方法文章

将激光捕获微切片和微流体qPCR相结合，分析单细胞的转录曲线:阿片类药物依赖的系统生物学方法

DOI：

10.3791/60612

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2020年3月8日

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1Daniel Baugh Institute for Functional Genomics and Computational Biology, Department of Pathology, Anatomy, and Cell Biology, Thomas Jefferson University, 2Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 3Department of Pharmacology & Physiology, Drexel University College of Medicine

本文内容

摘要

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该协议解释了如何使用激光捕获微解剖，以高精度和解剖特异性从杏仁核的中央核收集单个神经元、微胶质和星形细胞。此外，我们解释我们使用微流体RT-qPCR测量这些细胞转录的子集。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在解剖学相邻的单细胞中，深刻的转录异质性表明，通过细胞表型多样性可以实现强大的组织功能。研究生物系统网络动力学的单细胞实验以生物有意义的分辨率显示细胞和组织对各种条件的响应。在这里，我们解释了我们从解剖学特定位置收集单个细胞的方法，并精确测量其基因表达特征的子集。我们将激光捕获微切切（LCM）与微流体反向转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）相结合。我们还使用这个微流体RT-qPCR平台来测量肠道含量的微生物丰度。

引言

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测量单个细胞的基因表达特征已证明组织内具有广泛的球型异质性。这种复杂性使我们对控制组织功能的生物网络的理解复杂化。我们小组和其他人士在许多组织和条件1、2、3、4、5、6中探索了这种现象。这些实验不仅表明基因表达网络的调节是这种异质性的基础，而且单细胞分辨率揭示了组织功能的复杂性，而组织级分辨率却无法理解。事实上，只有一小部分细胞可能对特定条件或挑战做出反应，但这些细胞对整体生理的影响可能很大。此外，将多变量方法应用于来自多个细胞类型和组织的高维数据集的系统生物学方法可以阐明系统范围的处理效果。

我们将 LCM 和微流体 RT-qPCR 相结合，以获得此类数据集。我们在此采用这种方法，与通过荧光活性细胞分拣（FACS）和使用RNA测序（RNA-seq）测量其转录组进行采集单个细胞形成鲜明对比。LCM 优于 FACS 的优点是，单细胞的精确解剖特异性可以通过 LCM 相对和绝对进行记录。此外，虽然RNA-seq可以测量RT-qPCR的更多特性，但微流体RT-qPCR的成本较低，灵敏度和特....

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方案

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这项研究是根据托马斯·杰斐逊大学和德雷塞尔大学医学院动物护理和使用委员会（IACUC）的建议进行的。该协议得到了托马斯·杰斐逊大学和德雷塞尔大学医学院IACUC的批准。

1. 动物模型

  1. 在成年雄性斯普拉格-道利大鼠中，插入两个75毫克慢释放的吗啡硫酸盐颗粒或两个安慰剂颗粒。
    1. 适当使用长袍和手套进行小型无菌手术。如有必要，用剪子切碎大鼠的多sum。
    2. 在动物的眼中涂上兽医药膏。用大约20s的西罗拉内吸入麻醉大鼠。麻醉是由意识丧失证实的。
    3. 用珠子消毒钝剪刀在大鼠多香中切口，用珠子消毒探头将真皮从身体壁中分离出来。用珠子消毒钳将颗粒插入真皮下。用无菌针头缝合切口。
      注:整个过程每只大鼠大约需要5分钟。每只老鼠都使用新鲜的无菌手套。
    4. 将大鼠放入隔离笼中，以便术后恢复。检查心跳和常规呼吸节律。观察老鼠，直到意识恢复。评估手术后疼痛。
    5. 评估大鼠8小时后和每12小时后恢复和感染。当大鼠从手术中完全康复时，大约24小时后，将大鼠与其余组人一起关在笼子里。
  2. 在6天吗啡暴露后，给G和戒断组注射腹内纳曲酮（75毫克/千克）。
    注:在这个具有代表性的实验中有四个大鼠群（参见图1）。

