我们开发了一种简单的流式细胞术检测方法，用于评估PD-1阻断抗体与T细胞的结合，仅需癌症患者的少量外周血即可完成。
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本文内容
摘要
摘要
免疫检查点抑制剂，包括阻断PD-1的抗体，已显著改善多种癌症的治疗效果。由于这些免疫疗法在血液中具有持久的浓度，其药理作用持续时间较长，甚至在停止注射后仍可维持。本文中，我们建立了一种简单的流式细胞术检测方法，用于评估PD-1阻断抗体纳武利尤单抗（nivolumab）和帕博利珠单抗（pembrolizumab）在T细胞上的结合状态。该检测方法类似于血糖检测，仅需一滴外周血即可完成。相较于测定血液中抗体浓度，直接可视化抗体在T细胞上的结合情况更为可靠。此外，如有需要，我们还可对结合了PD-1阻断抗体的T细胞上多种不同的免疫相关标志物进行潜在分析。因此，这是一种简便且微创的策略，可用于分析癌症患者体内PD-1阻断抗体的药理作用。
引言
PD-1阻断抗体已成为治疗多种癌症（包括非小细胞肺癌（NSCLC））的标准选择1,2,3,4。对于部分对传统细胞毒性化疗无反应的癌症患者，这类抗体显示出显著的治疗效果。然而，免疫检查点抑制剂（ICIs），包括PD-1阻断抗体，可能引发一类独特且多样的不良事件，称为免疫相关不良事件（irAEs）5。尽管irAEs几乎可累及所有组织，但最常出现在胃肠道、内分泌腺、皮肤和肝脏，可引起瘙痒、皮疹、恶心、腹泻以及甲状腺功能异常6,7。通常情况下，大多数irAEs出现在开始使用ICIs治疗后的1至2个月内。但在某些情况下，其发生时间可晚于治疗开始后1年，甚至在治疗停止后出现6,7。此外，irAEs可导致多种症状，可能难以与其他疾病相鉴别。因此，及时诊断irAEs并给予适当治疗具有挑战性。irAEs可影响全身各种组织，其发生与循环免疫细胞（尤其是结合了PD-1阻断抗体的T细胞）密切相关。因此，在临床实践中，建立一....
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方案
采样在常规临床操作过程中进行。所有人体样本均在受试者签署知情同意书后获取，符合《赫尔辛基宣言》的要求，并获得日本大阪大学医学研究生院伦理审查委员会（15383 和 752）的批准。
1. 全血样本制备与染色
- 使用含乙二胺四乙酸（EDTA）的采血管采集全血样本。
注意：可使用常规针头或采血针进行采血。 - 将20 µL全血样本转移至5 mL圆底聚苯乙烯流式细胞术管中。
注意：为减少细胞与管壁的非特异性结合，可在加入样本前向管中加入1 mL含2%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS），涡旋振荡10秒。 - 加入20 µL含2% FBS的PBS溶液。
- 加入10 µL人源特异性Fc受体阻断试剂。充分混匀，并于室温孵育15分钟。
- 加入500 µL红细胞裂解缓冲液。充分混匀，并于室温孵育10分钟。
- 加入4 mL含2% FBS的PBS溶液，于4 °C以400 × g（1,500 rpm）离心5分钟。用移液器吸除上清液。
- 重复步骤1.6所述的洗涤和吸除操作。
- 将细胞重悬于100 µL含2% FBS的PBS溶液中，并均分为两管，每管50 µL。
- 加入表面标志物抗体（表1）。充分混匀，避光孵育20分钟，室温进行。
注意：在分析....
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结果
门控策略与流式细胞术分析（图1）可检测来自非小细胞肺癌（NSCLC）患者外周血一滴血样本中T细胞上PD-1阻断抗体的结合情况。在给予PD-1阻断抗体之前，不存在人IgG4阳性的CD8或CD4 T细胞，而PD-1的表达可通过PD-1检测抗体（EH12.1）加以确认（图2A）。在给予纳武利尤单抗（nivolumab）或帕博利珠单抗（pembrolizumab）后，可通过抗IgG4抗体（HP6025）在T细胞上检测到IgG4（nivolumab、pembrolizumab），而PD-1检测抗体EH12.1则无法识别T细胞上的任何PD-1，因为治疗性PD-1抗体干扰了EH12.1的结合。这意味着我们是通过PD-1检测抗体结合缺失来间接测量PD-1阻断抗体的治疗性结合。代表性数据展示了PD-1阻断抗体不同的结合状态（图2A）。纳武利尤单抗和帕博利珠单抗在T细胞上对PD-1的结合与占据随时间推移而下降
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讨论
本文报道了一种利用流式细胞仪检测结合于外周血一滴血来源T细胞上的PD-1阻断抗体的方法，该方法最初为检测纳武利尤单抗（nivolumab）而开发10。尽管该技术操作极为简便，但为获得准确结果，需注意两个关键点。其一是检测PD-1分子时，应选用能与纳武利尤单抗和帕博利珠单抗（pembrolizumab）竞争结合的合适抗体，此问题已在先前研究中得到评估11。其二是表面染色前必须彻底完成红细胞裂解。只要为每次实验设立同型对照以确定IgG4阳性细胞群的设门范围，其频率便不受影响。然而，根据本方案，若红细胞裂解不充分，则可能导致淋巴细胞门内T细胞计数减少以及各表面标志物荧光强度降低。此外，红细胞裂解步骤必须在表面染色之前进行，否则抗IgG4抗体（HP6025）无法正常发挥作用。
该方法的局限性在于，与PD-1阻断抗体结合的T细胞群体中既包含介导治疗效应的特异性T细胞克隆，也包含引起免疫相关不良事件（irAEs）的克隆；然而，这些特异性克隆在抗体结合群体中的频率相当低。因此，我们仍需利用某些标志物（.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了日本促进科学振兴会科学研究费补助金（JP17K16045）以及日本医疗研究开发机构（JP18cm0106335 和 19cm0106310）向 S.K. 提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10倍红细胞裂解缓冲液（多物种） | Thermo Fisher Scientific | 00-4300-54 | 50 mL |
| APC/Cyanine7 抗人 CD4 抗体 | BioLegend | 300518 | 克隆株 RPA-T4 |
| BD FACS Canto II 流式细胞仪 | BD | ||
| Brilliant Violet 510 抗人 CD8a 抗体 | BioLegend | 301048 | 克隆株 RPA-T8 |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液 | nacalai tesque | 14249-95 | 500 mL |
| Falcon 圆底聚苯乙烯管 | STEMCELL Technologies | 352058 | 5 mL |
| 人源 FcR 封闭试剂 | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | 2 mL |
| FLOWJO | BD | ||
| Gibco 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 12676029 | 500 mL |
| 小鼠 IgG1 单克隆抗体 - 同型对照 | abcam | ab81200 | |
| 小鼠单克隆抗人 IgG4 Fc 抗体 | abcam | ab99825 | 克隆株 HP6025 |
| Pacific Blue 小鼠抗人 CD3 抗体 | BD | 558117 | 克隆株 UCHT1 |
| PE-Cy7 小鼠抗人 CD279（PD-1）抗体 | BD | 561272 | 克隆株 EH12.1 |
| PE-Cy7 小鼠 IgG1 κ 同型对照 | BD | 557646 |
参考文献
- Gong, J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 8(2018).
- Borghaei, H., et al.
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重印与许可
