需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

结合激光捕获显微切割与微流控qPCR分析单细胞转录谱：一种研究阿片类药物依赖的系统生物学方法

4.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/60612

⸱

2020年3月8日

 ,  ,  ,  , 
1Daniel Baugh Institute for Functional Genomics and Computational Biology, Department of Pathology, Anatomy, and Cell Biology, Thomas Jefferson University, 2Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 3Department of Pharmacology & Physiology, Drexel University College of Medicine

本文内容

摘要

本方案介绍了如何使用激光显微切割技术，从杏仁核中央核中高精度、高解剖特异性地分离单个神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞。此外，我们还阐述了如何利用微流控RT-qPCR技术检测这些细胞部分转录组的表达情况。

摘要

解剖位置相邻的单个细胞之间存在显著的转录异质性，这表明复杂的组织功能可能依赖于细胞表型的多样性来实现。通过单细胞实验研究生物系统的网络动态，能够在具有生物学意义的分辨率下揭示细胞及组织对各种条件的响应。本文中，我们阐述了从特定解剖位置获取单个细胞，并精确检测其部分基因表达谱的方法。我们将激光显微切割技术（LCM）与微流控反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）相结合。此外，我们还利用该微流控 RT-qPCR 平台检测肠道内容物中微生物的丰度。

引言

单细胞基因表达谱的测定揭示了组织内存在广泛的表型异质性。这种复杂性增加了我们对调控组织功能的生物网络的理解难度。我们课题组及其他研究团队已在多种组织和条件下对这一现象进行了探索1,2,3,4,5,6。这些实验不仅表明基因表达网络的调控是此类异质性的基础，而且表明单细胞分辨率能够揭示出组织水平分辨率所无法察觉的组织功能复杂性。事实上，可能仅有少数细胞对特定条件或刺激产生响应，但这些细胞对整体生理功能的影响可能是显著的。此外，采用多变量方法分析来自多种细胞类型和组织的高维数据的系统生物学方法，有助于阐明治疗在全系统范围内的效应。

我们结合激光显微切割（LCM）和微流控反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）来获取此类数据集。本文采用此方法，与通过荧光激活细胞分选（FACS）获取单细胞并利用RNA测序（RNA-seq）检测其转录组的方法形成对比。相较于FACS，LCM的优势在于能够相对且绝对地记录单个细胞的精确解剖位置。此外，尽管RNA-seq可检测的特征多于RT-qPCR，但微流控RT-qPCR成本更低，且具有更高的灵敏度和特异性7。

在本项代表性实验中，我们研究了阿片类药物依赖以及纳洛酮诱导的阿片类药物戒断对大鼠中央杏仁核（CeA）中神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞基因表达以及肠道菌群丰度的影响4。共分析了四个处理组：1）安慰剂组，2）吗啡组，3）纳洛酮组，和4）戒断组（图1）。我们发现，阿片类药物依赖并未显著改变基因表达，但阿片类药物戒断诱导了炎症相关基因的表达，尤其是Tnf基因。星形胶质细胞是受影响最显著的细胞类型。阿片类药物戒断还显著影响了肠道微生物组，表现为厚壁菌门（Firmicutes）与拟杆菌门（Bacteroides）比值下降，该比值是肠道菌群失调的公认标志8,9。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本研究遵循托马斯杰斐逊大学和德雷塞尔大学医学院动物护理与使用委员会（IACUC）的建议进行。实验方案已获托马斯杰斐逊大学和德雷塞尔大学医学院IACUC批准。

1. 动物模型

  1. 在成年雄性Sprague-Dawley大鼠皮下植入两粒75 mg缓释硫酸吗啡丸或两粒安慰剂丸。
    1. 进行小型无菌手术时应适当穿戴手术衣和手套。如有需要，使用电推剪剃除大鼠背部毛发。
    2. 在动物眼睛上涂抹兽用眼膏。通过约20秒异氟烷吸入麻醉大鼠。以意识丧失确认麻醉成功。
    3. 使用经 bead-sterilized 的钝头剪刀在大鼠背部正中线做切口，并用经 bead-sterilized 的探针将真皮层与体壁分离。用经 bead-sterilized 的镊子将药丸植入真皮下，再用无菌针线缝合切口。
      注：整个操作过程每只大鼠约需5分钟。每只大鼠均需更换新的无菌手套。
    4. 将大鼠放入隔离笼中进行术后恢复。检查心跳及呼吸节律是否正常。观察直至大鼠意识恢复，并评估术后疼痛情况。
    5. 术后8小时及之后每隔12小时评估大鼠恢复情况和感染迹象。当大鼠术后完全恢复（约术后24小时）后，将其与其他实验组大鼠共同饲养。
  2. 在吗啡暴露6天后，对G组和戒断组大鼠进行腹腔注射纳洛酮（75 mg/kg）。
    注：本代表性实验共包含四组大鼠（见图1）。

