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异位肝移植大鼠模型中动脉重建后并发症减少

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DOI：

10.3791/60628

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2020年11月7日

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1Multi-Organ Transplant Program, University Health Network, 2Department of Immunology, University of Toronto, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究的目的是改进大鼠原位肝移植模型，以更好地模拟人类肝移植并提高受体存活率。本方法通过将供体肝脏的肝总动脉与受体肝脏的肝固有动脉相吻合，重建肝脏动脉血流。

摘要

大鼠原位肝移植（OLT）模型是研究急性和慢性排斥反应的有力工具。然而，由于缺乏动脉重建，该模型并不能完全模拟人类肝移植。本文描述了一种经过改良的移植手术方法，其中包含了肝动脉（HA）重建，显著改善了移植效果。通过平均12分14秒的无肝期，肝动脉重建可改善移植肝脏的灌注，并将受体的长期存活率从37.5%提高至88.2%。本方案采用3D打印的套管和固定装置连接门静脉与肝下腔静脉。该模型可用于研究肝移植的多个方面，包括免疫反应、感染以及手术技术相关问题。通过引入一种基于微血管技术的简单且实用的动脉重建方法，这一改良的大鼠OLT方案更贴近人类肝移植的实际过程，将成为一种具有重要价值且与临床密切相关的研究模型。

引言

肝病的全球负担持续增加，2005年至2013年间，与肝病相关的死亡人数上升了30%1,2。对于终末期肝病患者而言，肝移植往往是唯一的治疗手段。肝脏是全球第二常见的实体器官移植类型，2015年至2016年间，全球实施的肝移植手术数量增长了7.25%1,2。尽管肝移植较为普遍，但移植后的生存率已趋于停滞3,4,5。据报道，患者术后15年生存率为53%，而20年生存率可能低至21%3,5。尽管目前已有令人期待的新型免疫生物学研究方向，有望带来新的治疗方法并改善临床预后，但迄今仍缺乏一种可靠的小动物模型用于相关研究的验证。

大鼠OLT模型已广泛用于肝移植相关研究，包括排斥反应6,7,8,9,10、免疫耐受11、移植相关的缺血-再灌注损伤12、免疫抑制13以及胆道系统损伤14,15,16,17。然而，该模型目前形式的一个缺点是术后发病率和死亡率较高18,19。这一严重缺陷与人类临床手术情况不符，且限制了从该模型中得出具有临床相关性的结论的能力20。

此外，这种高发病率很大程度上可归因于肝动脉（HA）吻合的缺失或不完善18。尽管肝动脉吻合是人类肝移植中的关键步骤，但在大鼠OLT模型中，技术上的困难往往导致HA吻合难以实现。其结果是胆管（BD）吻合不稳定，导致胆汁泄漏和胆管坏死的发生率较高21。除了胆道并发症发生率较高外22，缺乏动脉供血还会改变移植后供体肝脏的生理状态23，导致供肝出现缺氧24，以及在炎症肝叶中观察到肝损伤19,25,26。在未进行动脉吻合的大鼠OLT中，还容易促进肝纤维化的发生27。下述大鼠OLT方案通过在先前已发表的大鼠OLT方法中引入一个简单的HA重建步骤，解决了上述问题，从而实现了肝实质的保护并提高了存活率28。

肝移植手术分为三个阶段：（1）从供体中取出肝脏移植物，（2）准备供体肝脏移植物，（3）用肝脏移植物替换受体的肝脏。该手术涉及五个解剖结构的操作：肝上段下腔静脉（SHVC）、门静脉（PV）、肝下段下腔静脉（IHVC）、肝动脉（HA）和胆管（BD）。

大鼠OLT最初由Lee等人引入，采用显微缝合技术吻合SHVC、PV和IHVC，并使用套管牵引法处理BD29。该模型随后于1979年通过双套管技术得到改进30。此后，多种替代技术被提出，其中大多数技术聚焦于静脉吻合，采用双套管技术并进行了若干改良31。尽管既往已有报道在大鼠OLT模型中采用显微缝合、套管法及管腔内袖套等技术进行HA吻合26,31,32,33,34，但这些技术通常需要高度熟练的显微外科操作技能，显著改变大鼠生理状态，且常受到血栓形成和/或胆道并发症的限制27,35。

此外，手术方式的选择还可能影响无肝期（从门静脉阻断到通过重建的门静脉对移植物进行再灌注的时间），而无肝期对于大鼠肝移植的成功至关重要。具体而言，当无肝期为15-20分钟时，可观察到较高的存活率36，而30分钟则是成功移植的上限37,38。因此，本方法的目标是建立一种创伤更小、更易于推广的大鼠原位肝移植（OLT）手术模型，能够重建肝动脉，促进移植肝的有效灌注，维持受体胆管的血流，并保持受体的生理状态。

本文详细描述了该优化方案的全部步骤，包括供体肝脏腹腔干的处理，以及以下技术的应用：1）使用1.5 mm支架与受体肝固有动脉（HA）进行血管外套管吻合；2）连续缝合方式重建SHVC；3）采用两个3D打印塑料套管分别用于门静脉（PV）和肝下腔静脉（IHVC）的重建39,40；4）微血管套管吻合法重建肝动脉（HA）18,27,41；以及5）既往报道的胆道（BD）支架置入技术28。此外还包括两个补充步骤：经门静脉进行冷灌注，以及基于前期研究结果制定的抗生素使用方案17。该优化的原位肝移植（OLT）方案可显著减少围手术期并发症和病患率，更贴近临床人体肝移植手术的实际操作流程。

