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膜和细胞壁选择性荧光染料在丝状真菌活细胞成像中的应用

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DOI：

10.3791/60613

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2019年11月28日

 , 
1Department of Microbiology, University of Innsbruck

本文内容

摘要

活性荧光染料是现代真菌细胞生物学中活细胞成像分析的重要工具。本文详细介绍了已知及较少使用的荧光染料在丝状真菌中用于追踪质膜动态、内吞/外排作用以及细胞壁形态发生的应用方法。

摘要

利用膜和细胞壁特异性荧光染料对真菌细胞中的细胞器动态进行活细胞成像分析始于二十年前，此后持续极大地推动了我们对丝状真菌生活方式的理解。本文提供了两种膜染料FM 1-43和FM 4-64，以及四种细胞壁染色剂Calcofluor White M2R、Solophenyl Flavine 7GFE 500、Pontamine Fast Scarlet 4B和Congo Red的实际应用指南。重点在于这些染料的低剂量使用以确保无伪影染色、共成像特性及其定量评估方法。所介绍的方法适用于所有可通过所述方式制备的丝状真菌样品。这些基本染色方法可作为适应不同培养条件物种的改良起点。首先，回顾了染料的生物物理和生物化学特性，因为理解这些特性对于将其真正用作活体荧光染料至关重要。其次，提供了详细的分步操作方案，介绍多种真菌样品类型用于荧光活细胞成像的制备流程。最后，通过示例实验展示了以下四种研究策略：（1）鉴定遗传突变体中内吞作用时空组织的缺陷；（2）比较分析内吞途径中GFP标记靶蛋白的共定位特征及其异同；（3）识别遗传突变体中的形态发生性细胞壁缺陷；（4）实时监测细胞壁的生物合成过程。

引言

二十年前，膜选择性荧光染料FM 4-641的应用彻底改变了对丝状真菌菌丝形态发生及其分子细胞生物学基础的可视化研究方式。随后，人们认识到几丁质结合染料Calcofluor White作为真菌细胞壁动态的活体荧光标记物具有重要价值2。自此以来，这两种染料及其衍生变体已成为真菌细胞器动态活细胞成像分析中不可或缺的工具，并持续为深入了解丝状真菌的生活方式提供前所未有的视角。本文详细介绍了已确立及较少使用的荧光染料在追踪丝状真菌中质膜动态、内吞与外排作用以及细胞壁形态发生方面的应用。内吞作用追踪实验可用于解答与内吞作用通路研究相关的多种细胞生物学问题3。为此，通过延时显微镜记录添加FM染料后标记区室的定位、移动速度和时序进程，并在不同测试真菌菌株之间进行定量比较4。细胞壁染料可清晰界定细胞的外边界，从而实现对形态发生事件的追踪，包括极性菌丝顶端生长2、菌丝分枝5、菌丝融合6,7以及隔膜形成8。此外，这些染料有助于定量分析局部细胞壁沉积情况，并识别细胞壁生物合成过程中的缺陷9。由于对任何荧光标记物的生化与生物物理特性的深入了解是其成功应用于活体实验的基本前提，本文首先总结了本研究所涉及的六种染料的这些特性。

膜选择性染料
FM（Fei Mao）苯乙烯类染料是一类小分子两亲性化合物，不能穿过生物膜的脂双层，但可逆地结合于脂双层的外层。这类染料在水溶液中几乎无荧光，但一旦插入质膜后即产生强烈的荧光，从而获得优异的信噪比（S/N）11。这些特性使其非常适用于观察质膜及细胞内细胞器的动态过程，包括内吞和外吐作用的追踪12。其中，绿色荧光的FM 1-43和红色荧光的FM 4-64是目前最广泛使用的两种荧光膜标记物。SynaptoGreen C4和SynaptoRed C2是来自其他供应商的通用替代分子，可分别替代FM 1-43和FM 4-64使用10。

苯乙烯染料包含三个关键结构区域：（1）疏水性尾部，可促进染料插入脂双层；（2）荧光团核心，决定染料的光谱特性，由通过一个至三个双键连接的两个芳香环构成；（3）带正电荷的亲水性头部，可防止染料完全插入并穿透膜（图1A）。

疏水尾链越长，染料的疏水性越高，因而与膜的结合亲和力越强，但其水溶性越低，且从膜上脱染的速率也越慢。因此，不同的FM染料变体产生不同的染色动力学和染色模式。在等摩尔浓度下应用时，具有较长C4尾链的FM 1-43因其更高的疏水性，能够比短C2尾链的FM 4-64更快地在质膜和细胞内细胞器上产生更强且更稳定的荧光信号（图2）。

重要的是，FM染料与细胞膜的结合/解离速率始终保持较高水平，单个染料分子的平均滞留时间为1–6秒13，这降低了对膜功能产生局部干扰的可能性，例如因改变膜流动性或迫使膜蛋白发生永久性相互作用而造成的干扰11。这可能是这些分子能够作为活体染料使用的关键原因。然而，FM染料浓度超过50 µM时对真菌和植物细胞具有毒性2,14，来自烟草BY-2原生质体的研究证据表明，当FM染料浓度超过20 µM时会导致质膜饱和14。因此，建议不要超过这一浓度限值，尤其是已有研究表明，仅使用2–5 µM的FM染料即可获得优异的成像效果15,16。

值得注意的是，FM 染料的光谱特性在很大程度上取决于特定的膜微环境（综述见14）。通常情况下，FM 染料在纯溶剂溶液中的激发和发射光谱（通常在产品说明书中提供）与其在细胞环境中的光谱存在显著差异，在大多数情况下，不能直接用于选择活细胞成像的参数设置。例如，FM 1-43 和 FM 4-64 在结合真菌膜后，其激发/发射最大值相较于甲醇溶液分别蓝移了 37/46 nm 和 43/64 nm（表 1）。

FM 4-64 和 FM 1-43 在追踪丝状真菌质膜、内吞/外排作用以及细胞器动态（包括 Spitzenkörper 和线粒体）方面的开创性基本原理，此前已在多种丝状真菌中得到全面记录2,4,17,18,19。适用于多种丝状真菌的两种 FM 染料推荐成像参数如图1B所示。然而，由于所用设备的技术限制，或特定的细胞与实验条件（如培养基、pH 或温度），可能需要对参数进行一定调整。幸运的是，FM 染料具有较宽的光谱范围，使用 514 nm 激发 FM 1-43 或使用 488 nm 激发 FM 4-64 均可获得良好的成像效果。因此，最佳成像参数需针对每种样品类型和具体应用单独确定。

FM 4-64 具有超过 135 nm 的显著斯托克斯位移，使其能够与发射绿光的荧光染料进行优异的同步共成像；这一特性常被用于评估绿色荧光蛋白（GFP）标记的融合蛋白相对于质膜和内吞途径的细胞内定位动态9,20。