2. 样品采集

  1. 在颗粒植入后第6天或纳洛酮注射后24小时，采集脑组织。
    1. 将动物放入异氟烷吸入装置中约30秒，或直至动物意识丧失，表现为无活动且呼吸频率降低。
    2. 使用锋利的断头器迅速将动物断头。
    3. 从动物颅骨中解剖出脑组织。
    4. 使用锋利的手持剃刀对取出的脑组织进行以下粗略切开：首先，切除小脑并弃去；其次，通过横切将脑干与前脑分离；第三，通过正中矢状切口将前脑和/或脑干进行半切。
    5. 将前脑和脑干放入塑料组织包埋模具中，模具底部加入3-4 cm的OCT包埋剂（Optimal Cutting Temperature compound），并用OCT覆盖其余样本部分。
    6. 立即将覆盖OCT的塑料组织包埋模具放入盛有干冰和甲醇的容器中。注意避免甲醇流入组织包埋模具内。将包埋模具连同样本置于甲醇-干冰浴中，直至完成组织取样（最长约10-15分钟）。
    7. 尽快将脑样本放入-80 °C超低温冰箱中保存。
  2. 同时采集肠道样本。
    1. 在快速断头后，使用手术刀在动物腹部做正中切口。
    2. 找到盲肠，并切断其与升结肠的连接。
    3. 将盲肠内容物挤入15 mL锥形管中。
    4. 立即把锥形管置于干冰上，并尽快放入-80 °C超低温冰箱中。
      注：小肠内容物也可采用相同方法采集，作为阴性对照。

3. 切片

  1. 使用冷冻切片机切割半切的鼠类前脑。
    1. 从 -80 ℃取出带有前脑的塑料包埋模具 °C 冷冻箱，并置于 -20 °C 冷冻切片机。
    2. 从包埋模具中取出包埋在OCT中的半脑前脑样本。如有必要，使用剃刀垂直切去塑料包埋模具的角落。使用OCT将前脑固定在冷冻切片机的样品夹头上，用于从吻侧到尾侧的冠状切片。
      注意：用于识别中央杏仁核（CeA）的解剖学标志包括视束和终纹图2B。视束从视交叉分出，随着脑组织从吻侧向尾侧切片，其走向为背外侧。当视束的形态与大鼠脑图谱中bregma -2.12 mm处所见相似时10，可将测试切片置于显微镜下观察。可通过大鼠脑图谱核对视束和终纹的形态。10 以确定前囟位置以及中央杏仁核（CeA）是否环绕终纹
    3. 切片 10 µ从半脑前脑由前至后切取厚度为 m 的冠状切片，直至获得包含中央杏仁核（CeA）的切片。
      注意：切片的宽度和高度约为 200 mm。
    4. 收集10 µm切片，其中包含中央杏仁核（CeA）或首选脑区，通过解冻贴片法获取10 µ将切片置于普通载玻片上。立即将载玻片放置在置于干冰上的金属盘中。将带有脑切片的载玻片放入 -80 °尽快放入 C 冷冻机。
      注意：多个切片可放置在同一张载玻片上。若在同一张载玻片上的切片使用不同的细胞类型染色剂，切片间应相距约100 mm，以便使用疏水笔在载玻片上分隔不同细胞类型的抗体溶液。每个切片两侧与载玻片边缘的距离应保留约20 mm。

