	nacalai tesque	14249-95	500 mL
Falcon 圆底聚苯乙烯管	STEMCELL Technologies	352058	5 mL
人源 FcR 封闭试剂	Miltenyi Biotec	130-059-901	2 mL
FLOWJO	BD
Gibco 胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	12676029	500 mL
小鼠 IgG1 单克隆抗体 - 同型对照	abcam	ab81200
小鼠单克隆抗人 IgG4 Fc 抗体	abcam	ab99825	克隆株 HP6025
Pacific Blue 小鼠抗人 CD3 抗体	BD	558117	克隆株 UCHT1
PE-Cy7 小鼠抗人 CD279（PD-1）抗体	BD	561272	克隆株 EH12.1
PE-Cy7 小鼠 IgG1 κ 同型对照	BD	557646