细胞壁选择性染料
Calcofluor White M2R（CFW），也以荧光增白剂28（Fluorescent Brightener 28）之名销售，可能是最广为人知的用于染色细菌、真菌、藻类、高等植物和昆虫细胞壁的荧光染料。该染料最初被用作造纸、纺织和洗涤剂工业中的光学增白剂，但其在真菌感染临床诊断中的应用价值很早就已被认识21,22。由于CFW不可逆地嵌入新生的几丁质链中，因此在细胞壁生物合成过程中会干扰正常的几丁质微原纤维组装，从而引发细胞壁应激23。这反过来会激活细胞壁损伤修复机制，导致葡聚糖和几丁质合成酶被激活，从而在局部增加细胞壁物质的沉积24,25。这种现象可发生于任何通过稳定结合细胞壁多糖而起作用的染料，具有浓度依赖性，并且在菌丝尖端最为明显，因为这些区域是菌丝体中生长最活跃、因而也最敏感的部分（图3）。最近已有研究对响应细胞壁损伤的分子机制进行了全面综述26。

染料过量与光毒性联合作用可导致菌丝区室迅速发生细胞裂解（影片1）。尽管如此，相较于野生型中“活体染色”浓度更为敏感的反应可用于鉴定基因功能缺失突变体在细胞壁生物合成中的缺陷9。对于棉酚荧光增白剂（CFW）和刚果红（CR）——后者是另一种纺织染料，亦称直接红28，被用作真菌和昆虫中α-和β-壳多糖特异性的细胞壁染色剂27,28——已确定强烈诱导壳多糖合成酶的阈值浓度分别为> 60 µM CFW 和 > 70 µM CR，而任一染料浓度<15 µM 时则不会改变或抑制真菌生长29,30,31。Hickey 等人将 CFW 的该阈值浓度定为 25 µM2。因此，建议使用 ≤ 5 µM 的染料浓度，以排除与应激相关的假象，确保这些分子真正作为“活体荧光染料”使用2,32。这一原则同样适用于 Solophenyl Flavine 7GFE 500（SPF）和 Pontamine Fast Scarlet 4B（PFS），它们分别同义于直接黄86和直接红23，是另外两种有用的细胞壁染料，其在真菌中的应用首次报道距今已超过十年33。然而，尽管它们具有显著的光谱特性34,35，这两种染料自那以后的应用仍非常有限36,37。如先前对 1.5 µM CFW 所示2，2 µM SPF 足以在天然条件下以极高的时间分辨率解析细胞壁动态变化（影片2）。使用 2 µM CR 或 PFS 也可获得相同结果。

上述四种染料——CFW、SPF、PFS 和 CR——共同构成了一组细胞壁特异性荧光标记物，覆盖了现代荧光显微镜所使用的几乎整个可见光发射光谱范围（400–700 nm）（图4）。这四种染料在结合细胞壁多聚物后荧光强度均显著增强，这一特性使其具有优异的信噪比。因此，可在染料浓度和激发光强度均保持极低的条件下进行成像，从而将细胞壁染色作为一种“低剂量”活细胞成像技术来实施2。由于这些细胞壁染料无法穿透质膜，它们可同时用作活/死细胞染色剂。值得注意的是，由于 CFW 和 SPF 的发射光谱范围极宽，在与其他荧光染料共成像时需谨慎考虑其兼容性限制。

方案

1. 真菌样品的制备

  1. 真菌预培养
    1. 将目标菌株接种至适宜的固体琼脂培养基上，例如 Trichoderma atroviride 使用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA），Neurospora crassa 使用Vogel最小培养基（VMM）。若使用转化菌株，需添加适当的筛选标记。
    2. 在生物体最适温度下培养预培养物。例如，T. atroviride 在25 °C，N. crassa 在30 °C，并采用12 h/12 h光照/黑暗循环，直至菌丝体开始产孢但尚未到达培养皿边缘。在标准尺寸的培养皿（9.2 cm Ø）上，野生型 T. atroviride 通常需要4–6天，而野生型 N. crassa 平均在3–4天即可达到此阶段。
  2. 真菌菌落的培养
    1. 使用无菌手术刀，从预培养菌落边缘切取一块携带非产孢菌丝的小型3 mm × 3 mm琼脂块。
    2. 将琼脂块置于新鲜固体培养基平板中央，以接种实验培养物。
    3. 根据拟研究的发育阶段，进行实验培养。例如，野生型 T. atroviride 在PDA培养基上于25 °C避光培养20–22小时，可形成直径约2 cm的菌落；而野生型 N. crassa 在VMM培养基上于30 °C避光培养14–16小时后，菌落直径可达约4 cm。
      注意：避光培养可防止色素形成，从而避免自发荧光。为消除实验培养物中的培养基背景荧光，可用1.5% w/v透明凝固剂（见材料表）替代琼脂，并用明确的最低限度培养基替代任何复合培养基。
  3. 固体萌发菌培养物的培养
    1. 使用5 mL无菌生理盐水（0.9% w/v NaCl）从预培养平板上收集分生孢子，并将所得孢子悬液收集至15 mL螺口离心管中。
    2. 通过剧烈涡旋充分混匀孢子悬液，随后将其过滤至一段预先装入1 mL移液器吸头（预先组装并高压灭菌）的1 cm × 5 cm无菌滤膜条（见材料表）中，滤入新的无菌离心管。
    3. 使用细胞计数板测定孢子密度，并用生理盐水配制浓度为1 × 107 个细胞/mL的孢子悬液。
      注意：孢子悬液可在4 °C保存最多两周。
    4. 准备一个标准尺寸的培养皿（9.2 cm Ø），加入20 mL固体培养基，并在其表面放置15–20颗无菌玻璃珠（3 mm Ø）。
    5. 将200 µL孢子悬液滴加至培养基表面，通过轻轻摇动使细胞均匀分布于整个培养皿。随后将玻璃珠收集至盛有70%乙醇的烧杯中以备重复使用。
    6. 根据拟研究的发育阶段进行实验培养。例如，T. atroviride 野生型在PDA培养基上于25 °C避光培养5–6小时即可形成分生孢子萌发菌，而 N. crassa 野生型在VMM培养基上于30 °C避光培养3–4小时后即可形成分生孢子萌发菌。
      注意：为消除实验培养物中的任何培养基背景荧光，可用1.5% w/v透明凝固剂替代琼脂，并用明确的最低限度培养基替代任何复合培养基。
  4. 液体萌发菌培养物的培养
    1. 向8孔腔载玻片的每个孔中加入190 µL液体培养基。
    2. 加入10 µL浓度为1 × 107 个细胞/mL的孢子悬液（按步骤1.4.1–1.4.3制备），并通过轻柔吹打数次混匀。最终每孔细胞总数为1 × 105 个。
    3. 根据拟研究的发育阶段进行实验培养。例如，T. atroviride 野生型在马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）中于25 °C避光培养5–6小时可形成分生孢子萌发菌，而 N. crassa 野生型在液体VMM中于30 °C避光培养3–4小时后即可形成分生孢子萌发菌。

