使用定制电极对三维眼黑色素瘤球体进行电化学治疗

摘要

本文介绍了一种用于构建三维结膜和葡萄膜黑色素瘤类球体的实验方案，以及使用手持式定制电极在培养孔中对三维类球体进行体外电化学治疗的方法。该方法为电化学治疗在眼黑色素瘤治疗中的应用提供了新的前景。

摘要

电化学治疗（ECT）是将电脉冲诱导的瞬时膜穿孔与细胞毒性药物给药相结合的一种方法，由于细胞膜发生改变，从而增强了所用药物的细胞毒性作用。三维（3D）体外培养系统相较于传统的单层细胞培养，能更准确地模拟体内肿瘤的生长状态，并更好地保留肿瘤的生物学特性。本文描述了一种利用结膜黑色素瘤（CM）和葡萄膜黑色素瘤（UM）细胞系构建3D肿瘤类器官的实验方案，并介绍了适用于在培养孔中进行体外ECT、且不破坏肿瘤微环境的手持式定制电极的使用方法。该方案分析了3D CM和UM球状体的培养与生长情况，以及其单独使用博来霉素（2.5 µg/mL）、单独使用电穿孔（EP）（750 伏/厘米，8次脉冲，每次100 µs，5 Hz）以及EP联合博来霉素（即ECT）处理后的反应。本方案中所用的药物浓度和电穿孔参数是根据前期实验确定的优选ECT条件。球状体活力检测在处理后3至7天进行。结果显示，仅在ECT处理后，对3D肿瘤球状体活力和生长的抑制作用具有显著性。文中对定制电极进行了详细描述，以促进其在培养孔中施加电脉冲的操作。这种针对3D UM和CM球状体的新型治疗方法，为未来临床应用奠定了基础。

引言

葡萄膜黑色素瘤（UM）是成人中最常见的原发性眼内肿瘤，而结膜黑色素瘤（CM）占所有眼黑色素瘤的2%^1,2,3,4,5,6。UM的首选治疗方法包括近距离放疗、质子束放射治疗和光动力疗法，部分情况下可能需要进行眼球摘除术^1,2,3。CM的治疗方案在不同眼科肿瘤中心之间存在差异；最常见的治疗策略是切除活检联合局部化疗和/或放射治疗⁴。尽管接受了治疗，CM的死亡率仍高达25%–30%⁵。

关于脉络膜黑色素瘤（CM）和葡萄膜黑色素瘤（UM）类球体的形成以及电化学治疗（ECT）在眼黑色素瘤中的应用，目前相关文献十分有限^6,7,8。肿瘤类球体相较于传统的二维细胞培养具有更优的生物学特性，已被提出作为模拟体内肿瘤微环境的一种有效工具⁹。电化学治疗（ECT）结合了非渗透性细胞毒性药物与电穿孔技术（EP）¹⁰。电穿孔是指局部施加短暂而高强度的电脉冲，使细胞膜暂时性通透，从而在局部增强抗癌药物在肿瘤细胞内的摄取，最终导致细胞死亡率上升¹¹。本研究建立了一项实验方案，用于描述CM和UM类球体的构建过程，并探讨使用博来霉素进行ECT处理后的效果。该方案可为眼肿瘤学领域的研究人员在类球体上应用其他治疗方式或进一步研究ECT的作用提供帮助。由于ECT在眼科领域的应用尚有限，目前对其作用机制和治疗过程的认识仍较匮乏；因此，本实验有望在未来拓展此类疾病的治疗选择。我们提出一种新型定制的手持式板状电极装置，可在不破坏肿瘤微环境的前提下，直接在培养孔中对类球体实施ECT处理。