2. 样品采集

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结果

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单细胞的选择在视觉和分子上都得到了验证。从视觉上看，细胞形态在细胞采集之前被查看。然后，在QC站观察采集的细胞，细胞核染色（DAPI）与单细胞选择标记荧光重叠。图 2A显示了包含 CeA 的缺鼠前脑的幻灯片的代表性图像。后续图像 （图 2B-D） 显示了单细胞的选择及其从组织中取出进行转录分析。分子方面，细胞类型特异性标记显示该细胞类型的表达增加（图1C）。我们观察了神经元、微胶质和星形细胞，并分别测量了NeuN、Maf和Gfap的表达。 这些数字最初发表在奥沙利文等人4。

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讨论

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单细胞生物学证明了细胞表型的异质性和组织功能的鲁棒性。这些发现使人们对宏观和微观尺度生物系统的组织提供了见解。在这里，我们描述了两种方法的组合，LCM和微流体qPCR，以获得单细胞转录测量，提供解剖特异性和转录精度在相对较低的成本（图1）。我们小组采用系统生物学方法，经常测量同一动物中的多个组织。我们认为这些方法在确定生物系统在转录一级如何应对各种挑战方面既灵活又富有成果。此外，我们在基线条件下细胞表型的解剖映射中使用这些方法。

我们提供最近一份出版物的数据和修改数据，探讨CeA如何应对阿片类药物依赖和戒断4。在此示例中，我们使用相同的微流体 qPCR 平台来测量肠道微生物群的相对丰度。方法和工作流在图 1中进行了总结，最初发表在奥沙利文等人4中。高通量微流体RT-qPCR的主要发现随后可以通过蛋白质测量（如西式斑点或免疫荧光4）

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披露

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作者宣称他们没有相互竞争的财务利益。

致谢

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这里提供的工作是通过NIH HLB U01 HL01 HL01 HL133360授予JS和RV，NIDA R21 DA036372授予JS和EVB，T32 AA-007463授予扬霍克支持SJOS。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
20X DNA 结合染料流体100-7609NA
2x GE 检测上样试剂流体85000802-RNA
48.48 用于基因表达流体的动态阵列 IFC流体BMK-M-48.48NA
96.96 用于基因表达流体的动态阵列 IFGBMK-M-96.96NA
抗 CD11&β;抗体Genway BiotechCCEC48小胶质细胞染色
抗NeuN抗体，克隆A60EMD MilliporeMAB377神经元染色
ArcturusXT 激光捕获显微切割系统ArcturusNA
NA Biomark HDFluidigmNART-qPCR 平台
牛血清抗原Sigma-AldrichB4287
CapSure 宏量 LCM 盖ThermoFisher ScientificLCM0211NA
CellDirect 一步法 qRT-PCR 试剂盒ThermoFisher Scientific11753500裂解缓冲液组分
DAPIThermoFisher Scientific62248细胞核染色
DNA 悬浮缓冲液TEKnovaT0221
核酸外切酶 I新 Englnad BioLabs， Inc.M0293SNA
ExtracSure 样品提取装置ThermoFisher ScientificLCM0208NA
Fisherbrand Superfrost Plus 显微镜载玻片ThermoFisher Scientific22-037-246普通载玻片
GeneAmp 薄壁反应管ThermoFisher ScientificN8010611
GFAP 单克隆抗体ThermoFisher ScientificA-21294星形胶质细胞染色
山羊抗小鼠 IgG （H+L），Superclonal™重组二抗，Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA28175Seconadry 抗体
IFC 控制器FluidigmNANA
RNaseOutThermoFisher Scientific10777019
SsoFast EvaGreen 低 Rox 超混合Bio-RadPN 172-5211Rox 预混液
SuperScript VILO cDNA 合成试剂盒ThermoFisherScientific11754250包含 VILO 和 SuperScript
T4 基因 32 蛋白New Englnad BioLabs， Inc.M0300SNA
TaqMan PreAmp 预混液ThermoFisher Scientific4391128NA
TE 缓冲液TEKnovaT0225NA
用于基因表达剂 液

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
  2. Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single ....

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