2. 染料工作液的配制

  1. 为确保每种染料完全溶解，按适当用量（见表1中的精确质量）将染料加入1 mL 100%二甲基亚砜（DMSO）中，配制成2 mM的储备液，并通过涡旋充分混匀。
    注意：务必从带有隔膜密封的瓶中取用DMSO；其应为澄清透明的液体。DMSO接触空气后会变为棕色——可能是由于痕量杂质被氧化所致——可能对细胞生长或染料染色产生不利影响。
  2. 使用0.2 µm注射器滤膜将储备液过滤除菌，收集至新的无菌1.5 mL离心管中。为减少染料褪色，用铝箔包裹离心管。
    备注：染料储备液可分装成小份保存，以避免反复冻融，并可在4 °C下保存数月。
  3. 在新的无菌1.5 mL离心管中，将2 µL染料储备液溶于198 µL无菌蒸馏水中，配制成20 µM的染料工作液。为减少染料褪色，用铝箔包裹离心管。
    备注：染料工作液应在实验当天新鲜配制。
  4. 在样品封片过程中（见第3节），染料工作液通常按1:10比例稀释，最终染料浓度为2 µM，DMSO终浓度为0.1%（w/v）。
    备注：通过简单调整染料工作液与封片液的体积比，选择不同的稀释倍数，可方便地调节所需的最终染料浓度。
    注意：为防止染料或DMSO毒性带来的非预期效应，稀释倍数不应低于1:4，以确保染料终浓度不超过5 µM、DMSO终浓度不超过0.4%（w/v）。过高的染料浓度会迅速导致系统饱和，影响信号定量的可靠性；而DMSO浓度超过0.5%（w/v）（≥ 62.5 mM）则可能干扰细胞发育38。

3. 显微镜观察的样品制备

  1. 采用倒置琼脂块法固定真菌菌落（步骤1.2）或固体菌丝萌发培养物（步骤1.3）的样品。
    1. 准备一片洁净的24 mm × 60 mm玻璃盖玻片（#1，厚度为0.13–0.16 mm），并在其中心加入18 µL液体基本培养基（VMM或M9）或生理盐溶液。
    2. 向18 µL液体中加入2 µL的20 µM染料工作液，通过反复吹吸数次充分混匀，注意避免产生气泡。
      注意：当处理多个样品时，建议预先配制染料与液体的混合母液，以确保整个实验中染料浓度一致。
    3. 使用洁净的解剖刀从菌落或固体萌发培养物边缘切取一块15 mm × 15 mm的样品，并将其垂直放置在盖玻片上的液滴旁。
    4. 用解剖刀支撑琼脂块上缘，同时用手指固定其背面，缓慢将带有菌丝或萌发体的一侧降至液体表面。此时样品已准备好转移至显微镜载物台。
      警告：此操作必须缓慢且极其小心，以尽量减少对细胞的机械应力，并防止样品与盖玻片之间夹入气泡。
  2. 固定步骤1.4中获得的液体萌发培养物。
    注意：最便捷的方式是将含有液体萌发培养物的多孔载玻片直接转移至显微镜载物台上进行后续操作。
    1. 将22 µL染料工作液加入200 µL液体培养基中，使最终染料浓度为2 µM，DMSO浓度为0.1% w/v。
      注意：液体萌发培养物的一大优势在于，可在实验任意时间点（包括成像过程中）添加荧光染料或其他化学物质（如抑制剂）。此时需特别注意缓慢加入液体，以免扰动细胞。系统振动和布朗运动本身可能已引起一定程度的细胞移动。

4. 活细胞显微镜观察

  1. 调整基本的图像采集设置。以下图像采集设置可用于捕获单个菌丝中的染色动态，适用于接下来的两种检测方法：
    1. 使用设备最大输出功率的20%中的5–10%作为激光功率。
    2. 使用数值孔径 ≥ 1.2 的60x–63x甘油或水浸Plan Apo物镜。
    3. 通过将图像尺寸设置为1024 x 256像素，并使用2–3倍的光学变焦，将图像采集区域限制在菌丝轮廓范围内。
    4. 采用400 Hz的双向扫描模式，针孔大小调整为1个艾里单位（Airy unit）。
    5. 将最灵敏检测器的增益设为100%。
    6. 进行延时成像时，以每15秒采集一帧的速度开始图像采集，以在避免染料漂白或光毒性的同时获得合理的时序分辨率。
    7. 进行三维成像时，将空间上下限设定为菌丝边界，并以1 µm的间隔设置光学切片，以获得合理的空间分辨率。
      注意：由于菌丝生长迅速，通常需在Z轴的高空间分辨率与X/Y轴的高时间分辨率之间权衡取舍。只有非常新型的共聚焦激光扫描显微镜才能同时满足这两方面的需求。
  2. 内吞作用摄取检测
    1. 参考图1和Table 1，确定显微镜系统上适用于FM 1-43和/或FM 4-64的最佳激发/发射参数，并相应调整。
      注意：在推荐的2 µM浓度下，FM染料在正常健康细胞的质膜中的掺入是瞬时的。从初始质膜染色到染料出现在管状液泡中的整个过程，通常在室温下30–45分钟内完成。提高FM染料浓度可增加信噪比（S/N-ratio），从而更快获得高对比度图像。然而，这也会加快标记过程，使得细胞器染色的时间顺序更难区分。
    2. 使用上述推荐的基本图像采集设置开始图像记录，并评估结果。
    3. 根据实验所关注的质膜或内吞动态的具体需求，优化图像采集的空间和时间分辨率。
    4. 例如，为捕捉X/Y方向的极快动态，可减小整体图像尺寸，仅采集一个焦平面，并将扫描速率提高至每秒1帧（1 fps）。若需提高Z轴分辨率，则可降低X/Y方向的分辨率，减小图像尺寸，并将光学切片间距减小至0.5 µm。
  3. 细胞壁动态检测
    1. 参考图4和Table 1，确定显微镜系统上所用细胞壁染料的最佳激发/发射参数，并相应调整。
      注意：由于CFW和SPF的发射光谱较宽，它们不太适合与其他荧光染料（尤其是GFP）同时共聚焦成像。即使在顺序成像中，这些染料也存在一定的限制，因此必须针对具体实验条件进行单独优化。
    2. 使用上述推荐的基本图像采集设置开始图像记录，并评估结果。
      注意：在推荐的2 µM浓度下，染料掺入细胞壁的过程不一定瞬时完成，但速度合理。例如，隔膜形成的整个过程在室温下平均约需5–7分钟20。提高细胞壁染料浓度可增加信噪比，从而更快获得高对比度图像。然而，这也会因诱导细胞壁损伤修复而迅速引入伪影。
    3. 根据第4.2.3节所述，针对实验所关注的细胞壁形态发生过程，优化图像采集的空间和时间分辨率。