4. 免疫荧光染色

  1. 使用免疫荧光法对前脑切片中目标脑细胞（例如神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞等）进行染色。
    1. 从 -80 °C 冰箱中取出一张或多张含有 CeA 10 µm 切片的载玻片。
    2. 用 75% 乙醇固定载玻片 30 秒，去除多余液体。
    3. 用含 2% 牛血清白蛋白（BSA）的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）封闭切片 30 秒，随后用 PBS 洗涤 1 次。
    4. 向载玻片加入一抗溶液，孵育 2 分钟，然后用 2% BSA 溶液洗涤 1 次。
      注：一抗溶液由 2% 一抗、1% RNase Out 和 96% 上述封闭步骤（步骤 4.1.3）所用的 BSA PBS 溶液组成。代表性实验中使用了以下用量的抗 NeuN 抗体、抗 Cd11β 抗体和抗 GFAP 抗体：一抗 3 µL，RNA 抑制剂 1.88 µL，BSA 溶液 145.12 µL。
    5. 向载玻片加入二抗溶液，孵育 3 分钟，然后用 PBS 洗涤 1 次。
      注：二抗溶液由 1 µL 羊抗小鼠 488 nm 荧光标记抗体（1:500）、2.5 µL RNA 抑制剂、1.3 µL DAPI（1:10,000）和 196.5 µL 2% BSA 溶液组成。

5. 乙醇和二甲苯脱水系列

  1. 将载玻片浸入75%乙醇中30秒。随后立即浸入95%乙醇中30秒。随后立即浸入100%乙醇中30秒。随后立即浸入第二个盛有100%乙醇的容器中30秒。
  2. 完成乙醇脱水步骤后，将载玻片浸入新配制的二甲苯中1分钟。随后立即浸入第二个二甲苯容器中4分钟。
  3. 将载玻片从二甲苯中取出，在避光条件下静置晾干5分钟。
  4. 将载玻片放入干燥器中进一步干燥5分钟。

6. 激光捕获显微切割

  1. 若已染色，将切片置于显微镜下，利用解剖学标志（如视交叉和终纹）找到目标区域（CeA）。
  2. 使用荧光识别目标区域内染色的细胞类型及其细胞核。若进行单细胞混合样本实验，可选择一个或多个细胞。使用激光显微切割（LCM）软件标记目标细胞。
  3. 将LCM帽置于目标区域组织切片的上方。
  4. 使用红外（IR）激光的测试脉冲调整激光强度、光斑大小和作用时间，使LCM帽的粘合剂仅在选定单个细胞区域熔化，从而确保仅收集所选细胞，避免其他细胞被采集。
    注意：在此代表性实验中，将同种细胞类型的10个细胞池作为单个样本使用，以减少相同处理条件下样本间因细胞差异导致的基因表达变异。但该方法也可用于真正的单细胞实验1,3。
  5. 使用LCM软件工具选择用于分析的单个细胞（图2C）。所选细胞必须位于基于大鼠脑图谱和前囟（bregma）位置确定的CeA解剖区域内10。所选细胞应距离相邻染色的细胞核至少3 µm。
  6. 发射红外激光以收集已识别的单个细胞。
  7. 将帽置于质量控制（QC）站中观察，确认仅收集了目标细胞。若误选其他细胞，可在帽仍位于QC站时使用紫外激光破坏非目标细胞。
  8. 拍摄细胞采集部位的组织切片照片，以记录其解剖学特异性。如适用，参考大鼠脑图谱记录切片与前囟之间的距离10。
  9. 从QC站取下LCM帽，连接样本提取装置，并加入5.5 µL裂解缓冲液。
    注意：裂解缓冲液由0.5 µL裂解增强剂和5 µL重悬缓冲液组成。
  10. 将ExtracSure装置安装至0.5 mL微量离心管上，并置于75 °C加热板上孵育15分钟。
  11. 以低速（0.01–0.02 × g）离心30秒，使样本和裂解缓冲液沉降至管底，随后将收集的样本置于-80 °C冰箱中保存。