方案

1. 类球体形成

1. 使用贴壁生长的癌细胞系进行类球体形成。
2. 所有细胞培养相关操作均须在无菌操作台条件下进行。
3. 根据目标细胞系的要求配制标准的完全培养基，并使用水浴加热至 37 °C。
   注：本实验中使用的人结膜细胞系 CM2005.1、CRMM1、CRMM2 以及葡萄膜黑色素瘤细胞系 92.1、OMM1 和 OMM2 分别在含 10% 胎牛血清的 Ham F-12 培养基和含 10% 胎牛血清的 RPMI 培养基中培养。
4. 使用标准的酶消化方法（例如胰蛋白酶-EDTA 溶液）使目标细胞脱壁。
5. 为确定活细胞数量，将 10 µL 细胞悬液与 10 µL 台盼蓝溶液按 1:1 比例混匀，并在 5 分钟内使用计数板（血细胞计数板或自动细胞计数仪）进行细胞计数。细胞状态应良好，且融合度应 <90%。
6. 为形成类球体，将 5 × 10³ 个细胞接种至 96 孔超低吸附培养板中，每孔加入 200 µL 完全培养基。将培养板置于含 5% CO₂ 的湿润环境中，于 37 °C 培养。
   注：为有效抑制细胞贴壁，应使用表面共价结合亲水性、非离子型、电中性水凝胶的超低吸附培养板。该水凝胶可抑制细胞永生化，迫使细胞进入悬浮状态，从而形成三维类球体。
7. 使用显微镜观察类球体的形成情况。
   注：某些细胞系在初次传代时无法形成圆形的三维肿瘤类球体。应在肿瘤球开始出现中心变暗前进行传代。根据细胞系的不同，在培养 4–10 天后通过胰酶消化法解离肿瘤团块，随后将单细胞重新接种至新的 96 孔超低吸附培养板中。重复此过程数次传代后，细胞将逐渐适应三维培养条件。

2. 肿瘤类球体的电化学治疗

1. 作为检测对照，使用未经处理的球状体以及仅用EP或博来霉素单独处理的球状体。
2. 调整电穿孔仪的参数设置（脉冲次数、脉冲频率、持续时间和电压；参见材料表）。对于黑色素瘤细胞，采用8次方波电脉冲，电场强度为750 Volts/cm，脉冲持续时间为100 µs，重复频率为5 Hz。
3. 在球状体培养的第3天，于15 mL离心管中用无菌PBS配制新鲜的博来霉素硫酸盐溶液，浓度为5 µg/mL。
4. 更换每个孔中类球体的细胞培养基：移除 200 µL 培养基，并加入 100 µL 新鲜的完全培养基。
5. 向每个孔中加入 100 µL 博来霉素硫酸盐溶液（终浓度 2.5 µg/mL）。向未处理对照组及仅接受电穿孔（EP）处理而未添加博来霉素硫酸盐溶液的类球体中加入 100 µL 新鲜培养基。
6. 进行电穿孔。
   注意：图中所示电极 图1 在哈勒-维滕贝格大学的研究工坊中制造而成。它们由不锈钢制成，可适配电穿孔仪的握把。电极设计用于96孔超低吸附培养板。类似的不锈钢电极也可根据其他应用需求轻松制作。
   1. 用70%乙醇对电极进行灭菌，并让电极自然晾干。电极直径为1 mm，两个电极之间的间距为4 mm，每个电极的长度为8 mm（图1a).
   2. 将电极置于孔板底部，使类球体位于两个电极之间。这可实现类球体在两个电极之间的理想定位（图1b).
   3. 轻摇培养板，使类球体从孔底移动并位于电极之间。类球体仅会在电极间停留数秒钟。
   4. 使用首选参数开始电穿孔。
   5. 用150 µL新鲜培养基替换孔中150 µL博来霉素硫酸盐溶液。
   6. 在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中孵育细胞，最长孵育10天₂若未处理的类球体开始出现深色中心，则终止实验。每2-3天更换150 µL细胞培养基，换液时将移液器枪头置于孔的边缘区域，倾斜培养板并缓慢移液，以避免破坏类球体。