结果

定量图像分析
除了“仅仅”可视化细胞过程外，活细胞成像还能够从记录的数据中提取定量信息。通常，定量图像分析是一个复杂的话题，其深入讨论远超本文范围，因此建议读者参考专门的教科书和文献39,40,41。尽管如此，本文仍提供与以下示例数据相关的一些基本指导原则。为实现图像的定量分析，必须满足若干关键前提条件，包括：（1）所有样品必须使用定义明确的荧光染料摩尔浓度，以实现准确的相对比较；（2）图像采集参数必须调整至发射光检测器永不饱和的程度，否则最大强度信号将被截断；（3）在同一系列连贯实验过程中，图像采集参数必须保持恒定，否则会引入人为的强度变化；（4）图像数据必须以无信息损失的文件格式保存，并附带包含所有仪器设置的元信息；（5）图像分析应尽可能减少后期处理步骤，仅保留提取所需定量信息所必需的最少操作。

通常，在活细胞中并不存在可用于记录信号绝对定量的明确定义标准。因此，最简单的定量图像分析依赖于在同一幅图像内或在相同设置下采集的不同图像之间进行像素强度的相对比较。显微镜制造商提供的显微镜控制软件通常包含用于图像后期处理和定量分析的基本工具，或可通过附加功能进行升级，以实现图像分割、阈值设定、比率成像等操作。目前已有多个开源图像处理平台可供选择，这些平台适用于不同类型的成像数据，包括 ImageJ（https://imagej.net；https://imagej.nih.gov/ij/）、icy（http://icy.bioimageanalysis.org/）、CMEIAS Bioimage Informatics（http://cme.msu.edu/cmeias/）和 Wimasis（https://www.wimasis.com/en/）。

所示例的数据使用 ImageJ 平台进行处理和分析。简言之，利用较大面积的选择工具标记细胞中的特定区域（如菌丝尖端顶点或隔膜），并通过软件内置的“测量工具”读取所选区域内所有像素的强度值。对照组与实验样本的强度数据被导入电子表格文件，经数学分析后绘制成图表。更多细节可参见所引用的原始文献。

示例数据 1：FM 4-64 吸收实验
真菌样品以菌落形式培养（步骤 1.2），并通过倒置琼脂块法进行封片（步骤 3.1）。FM 4-64 的终浓度为 1.67 µM。成像设置：使用倒置共聚焦激光扫描显微镜（参见材料表）配备 HCX PL APO 63x/1.3 NA 甘油浸没物镜；FM 4-64 激发波长为 488 nm，发射波长为 600–700 nm；每分钟采集一帧，持续最多 150 分钟。FM 4-64 吸收实验揭示了T. atroviride中真菌特异性 Sur7 家族蛋白 2（Sfp2）的基因敲除和基因过表达突变体在内吞作用时空组织上的缺陷9（图 5）。

示例数据 2：靶向内吞区室的荧光融合蛋白与 FM 4-64 的共染色
真菌样品以菌落形式培养（步骤 1.2），并采用倒置琼脂块法进行封片（步骤 3.1）。FM 4-64 的终浓度为 2 µM。成像条件：使用倒置共聚焦激光扫描显微镜（参见材料表）配备 CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC 水浸物镜；GFP 激发波长为 488 nm，发射波长为 500–530 nm；FM 4-64 激发波长为 488 nm，发射波长为 600–700 nm；明场成像使用透射光探测器，以上信号同时采集；每 15 秒采集一帧，持续最长 15 分钟。通过 FM4-64 共染色，将两种增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的跨膜蛋白 Sfp2 和 Gpr1 在 T. atroviride 中的亚细胞分布与内吞途径进行关联分析（图 6、视频 3、视频 4）。

示例数据 3：FM 4-64 共染色用于鉴定形态发生差异
真菌样品以菌落形式培养（步骤 1.2），并通过倒置琼脂块法进行封片（步骤 3.1）。FM 4-64 的终浓度为 2 µM。成像设置：使用倒置共聚焦激光扫描显微镜（见材料表）配备 Plan Apochromat 63x/1.4 NA 油镜；GFP 激发波长为 488 nm，发射波长为 505–550 nm；FM 4-64 激发波长为 488 nm，发射波长为 574–691 nm；明场成像使用透射光探测器；以上通道同时采集，每 8.5 秒获取一帧图像，持续最长 15 分钟。FM 4-64 共染色可将荧光标记的 BUD-6 极性体复合物蛋白的亚细胞定位动态与依赖内体运输的过程（如隔膜形成和极性菌丝尖端生长）相关联，并可用于表征野生型与N. crassa突变株之间在亚细胞结构组织及菌丝形态结构上的差异（图 7，视频 5）。

示例数据 4：细胞壁染色揭示形态发生差异
真菌样品以菌落形式培养（步骤 1.2），并通过倒置琼脂块法进行封片（步骤 3.1）。所用染料终浓度分别为 2 µM CFW、20 µM SPF 和 100 µM CR。成像条件：使用倒置共聚焦激光扫描显微镜（参见材料表）配备 CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC 水浸物镜；CFW 和 SPF 的激发波长为 405 nm，发射波长为 430–470 nm；CR 的激发波长为 543 nm，发射波长为 580–620 nm。CFW、SPF 和 CR 与细胞壁多聚物之间不同的相互作用特性，凸显了 Δsfp2 突变株与T. atroviride野生型菌株之间的形态发生差异9。相较于野生型，突变株在较高染料浓度引起的细胞壁胁迫下，表现出更快且更明显的反应。此外，利用相同的图像还可对两种菌株的菌丝直径和隔膜间距等形态发生差异进行量化分析（图 8）。

示例数据 5：细胞壁生物合成的实时监测
在 8 孔腔室载玻片（步骤 3.2）中以液体培养方式（步骤 1.4）培养萌发菌丝。CFW 的终浓度为 0.12 µM。成像设置：倒置共聚焦激光扫描显微镜配备 CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC 水浸物镜；CFW 激发波长为 405 nm，发射波长为 420–470 nm；每 20 秒采集一帧，持续最长 35 分钟。极低的 CFW 浓度可防止染料分子对细胞壁的饱和，从而实现细胞壁生物合成的定量实时监测。结果表明，新细胞壁物质的沉积并非均匀分布，而是会迅速响应局部物理应力，这种应力源于 N. crassa 萌发菌丝融合前细胞与细胞附着时的相对位移（图 9，影片 6）。

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图1：FM染料的生物化学与生物物理特性。 （A）FM 1-43/SynaptoGreen C4 与 FM 4-64/SynaptoRed C2 的化学结构。（B）两种 FM 染料的吸收与发射光谱，叠加了在丝状真菌中对膜结合染料进行成像的最佳设置：使用 445–495 nm 蓝光激发时，对 FM 1-43 的激发效率为 100–80%，而使用氩离子激光器的 488 nm 激光激发时，效率为 91%。由于染料在结合膜后发生蓝移（*），FM 1-43 发射光的最佳检测范围为 520–590 nm。类似地，在真菌中对 FM 4-64 成像的最佳设置为：使用多色激发光源时，激发波长为 471–541 nm（效率 100–80%），或使用氩离子激光器 514 nm（效率 99%）；发射光检测范围为 650–750 nm。请点击此处查看该图的高清版本。