7. 单细胞微流控逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）

  1. 用于96.96动态阵列芯片的单细胞mRNA预扩增
    1. 将所有待检测基因的mRNA qPCR正向和反向引物混合，配制成预扩增用引物池（每种引物终浓度为500 nM）。例如，将1 µL的100 µM引物加入80 µL中，再加入120 µL DNA悬浮缓冲液。
      注：代表性实验所用引物序列见O'Sullivan等4。
    2. 在新的96×96 PCR板中，向每个孔加入1 µL 5x VILO。
    3. 从-80 °C保存的样品中取出激光捕获显微切割（LCM）获得的单细胞样本，短暂解冻，低速短暂离心（0.01–0.02 x g），并将5.5 µL裂解后的单细胞样本加入PCR板中。每个样本加入独立的孔中。
    4. 将含有样本和VILO的PCR板放入热循环仪，65 °C加热1.5分钟。在4 °C下以1,300 x g离心1分钟，然后将PCR板置于冰上。
    5. 向每个孔中加入0.15 µL 10x cDNA合成主混合液、0.12 µL T4 Gene 32蛋白和0.73 µL DNA悬浮缓冲液。
    6. 将PCR板放入热循环仪，运行以下程序：25 °C 5分钟，50 °C 30分钟，55 °C 25分钟，60 °C 5分钟，70 °C 10分钟，4 °C保存至结束。
    7. 向每个孔中加入7.5 µL Taq聚合酶主混合液。
    8. 向每个孔中加入1.5 µL引物池（见上文）。
    9. 将PCR板放入热循环仪，运行以下预扩增程序：95 °C 10分钟，随后进行22个循环（96 °C 5秒，60 °C 4分钟）。
    10. 向每个孔中加入0.6 µL 10x外切酶I反应缓冲液、1.2 µL外切酶I和4.2 µL DNA悬浮缓冲液。
    11. 将PCR板放入热循环仪，运行以下程序：37 °C 30分钟，80 °C 15分钟。
    12. 向每个孔中加入54 µL TE缓冲液。在1,300 x g下离心5分钟。若立即进行下一步操作，则储存于4 °C；若下一步操作延迟超过12小时，则储存于-20 °C。
  2. 准备96.96动态阵列芯片的样本板。
    1. 在新的96孔PCR板中，向每个孔加入0.45 µL 20x DNA结合染料和4.55 µL低ROX主混合液。
    2. 向每个孔中加入3 µL预扩增样本，以1,300 x g离心PCR板，然后将板置于冰上。
  3. 准备96.96动态阵列芯片的检测板。
    1. 在新的96孔PCR板中，向每个孔加入3.75 µL 2x GE检测加载试剂和1.25 µL DNA悬浮缓冲液。
    2. 向每个对应的孔中加入2.5 µL 10 µM qPCR引物。在1,300 x g下离心PCR板5分钟。
  4. 加载并运行96.96动态阵列芯片。
    1. 用控制线流体对芯片进行预处理。
    2. 将芯片放入IFC控制器HX中，运行“Prime (136X)”程序。
    3. 从PCR样本板中取6 µL样本，加入96.96动态阵列芯片对应的样本孔中。
    4. 从PCR检测板中取6 µL样本，加入96.96动态阵列芯片对应的检测孔中。
    5. 使用针头刺破96.96动态阵列芯片各孔中的气泡。
    6. 将96.96动态阵列芯片放入IFC控制器HX中，运行“Load Mix (136x)”程序。
    7. 从IFC控制器HX中取出芯片，撕去保护贴膜，将96.96动态阵列芯片放入微流控RT-qPCR平台中。运行GE Fast 96 x 96 PCR程序（30个循环）。
      注：通过多种方法评估RNA质量和结果的有效性，包括通过凝胶电泳进行检测验证、熔解温度曲线分析、样本和检测重复实验以及标准稀释系列图谱。此外，还可通过脑半切组织的独立方法（如Western blot和免疫荧光检测）验证转录组学结果。

8. 使用微流控反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测细菌丰度

  1. 按照粪便DNA提取试剂盒的说明提取细菌DNA。
  2. 使用qPCR估算细菌DNA浓度。
  3. 将提取的细菌DNA加入新的PCR板中。每孔加入1 µL提取的细菌DNA和9 µL DNA悬浮缓冲液。
  4. 准备48.48动态阵列芯片的检测板（参见步骤7.2.1–7.2.2）。
  5. 准备48.48动态阵列芯片的样本板（参见步骤7.3.1–7.3.2）
    1. 在新的96孔PCR板中，向48个孔中各加入0.45 µL的20倍DNA结合染料和4.55 µL低ROX预混液。
    2. 从含有细菌DNA的PCR板中取3 µL样本加入上述48个孔中，以1,300 × g离心5分钟。置于4 °C保存。
  6. 加载并运行48.48动态阵列芯片（参见步骤7.4.1–7.4.7）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