3. 类球体大小的测定

1. 在给药当天（起始时间点）以及给药后3至7天，使用明场显微镜观察类球体，并通过ImageJ Fiji软件计算其横截面积，以测量类球体的大小¹¹.
2. 拍摄带有比例尺的单个球状体图像，选择能够完整显示整个球状体的放大倍数。例如，CM2005.1 使用了 5 倍放大。将图像保存为 JPEG 格式。
3. 使用 ImageJ/Fiji 通过计算横截面积来分析类球体的大小。
   1. 安装软件（https://imagej.net/Fiji/Downloads）。
   2. 启动 ImageJ/Fiji。导入类球体图像： 文件 > 开放.
   3. 为设定比例尺，选择工具栏中的直线按钮，然后用鼠标单击图像中标尺线的位置： 分析 > 设定比例尺使用已知距离填写比例尺的距离。将长度单位更改为 µm。点击“global”字段，以将设置应用于所有具有相同放大倍数的图像。
   4. 将图像转换为8位： 图像 > 类型 > 8位.
   5. 选择 图像 > 调节 > 自动阈值 (选择 > 不要重置范围）。根据所选的阈值标记，类球体将显示为红色或黑色。调整滑块，使类球体的像素变为红色，而非类球体的像素颜色保持不变。关闭阈值对话框，无需点击任何按钮。
   6. 为了计算球状体的横截面积，选择 分析 > 设置测量参数 并点击 面积, 限制至阈值 和 显示标签. 关闭 设置测量参数 通过点击对话框窗口 好的.
   7. 为了展示结果，请选择 分析 > 分析颗粒 并改变尺寸（µm²）= 10000-∞ 以去除噪声。点击按钮 显示结果 并单击关闭窗口 好的. 在 结果，带标签和面积的类球体如图所示。通过重复分析多个类球体，结果列于下表 结果 窗口。
   8. 为确定经 ECT 处理的类球体相对于未处理组和单一处理对照组的相对治疗反应，计算其横截面积的百分比变化。

4. 类球体活性的测定

1. 根据制造商说明书，使用适用于3D细胞培养的细胞活力检测试法，在处理后的3-7天内测定类球体的活力。该检测方法需能够渗透并裂解较大的类球体，以通过定量ATP来检测活力，ATP可指示代谢活跃细胞的存在。
   注意：本实验采用基于发光的检测方法作为读出方式。在处理后第七天，将ECT处理的类球体活力与对照组进行比较。

结果

实验采用定制的手持式电极进行，电极由高纯度不锈钢制成。电极厚度为1 mm，宽度为4 mm，两个电极之间的间隙为4 mm，每个电极的长度为8 mm（图1）。单独使用电穿孔（EP）或博来霉素对葡萄膜黑色素瘤（UM）和结膜黑色素瘤（CM）肿瘤类球体的存活率和生长均无显著影响。电化学治疗（ECT）则显著降低了肿瘤的存活率和类球体的尺寸。在使用博来霉素进行ECT处理后，观察到所有测试类球体的结构丧失，类球体周围出现解体的细胞碎片，并在类球体的中心及周边区域出现坏死。图2展示了CM2005.1细胞系的实验结果。转移性UM细胞系在接受ECT处理后的反应强于原发性细胞系⁸。

图1：定制的手持式电极。电极由高纯度不锈钢制成。电极手柄由电穿孔仪提供。电极厚度为1 mm，宽度为4 mm，两电极之间的间隙为4 mm，每个电极的长度为8 mm（a）；在96孔板中对球状体进行电穿孔（b）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：电化学治疗对结膜黑色素瘤细胞系 CM2005.1 肿瘤类球体的细胞毒性效应。电化学治疗（ECT，应用 2.5 µg/mL 博来霉素后施加 750 V/cm 电场）对类球体的细胞毒性效应强于单独电穿孔（EP）或单独使用博来霉素（2.5 µg/mL）的化学治疗。细胞毒性效应通过治疗后第 7 天测量类球体的横截面积及以未处理对照组为基准的存活率检测来评估。箱线图显示了类球体的平均横截面积（a）；类球体的平均存活率（b）；类球体的代表性图像，比例尺 = 200 µm（c）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