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图2：FM 1-43 与 FM 4-64 的同时共成像。 将两种染料的等摩尔混合物加入到 N. crassa 的液体菌丝培养物中，终浓度为 10 µM。染料加入后 25 分钟，FM 1-43 已标记质膜，并在内部膜结构中积累，包括线粒体（m）着色强烈，但液泡膜（v）基本未被染色，其平均荧光强度是 FM 4-64 的八倍以上（分别为 176 和 21）。由于 FM 4-64 疏水性较低/亲水性较高，其内化速率较慢，导致其在质膜上停留时间更长。比例尺 = 10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：细胞壁胁迫诱导细胞壁多糖在菌丝顶端沉积，常伴随细胞自溶现象。 表达细胞质GFP的T. atroviride菌丝用10 µM Solophenyl Flavine 7GFE 500（SPF）染色后立即进行显微观察。图中显示未受胁迫的菌丝（a）、顶端葡聚糖/几丁质沉积略有增加并出现进展性自溶的受胁迫菌丝（b），以及严重受胁迫的菌丝，其顶端具有明显的葡聚糖/几丁质帽（星号），并出现终末期自溶现象（c），表现为GFP荧光完全丧失及显著的液泡化。比例尺 = 10 µm。完整的时间序列请参见视频1。请注意，这三个菌丝实际上彼此相邻。请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：细胞壁选择性染料的生物化学与生物物理特性。 所示化学结构为各染料的钠盐形式。吸收光谱与发射光谱对应于细胞环境中的实际表现。图中标注的单色激光激发线（以彩色标注）以及适用于落射荧光显微镜的多色激发范围和发射光检测范围，均为在丝状真菌中成像时推荐使用的参数。当两种激光激发线效果相近时，均予以标出。(*) PFS 与细胞壁结合后的发射光谱相较于先前报道显著红移33，因此可在更低染料浓度下获得良好的信噪比。目前尚无刚果红（CR）的完整光谱数据，故以最接近的尼罗红（CAS No: 7385-67-3）光谱作为参考。有关 CR 光谱特性的详细信息可参见其他文献42。请点击此处查看此图的放大版本。

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图5：Sfp2对FM4-64内吞作用的影响。 在野生型（wt）中，FM染料摄取的三个连续关键阶段很容易区分。阶段I：仅质膜染色；阶段II：FM染料首次出现在内吞囊泡中；阶段III：仅内吞囊泡和内膜系统被染色。等效染色模式显示为其首次出现的最早时间点。与绿色木霉（T. atroviride）野生型相比，sfp2过表达突变体（OEsfp2）的内吞作用略有加快，而sfp2缺失突变体（Δsfp2）的染料摄取则显著延迟。例如，OEsfp2中染料进入质膜的过程即时发生，而在野生型中需要2分钟；FM染料从质膜完全内化的过程在OEsfp2中比Δsfp2快10倍。比例尺 = 5 μm。该图根据Creative Commons许可证（https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/）转载自Atanasova等人的研究9。请点击此处查看此图的放大版本。

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图6：T. atroviride中EGFP标记的膜蛋白与FM 4-64共染色有助于区分不同的亚细胞定位动态。 （A）四次跨膜结构域蛋白Sfp2与FM4-64标记的细胞器共定位，包括质膜和隔膜、顶体（Spk；箭头）以及可能的管状液泡。（B）类G蛋白偶联受体（GPCR）的七次跨膜蛋白Gpr1与FM4-64在与Sfp2相同的细胞器上共定位，但顶体除外。比例尺，10 µm。完整的时间序列见视频3和视频4。该图已根据Atanasova等人的研究9修改，并符合知识共享许可协议。请点击此处查看此图的放大版本。

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图7：FM 4-64 染色可区分 Δbud-6 突变株与野生型，并显示 BUD-6 在隔膜环处的定位。 (A) N. crassa 野生型菌丝的 FM 4-64 染色结果（箭头指示隔膜；箭头指示 Spitzenkörper，Spk）。(B) ∆bud-6 突变株中缺失隔膜和 Spk。比例尺，50 µm。(C 和 D) 野生型（C）和 ∆bud-6（D）菌丝顶端及亚顶端区域的放大图像。Spk（箭头）在野生型中形成，但在 ∆bud-6 中未形成。方括号指示在 ∆bud-6 中未能建立的核排除区。比例尺 = 5 µm。(E) BUD-6-GFP 在质膜内陷（箭头）之前即被招募至即将形成的隔膜位点，并伴随隔膜收缩。比例尺 = 5 µm。完整的时间序列请参见 视频5a 和 视频5b。本图经 Lichius 等人16 修改后重印，符合知识共享许可协议。 请点击此处查看此图的高清版本。

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图8：缺失 sfp2 改变细胞壁物质的沉积模式，并影响菌丝形态发生 T. atroviride (ACFW 和 SPF 染色显示细胞壁沉积增加 Δsfp2 （箭头）与野生型（wt）相比。CR 染色仅在顶端引起广泛的肿胀 Δsfp2 （箭头）。比例尺 = 10 µm. (B形态发生缺陷 Δsfp2 包括显著减小的间隔距离（Δsfp2 = 26.0 µm，野生型 = 85 µm；n = 60；ANOVA Pr < 2−16）以及更小的菌丝直径（∆sfp2 = 5.6 µm，野生型 = 12.6 µm；n = 100；ANOVA Pr < 2−16). (C) 与亚顶端相比，顶端尖部的染料荧光增强。比例尺 = 5 µm. (DC）的强度编码三维表面图。E相对荧光强度的定量分析 Δsfp2 以及野生型（n = 55）。该图已转载自 Atanasova 等人。9 与知识共享许可协议一致。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图9：细胞壁生物合成的实时监测。 (A) N. crassa 菌丝萌发管（CAT）在萌发孢子之间的融合过程。萌发孢子的扭矩响应（21–28 分钟）表明两者已发生物理接触。强度以颜色编码的CFW荧光显示细胞壁沉积较少（深蓝色）和较强（黄色）的区域。最初未染色的趋触尖端（箭头所示），在顶端接触后开始沉积新的细胞壁物质，并在承受最大物理应力的区域（箭头）出现沉积。比例尺 = 5 μm。完整的时间序列请参见视频6。本图经许可转载自38。(B) A图的投影，标示出用于测量荧光强度的四个圆形区域。比例尺 = 5 μm。(C) 各区域荧光强度变化曲线，显示在物理应力作用下局部细胞壁生物合成迅速增强（CAT 1，箭头所示）。在菌丝管（GT）和孢子体（分生孢子）中，细胞壁生物合成呈稳定上升趋势。请点击此处查看该图的放大版本。

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视频 1：染料诱导的细胞壁应激。 向表达细胞质 GFP（品红色）的T. atroviride菌丝中加入 10 µM SPF（青色）。菌丝顶端立即出现强烈的染色，随后在 2 分钟内菌丝区室迅速发生裂解；表现为 GFP 荧光的消失。请点击此处下载该视频。