单细胞的选择通过视觉和分子方法进行了验证。在视觉上，细胞收集前会观察细胞形态。收集后的细胞在质控站再次观察，细胞核染色（DAPI）与单细胞选择标记的荧光信号重叠。图2A展示了包含中央杏仁核（CeA）的半切大鼠前脑切片的代表性图像。后续图像（图2B-D）展示了单个细胞的选择及其从组织中移除以进行转录组分析的过程。在分子水平上，细胞类型特异性标志物在相应细胞类型中表现出表达量升高（图1C）。我们检测了神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞，并分别测量了NeuN、Maf和Gfap的表达水平。这些图像最初发表于O'Sullivan等人的研究4中。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

单细胞生物学揭示了细胞表型的异质性以及组织功能的稳健性。这些发现加深了人们对生物系统在宏观和微观尺度上组织方式的理解。本文中，我们描述了两种方法的结合使用：激光显微切割（LCM）和微流控qPCR，以获得具有解剖学特异性和转录准确性的单细胞转录组数据，且成本相对较低（图1）。我们课题组采用系统生物学的研究策略，通常在同一动物个体中检测多种组织。我们发现这些方法在揭示生物系统在转录水平上如何响应各种挑战方面具有高度灵活性和研究价值。此外，我们还利用这些方法在基础状态下进行细胞表型的解剖学定位分析。

我们提供了一项近期发表的研究中的数据和修改后的图示，该研究探讨了中央杏仁核（CeA）对阿片类药物依赖及戒断的反应4。在此示例中，我们使用相同的微流控qPCR平台来检测肠道微生物群的相对丰度。相关方法和工作流程总结于图1，最初发表于O'Sullivan等人4。高通量微流控RT-qP...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）HLB项目U01 HL133360（授予JS和RV）、NIDA项目R21 DA036372（授予JS和EVB）以及T32 AA-007463（授予Jan Hoek，用于支持SJO'S）资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
20X DNA结合染料Fluidigm100-7609NA
2x GE检测加载试剂Fluidigm85000802-RNA
用于基因表达的48.48动态阵列IFCFluidigmBMK-M-48.48NA
用于基因表达的96.96动态阵列IFCFluidigmBMK-M-96.96NA
Anti-Cd11β 抗体Genway BiotechCCEC48小胶质细胞染色
Anti-NeuN抗体，克隆A60EMD MilliporeMAB377神经元染色
ArcturusXT激光捕获显微切割系统ArcturusNANA
Biomark HDFluidigmNART-qPCR平台
牛血清白蛋白Sigma-AldrichB4287
CapSure Macro LCM盖片ThermoFisher ScientificLCM0211NA
CellDirect一步法qRT-PCR试剂盒ThermoFisher Scientific11753500裂解缓冲液组分
DAPIThermoFisher Scientific62248细胞核染色
DNA悬浮缓冲液TEKnovaT0221
外切核酸酶INew England BioLabs, Inc.M0293SNA
ExtracSure样本提取装置ThermoFisher ScientificLCM0208NA
Fisherbrand Superfrost Plus显微镜载玻片ThermoFisher Scientific22-037-246普通玻璃载片
GeneAmp薄壁反应管ThermoFisher ScientificN8010611
GFAP单克隆抗体ThermoFisher ScientificA-21294星形胶质细胞染色
山羊抗小鼠IgG (H+L) Superclonal™ 重组二抗，Alexa Fluor 488标记ThermoFisher ScientificA28175二抗
IFC控制器FluidigmNANA
RNaseOutThermoFisher Scientific10777019
SsoFast EvaGreen Supermix（含低Rox）Bio-RadPN 172-5211Rox预混液
SuperScript VILO cDNA合成试剂盒ThermoFisher Scientific11754250包含VILO和SuperScript
T4 Gene 32蛋白New England BioLabs, Inc.M0300SNA
TaqMan PreAmp主混合液ThermoFisher Scientific4391128NA
TE缓冲液TEKnovaT0225NA

参考文献

  1. Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
  2. Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).
  3. Park, J., et al. Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481(2016).
  4. O'Sullivan, S. J., et al. Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665(2019).
  5. Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).
  6. Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).
  7. SEQC/MAQC-III Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).
  8. Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease. Physiological Reports. 5, (2017).
  9. Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut. 53, 1-4 (2004).
  10. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (2006).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

单细胞分析转录谱分析中央杏仁核基因表达微流控反转录PCR细胞分离组织切片
结合激光捕获显微切割与微流控qPCR分析单细胞转录谱：一种研究阿片类药物依赖的系统生物学方法
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。