电穿孔（EP）被广泛应用于各种生物技术和临床领域¹²。新的技术发展，例如为每种靶细胞和靶位点专门设计的高特异性电极，可能有助于电化学疗法（ECT）在体内任何部位精准靶向治疗组织¹²。电极的设计和放置必须确保肿瘤组织能够被完全覆盖，同时最大限度地减少对健康组织的影响，或避免其受到损伤¹³。

既往研究已报道了电穿孔化疗（ECT）在体外人黑色素瘤细胞悬液中的作用效果^7,8。然而，关于在三维眼细胞模型或其他类似体内环境中应用ECT以实现更安全治疗的相关文献仍较为有限。Brun等学者提出，在形态学分析过程中，支架中的三维细胞呈圆形，与二维培养中观察到的细长形态不同，但与患者活检组织中的细胞形态极为相似⁹。通过优化三维培养中所用的治疗参数和仪器设置，有望进一步改进ECT的治疗参数，从而实现更精确的临床应用⁹。

我们介绍了一种用于在三维细胞培养中应用电穿孔治疗（ECT）的新电极技术。博来霉素是与ECT联合使用最广泛的细胞毒性药物¹¹。本课题组先前的研究表明，所采用的电脉冲参数（750 伏/厘米，8次脉冲，100 毫秒，5 赫兹）适用于体外眼肿瘤的治疗。该技术的关键步骤包括：在类球体被激活后下沉过程中需在短时间内完成ECT操作，以及电极尺寸的精确性。定制电极的必要性源于使用现有仪器在孔板中实施ECT所遇到的困难。本课题组未发表的数据表明，当将类球体转移至更大的孔或比色皿中进行处理准备，然后再移回培养孔时，类球体的损伤显著增加。本方法的一个优势在于无需对类球体进行操作即可完成治疗，因为类器官无需转移至更大的培养板或孔中，因此所有类球体均能保持其原有形态。另一优势是采用了比标准活力检测（如MTT法）更为稳健的三维细胞活力检测方法来评估ECT的细胞毒性。该方法需裂解类球体中的所有细胞，并需要额外的细胞清洗、培养基去除以及多次移液步骤。

所述方法的局限性在于类球体的寿命较短，这会影响肿瘤的大小以及细胞坏死，如肿瘤类器官中心区域所见。心肌病（CM）和尿路恶性肿瘤（UM）均具有较高的死亡率，且治疗选择有限，因此需要丰富现有的治疗手段。电化学治疗（ECT）可能作为一种辅助治疗方式，有助于提高患者的生活质量并延长生存期。这些体外条件能够更精确地模拟体内环境，为后续的人体应用提供了有前景的结果。未来利用原代培养细胞制备的类球体开展的研究，可为优化针对特定治疗的ECT参数提供更具代表性的结果。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硫酸博来霉素	Enzo	BML-AP302-0010	10 mg
细胞培养瓶 75 cm	TPP	TPP90076
细胞培养瓶 TC175 cm	Sarstedt	83,39,12,002	带滤器的标准型
Cliniporator	IGEA	EPS01	电穿孔仪
Corning Costar 超低吸附多孔板，96 孔，圆底	Corning	7007	96 孔透明圆底超低吸附板
EGF 1MG	Sigma-Aldrich	E4127-.1MG
F-12 K 营养混合物 (1x)	Gibco	21127-022
胎牛血清，南美来源	Corning	35-079-CV	批号：35079010，预留编号：EU00478541
FKS
KGM-2	Lonza	CC-3103
不含 CaCl 和 MgCl 的 PBS	PromoCell	C-40232	500 ml
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P4333-100ml
RPMI 1640	Gibco	11504566	ATCC 改良型，含 HEPES，液体，500 ml
Tecan Infinity M Plex	Tecan
胰蛋白酶-EDTA 1x 溶液	Sigma-Aldrich	59430C-100ml