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视频 2：活体 SPF 染色。 2 µM SPF（青色）可在不引起菌丝尖端细胞壁应激伪影的情况下，以高空间和时间分辨率追踪 T. atroviride 菌丝的顶端生长。 请点击此处下载该视频。

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视频 3：Sfp2-GFP 的 FM 4-64 共染色。 对表达 Sfp2-mEGFP（绿色）的 T. atroviride 用 1.67 µM FM 4-64（红色）进行共染色，揭示了膜蛋白与内吞途径在定位上的重叠与差异。请点击此处下载该视频。

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视频 4：Gpr1-GFP 的 FM 4-64 共染色。 对表达 Gpr1-mEGFP（绿色）的 T. atroviride 用 1.67 µM FM 4-64（红色）进行共染色，显示了膜蛋白在内吞途径中的重叠与特异性定位。请点击此处下载该视频。

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视频 5：FM 4-64 与 BUD-6-GFP 的共染色。 （5a）利用 2 µM FM 4-64（红色）对表达 BUD-6-GFP（绿色）的 N. crassa 进行共染色，可追踪 BUD-6 在隔膜形成过程中相对于相应质膜内陷的动态变化。（5b）（5a）的裁剪与合并图像。请点击此处下载视频 5a
请点击此处下载视频 5b。

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视频 6：细胞壁生物合成的实时监测。 表达 MAK-1-GFP（绿色）的 N. crassa 菌丝萌发细胞经 0.12 µM CFW（蓝色）共染色，以显示 CAT 介导的菌丝萌发细胞融合过程中细胞壁的局部生成。需要注意的是，CFW 信号在 GFP 通道中存在一定程度的串色，表明 SPF 或 CR 分别是用于 GFP 的顺序和同步共成像时更优的染料选择。 请点击此处下载该视频。

表1：膜和细胞壁选择性荧光染料的性质。 * = mg/mL 数值已根据染料纯度/染料含量的降低进行校正，以使所有溶液达到等摩尔浓度；n.i.a. = 无可用信息。 请点击此处下载该表格。

讨论

本文延续了21世纪初开创性研究的工作，该研究确立了多种荧光染料作为丝状真菌活体细胞器标记物的应用2,4,43，并尝试比以往更详细地探讨FM染料及部分细胞壁染料的光物理性质和细胞生物学特性，尤其关注在染料浓度超过一定阈值时可能引发的非预期细胞效应，例如膜饱和或细胞壁损伤。过去在细胞水平上被认为无毒的染料浓度，如今在分子水平上已被视为具有毒性。尽管这些效应可能非常微弱，且不会直接表现为细胞器或细胞行为的明显改变，但为了准确研究分子的天然功能，必须尽可能减少染料应用除可视化以外的任何潜在干扰。幸运的是，现代探测器（如硅雪崩光电二极管探测器（Si-APDs）44 或Airyscan面阵探测器45）灵敏度和量子效率的提升，使得染料用量可进一步降低。本文另一关键目标是示范这些染料与其他荧光探针（尤其是生物学中最常用的荧光蛋白GFP）共标记成像的特性，以帮助设计成像实验，用于关联分析荧光融合蛋白的亚细胞定位动态与真菌细胞壁、质膜以及内吞与外排途径等之间的关系。

在自然且无应激的条件下成像，是获取可靠数据的关键。关于培养基和样品制备的一些实际考虑，旨在为寻找最佳条件提供一个起点，以实现对健康、无应激细胞进行无伪影、长时间的观察，并在给定样品条件下尽可能获得最高的信噪比。目前尚无通用方法可实现可靠且有意义的成像结果。该方法本身具有如下特性：样品的生物学变异、显微镜操作者的主观判断与预期，以及图像的后期处理，分别对数据采集和解释产生显著影响。因此，显微镜操作者的实践经验、其对所研究真菌细胞生物学的深入了解，以及熟练的样品制备技术，以在实验室环境中尽可能创造“自然”且不受干扰的条件，对于获取和评估真实反映所研究细胞现象的成像数据至关重要。一般而言，只有通过使用低浓度染料（≤2 µM），才能有效避免荧光染料带来的不良副作用，这些副作用范围广泛，从轻微且不易察觉的质膜或细胞壁重塑应激通路的激活，到直接导致细胞自溶的细胞毒性效应。

荧光染料的应用方法简单，但其特异性尚未得到充分表征。使用荧光染料的一个主要优势在于实验方案的制备过程简便。真菌的培养与取样、染料的添加以及载玻片上的制片等步骤（经过练习后）均易于操作。基本成像参数的调整，包括激发和发射波长、曝光时间、时间序列设置等，遵循显微镜的简单生物物理规则以及荧光染料在细胞内的生物学特性。表1旨在帮助研究人员选择最适合实验的染料或染料组合。此外，荧光染料价格合理，易于获取，且质量稳定可靠，因而可确保高度可重复的应用效果。

使用膜或细胞壁选择性荧光染料的两个主要限制在于，通常对其精确染色特性的了解有限，大多数情况下在细胞器和分子水平上缺乏特异性，以及其浓度依赖性的非预期副作用。FM 染料特异性地标记参与内吞和外排作用的脂双层结构。然而，在特定实验条件下，哪些亚细胞器相继被标记尚不明确，需通过比较不同 FM 染料变体并结合其他细胞器特异性标记物进行共标记分析才能确定。例如，FM 1-43 相较于 FM 4-64 更倾向于标记线粒体膜。细胞壁选择性染料对真菌细胞壁的三种主要多糖成分具有不同的特异性。CFW 被认为是非特异性地结合 β-葡聚糖和几丁质，SPF 被认为对 β-1,4-葡聚糖最具选择性，而 CR 则被认为高度特异性地识别 α-和 β-几丁质。目前尚无关于 PFS 与真菌细胞壁多糖结合特异性的公开信息。在特定真菌物种中，给定染料浓度下何种真菌细胞壁多糖成分被最有效标记的问题尚无明确答案，且必须谨慎考虑将其他生物或真菌物种中体外或体内获得的详细测量数据推广应用。遗憾的是，相关文献中此类信息极为稀少且分散35，42，46。目前尚无更新的研究在先前工作33基础上，提供关于这些染料在真菌中特异性染色性质的新见解。

成像对照对于准确评估染色模式和细胞反应至关重要。然而，最具挑战性的部分可能是充分了解真菌的细胞生物学特性，以便能够明确且可靠地将膜和细胞壁特异性荧光染料的亚细胞定位变化、细胞结构的改变或菌丝生长模式的变化，归因于实验处理的预期效应。为此，在开展任何新的活细胞成像实验时，设置良好的对照极为关键。这些对照包括未经处理的野生型样本，作为阴性成像对照，用以排除图像中背景自发荧光和探测器噪声的干扰，并在研究突变体时提供形态学比较基准。此外，阳性成像对照也必不可少，例如表达细胞质GFP或RFP，或其他已知荧光标记蛋白的菌株，可用于将激发光强度调节至所需最低水平，同时作为细胞活力的对照。一旦建立这些对照，荧光染料的使用便不仅限于可视化目的，其浓度依赖性的染色动力学以及浓度依赖性的副作用亦可被系统分析利用；例如，用于实时定量监测细胞壁生物合成过程，或在敏感性检测中识别突变体特异性表型47。

更优的未来应用依赖于对染料染色特性的详细功能分析。当前面临的主要挑战是进一步改进并实现定量图像分析的自动化，以推动对丝状真菌中膜和细胞壁特异性荧光染料亚细胞动态的功能评估。为此，首先需要开展大量定量的共定位研究，将这些染料与已知的细胞器及细胞壁多糖标记物进行共染，并结合在特定转运通路中存在缺陷或缺失特定结构组分的突变菌株进行分析。目前已有多种可用于与FM染料进行比较分析的内吞作用标记物48,49；鉴于真菌细胞壁染料的结合特异性迄今仍 poorly characterized（特征尚不明确），使用荧光标记的葡聚糖特异性抗体50可能是解决该问题的一种可行方案。

披露

作者声明不存在竞争性财务利益，也无任何需要披露的内容。

致谢

感谢蒂罗尔科学基金（TWF）向 AL 提供的 #256524 号资助，维也纳科学与技术基金（WWTF）向 SZ 提供的 #LS13-086 号资助，以及因斯布鲁克大学出版基金对开放获取出版的支持。作者还感谢因斯布鲁克大学动物学系提供 Leica TCS SP5 II 共聚焦激光扫描显微镜。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BRAND 细胞计数板MerckBR718005Thoma 规格
Calcofluor White M2RMerck/Sigma-AldrichF3543细胞壁染料
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WINikonMRD07602水浸物镜
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WINikonMRD07602水浸物镜
刚果红Merck/Sigma-AldrichC6277细胞壁染料
二甲基亚砜VWR8,36,73,230有机溶剂
Eclipse TE2000-E 配 C1 扫描单元Nikoncustom configuration倒置激光扫描共聚焦显微镜，用于获取示例数据 2 和 4
Eclipse TE2000-U 配 Bio-Rad Radiance 2100 扫描单元Nikoncustom configuration倒置激光扫描共聚焦显微镜，用于获取示例数据 5
FM 1-43Merck/Sigma-AldrichS6814膜染料
FM 4-64Merck/Sigma-AldrichS6689膜染料
玻璃珠Rettberg13406910303 mm 玻璃珠
盖玻片Thermo Fisher ScientificBB02400600A113MNT024 × 60 #1 玻璃盖玻片
HCX PL APO 63x/1.3 NA GlycLeica15506353甘油浸没物镜
LSM 510 MetaZeisscustom configuration倒置激光扫描共聚焦显微镜，用于获取示例数据 3
M9 最小培养基Merck/Sigma-AldrichM6030通用真菌培养基
8 孔显微载片ibidi80826ibiTreat #1.5 聚合物盖玻片
MiraclothMerck/Millipore475855-1R聚酯过滤材料
培养皿Sarstedt8,21,47292 × 16 mm 培养皿（无卡扣）
PhytagelMerck/Sigma-AldrichP8169透明凝胶剂
Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DICZeiss440762-9904-000油浸物镜
Pontamine Fast Scarlet 4BMerck/Sigma-Aldrich212490细胞壁染料
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）BD Difco213400T. atroviride 的真菌培养基
马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）BD Difco254920T. atroviride 的真菌培养基
反应管Sarstedt72,7061.5 mL SafeSeal 管
手术刀B.Braun5518016Cutfix 无菌手术刀 #23
螺帽管Sarstedt6,25,54,50215 mL 聚丙烯管
Solophenyl Flavine 7GFE 500CIBA1485385V6细胞壁染料
SynaptoGreen C4Biotum70020膜染料
SynaptoRed C2Biotum70021膜染料
注射器膜过滤器Thermo Fisher Scientific723-99450.45 µm SFCA 注射器滤器
TCS SP5 IILeicacustom configuration倒置激光扫描共聚焦显微镜，用于获取示例数据 1
Vogel 最小培养基（VMM）FGSCFungal Genetics Stock CentreN. crassa 的真菌培养基

参考文献

  1. Read, N. D., Fischer, S., Parton, R. M. Imaging Spitzenkörper, pH and calcium dynamics in growing fungal hyphae. Pesticide Science. 54 (2), 179-181 (1998).
  2. Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell imaging of filamentous fungi using vital fluorescent dyes and confocal microscopy. Microbial Imaging. , Elsevier. 63-87 (2004).
  3. Jelínková, A., et al. Probing plant membranes with FM dyes: tracking, dragging or blocking. The Plant Journal. 61 (5), 883-892 (2010).
  4. Fischer-Parton, S., et al. Confocal microscopy of FM4-64 as a tool for analysing endocytosis and vesicle trafficking in living fungal hyphae. Journal of Microscopy. 198 (3), 246-259 (2000).
  5. Harris, S. D. Branching of fungal hyphae: regulation, mechanisms and comparison with other branching systems. Mycologia. 100 (6), 823-832 (2008).
  6. Roca, M. G., Arlt, J., Jeffree, C. E., Read, N. D. Cell biology of conidial anastomosis tubes in Neurospora crassa. Eukaryotic Cell. 4 (5), 911-919 (2005).
  7. Becker, Y., et al. The fungal cell-wall integrity MAPK cascade is crucial for hyphal network formation and maintenance of restrictive growth of Epichloë festucae in symbiosis with Lolium perenne. Molecular Plant-Microbe Interactions. 28 (1), 69-85 (2015).
  8. Justa-Schuch, D., Heilig, Y., Richthammer, C., Seiler, S. Septum formation is regulated by the RHO4-specific exchange factors BUD3 and RGF3 and by the landmark protein BUD4 in Neurospora crassa. Molecular Microbiology. 76 (1), 220-235 (2010).
  9. Atanasova, L., et al. The Gpr1-regulated Sur7 family protein Sfp2 is required for hyphal growth and cell wall stability in the mycoparasite Trichoderma atroviride. Scientific Reports. 8 (1), 12064(2018).
  10. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 12 (2), 363-375 (1992).
  11. Wu, Y., Yeh, F. L., Mao, F., Chapman, E. R. Biophysical characterization of styryl dye-membrane interactions. Biophysical Journal. 97 (1), 101-109 (2009).
  12. Betz, W. J., Mao, F., B, S. C. Imaging exocytosis and endocytosis. Current Opinion in Neurobiology. 6, 365-371 (1996).
  13. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 77-83 (2012).
  14. Bolte, S., et al. FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells. Journal of Microscopy. 214, Pt 2 159-173 (2004).
  15. Riquelme, M., et al. Spitzenkorper localization and intracellular traffic of green fluorescent protein-labeled CHS-3 and CHS-6 chitin synthases in living hyphae of Neurospora crassa. Eukayotic Cell. 6 (10), 1853-1864 (2007).
  16. Lichius, A., Yáñez-Gutiérrez, M. E., Read, N. D., Castro-Longoria, E. Comparative live-cell imaging analyses of SPA-2, BUD-6 and BNI-1 in Neurospora crassa reveal novel features of the filamentous fungal polarisome. PloS one. 7 (1), 30372(2012).
  17. Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
  18. Dijksterhuis, J., Molenaar, D. Vesicle trafficking via the Spitzenkörper during hyphal tip growth in Rhizoctonia solani. Antonie van Leeuwenhoek. 103 (4), 921-931 (2013).
  19. Hickey, P. C., Read, N. D. Imaging living cells of Aspergillus in vitro. Medical Mycology. 47, 110-119 (2009).
  20. Delgado-Álvarez, D. L., Bartnicki-García, S., Seiler, S., Mouriño-Pérez, R. R. Septum development in Neurospora crassa: the septal actomyosin tangle. PLoS One. 9 (5), 96744(2014).
  21. Hageage, G. J., Harrington, B. J. Use of Calcofluor White in clinical mycology. Laboratory Medicine. 15 (2), 109-112 (1984).
  22. Monheit, J. E., Cowan, D. F., Moore, D. G. Rapid detection of fungi in tissues using Calcofluor White and fluorescence microscopy. Archives of Pathology and Laboratory. 108 (8), 616-618 (1984).
  23. Herth, W., Schnepf, E. The fluorochrome Calcofluor White binds oriented to structural polysaccharide fibrils. Protoplasma. 105 (1-2), 129-133 (1980).
  24. Elorza, M. V., Rico, H., Sentandreu, R. Calcofluor White alters the assembly of chitin fibrils in Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans cells. Journal of General Microbiology. 129 (5), 1577-1582 (1983).
  25. Lagorce, A., et al. Genome-wide analysis of the response to cell wall mutations in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 20345-20357 (2003).
  26. Sanz, A. B., García, R., Rodríguez-Peña, J. M., Arroyo, J. The CWI Pathway: regulation of the transcriptional adaptive response to cell wall stress in yeast. Journal of Fungi. 4 (1), (2017).
  27. Slifkin, M., Cumbie, R. Congo Red as a fluorochrome for the rapid detection of fungi. Journal of Clinical Microbiology. 26 (5), 827-830 (1988).
  28. Michels, J., Büntzow, M. Assessment of Congo Red as a fluorescence marker for the exoskeleton of small crustaceans and the cuticle of polychaetes. Journal of Microscopy. 238 (2), 95-101 (2010).
  29. Pancaldi, S., Poli, F., Dall'Olio, G., Vannini, G. L. Morphological anomalies induced by Congo Red in Aspergillus niger. Archives of Microbiology. 137 (3), 185-187 (1984).
  30. Roncero, C., Durán, A. Effect of Calcofluor White and Congo Red on fungal cell wall morphogenesis: in vivo activation of chitin polymerization. Journal of Bacteriology. 163 (3), 1180-1185 (1985).
  31. Kopeck, M., Gabriel, M. The influence of Congo Red on the cell wall and (1,3)- β-d-glucan microfibril biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Archives of Microbiology. 158 (2), 115-126 (1992).
  32. Heilmann, C. J., et al. Surface stress induces a conserved cell wall stress response in the pathogenic fungus Candida albicans. Eukayotic Cell. 12 (2), 254-264 (2013).
  33. Hoch, H. C., Galvani, C. D., Szarowski, D. H., Turner, J. N. Two new fluorescent dyes applicable for visualization of fungal cell walls. Mycologia. 97 (3), 580-588 (2005).
  34. Liesche, J., Ziomkiewicz, I., Schulz, A. Super-resolution imaging with Pontamine Fast Scarlet 4BS enables direct visualization of cellulose orientation and cell connection architecture in onion epidermis cells. BMC Plant Biology. 13, 226(2013).
  35. Ursache, R., Andersen, T. G., Marhavý, P., Geldner, N. A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components. The Plant Journal. 93 (2), 399-412 (2018).
  36. Knight, N. L., Sutherland, M. W. A rapid differential staining technique for Fusarium pseudograminearum in cereal tissues during crown rot infections. Plant Pathology. 60 (6), 1140-1143 (2011).
  37. Fajardo-Somera, R. A., et al. Dissecting the function of the different chitin synthases in vegetative growth and sexual development in Neurospora crassa. Fungal Genetics and Biology. 75, 30-45 (2015).
  38. Lichius, A. Cell Fusion in Neurospora crassa. , The University of Edinburgh. Edinburgh (UK). Doctor of Philosophy (Ph.D.) (2010).
  39. Chen, W., Li, W., Dong, X., Pei, J. A Review of Biological Image Analysis. Current Bioinformatisc. 13 (4), 337-343 (2018).
  40. Live cell imaging: A laboratory manual. Goldman, R. D., Swedlow, J., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2010).
  41. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature methods. 9 (7), 697-710 (2012).
  42. Zemanek, G., Jagusiak, A., Chłopaś, K., Piekarska, B., Stopa, B. Congo Red fluorescence upon binding to macromolecules - a possible explanation for the enhanced intensity. Bio-Algorithms and Med-Systems. 13 (2), 1187(2017).
  43. Hickey, P. C., Jacobson, D. J., Read, N. D., Louise Glass, N. Live-cell imaging of vegetative hyphal fusion in Neurospora crassa. Fungal Genetics and Biology. 37 (1), 109-119 (2002).
  44. Hamamatsu Si APD - high sensitivity photodiodes having an internal gain mechanism: Avalanche photodiode selection guide 2019. , Available from: https://www.hamamatsu.com/resources/pdf/ssd/si_apd_kapd0001e.pdf (2019).
  45. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, 1205(2015).
  46. Thomas, J., Idris, N. A., Collings, D. A. Pontamine Fast Scarlet 4B bifluorescence and measurements of cellulose microfibril angles. Journal of Microscopy. 268 (1), 13-27 (2017).
  47. Ram, A. F. J., Klis, F. M. Identification of fungal cell wall mutants using susceptibility assays based on Calcofluor White and Congo Red. Nature Protocols. 1 (5), 2253-2256 (2006).
  48. Toshima, J. Y., et al. Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives. Proceedings of the National Academy of Science of the USA. 103 (15), 5793-5798 (2006).
  49. Kilaru, S., Schuster, M., Latz, M., Guo, M., Steinberg, G. Fluorescent markers of the endocytic pathway in Zymoseptoria tritici. Fungal Genetics and Biology. 79, 150-157 (2015).
  50. Fu, C., Tanaka, A., Free, S. J. Neurospora crassa 1,3-α-glucan synthase, AGS-1, is required for cell wall biosynthesis during macroconidia development. Microbiology. 160, Pt 8 1618-1627 (2014).

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FM 1 43 FM 4 64 Calcofluor White

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