方案

本研究按照啮齿类动物操作与手术指南进行，研究方案已获大学健康网络动物护理委员会（UHN AUP #: 5840.3）批准，并遵循加拿大动物护理委员会的指导原则。研究使用12至14周龄的雄性Lewis大鼠（品系LEW/SsNHsd），体重在250至300克之间。

1. 仪器设置

  1. 用持针器夹持一个31 G的锐尖针头，通过反复来回弯折针尖直至其折断，制成一个钝头L形注射器。使用扁平金属锉刀将注射器末端锉钝并磨平。
    1. 用手术刀从3D打印底座上切下门静脉（PV）和肝下下腔静脉（IHVC）袖套（补充材料1，补充材料2，图1，补充图1）。
      注：使用3D设计软件设计袖套和夹持器，并采用可高压灭菌树脂在3D打印机上打印（材料表）39,40（所有3D打印材料的规格详见补充材料1-10）。
    2. 使用新的手术刀将22 G导管切成双斜面管（长度为3.5 mm）。用手术刀在胆管（BD）支架表面轻轻刻划若干线条（不要划穿管壁）。这些刻痕可防止结扎线在操作过程中滑脱。
    3. 使用新的手术刀将24 G导管切成单斜面管（长度为2.0 mm），并在新的动脉支架表面制造多个划痕。
      注：避免对胆管支架施加压力，以防管腔狭窄或闭塞。若支架发生狭窄或闭塞，受体将因胆道梗阻而影响存活。

2. 供体手术

  1. 将加热垫设置为 37 °C，并放置在手术平台下方。打开温度监测仪，以便通过直肠探头监测大鼠的核心体温。设置异氟烷麻醉装置。
    注意：手术期间，应通过观察呼吸频率、心率、器官/黏膜的颜色以及是否存在足底回缩反射来监测麻醉深度。
  2. 在手术铺巾的工作区域内准备好所有必要的器械和材料（即剪刀、镊子、纱布、肝素、牵开器、腹部垫、棉签、4-0 丝线、7-0 丝线、8-0 不可吸收无菌缝线和 10-0 不可吸收单股缝线），并将其方便地放置在手术平台两侧。
  3. 在工作台上准备好所有溶液，包括乳酸林格液和 300 IU 的肝素钠（参见材料表）。
  4. 称量动物体重。将供体大鼠放入麻醉舱中，使用 5% 异氟烷、5 L/min 气流和 70% 吸入氧浓度（FiO2）进行诱导麻醉。当大鼠失去意识后，将麻醉浓度降低至 3% 异氟烷、0.5 L/min 气流和 70% FiO2。通过捏压脚趾检查是否无足底反应。
  5. 准备腹部皮肤。使用电动剃毛器去除腹侧的毛发。密切观察供体的呼吸频率，直至其达到稳定且深长的呼吸状态。
    1. 将已铺巾的大鼠仰卧放置，使其腹侧朝上。将鼻部置于麻醉废气吸收装置中，维持 3% 异氟烷、0.5 L/min 气流和 70% FiO2。用聚维酮碘从腹中线向外消毒腹壁，随后使用 70% 乙醇进行脱碘处理。
  6. 使用圆头手术剪从剑突至耻骨联合做一纵行切口，然后通过双侧横向切口扩大暴露视野。使用双极电外科设备对腹壁出血点进行电凝止血。切开后，将维持麻醉的异氟烷浓度降低至 2%、0.5 L/min 气流和 70% FiO2。
    注意：调节异氟烷蒸发器，使呼吸频率维持在约每秒一次，并在整个手术过程中定期评估麻醉深度。
  7. 在剑突处缝合一针 4-0 丝线，并利用该缝线将胸壁向头侧牵拉。将丝线用胶带固定在麻醉废气吸收装置支架的顶部。使用两侧腹部放置的 3D 打印牵开器（见补充材料 3）保持供体大鼠体腔开放（牵开器通过连接在手术平台磁铁上的橡皮筋固定）。
    注意：也可使用蚊式钳夹住剑突并向头侧牵拉。用胶带将蚊式钳固定在适当位置。
  8. 使用浸润乳酸林格液的无纺纱布海绵（4 cm × 4 cm）包裹小肠和大肠。使用一小块湿润的无纺纱布海绵（2 cm × 4 cm）轻轻覆盖肝脏。
  9. 在腹部中段下方放置一小卷纱布，以抬高腹部，改善对肝上段下腔静脉（SHVC）的暴露。
  10. 剪断镰状韧带。使用显微镊子将左膈静脉从 SHVC 分离。使用 7-0 丝线在靠近 SHVC 处结扎左膈静脉。
    注意：可使用浸润乳酸林格液并置于肝脏上的小块湿润无纺纱布海绵，轻轻将肝脏从剑突处推开，以暴露左膈静脉。
  11. 使用圆头剪刀剪断左侧三角韧带和胃肝韧带。
  12. 使用一小块湿润无纺纱布海绵将左叶和中叶小心向剑突方向牵拉，以暴露尾状叶。使用圆头剪刀切断尾状叶与其他肝叶之间的韧带。
  13. 使用双极电外科设备在靠近食管处切断并分离肝食管韧带。
    注意：轻轻将小肠和大肠移至腹腔左侧，并用湿润无纺纱布覆盖。
  14. 解剖覆盖在 IHVC 上的后腹膜和脂肪组织。暴露并游离 IHVC 至左肾静脉水平。
  15. 使用棉签轻微移位 IHVC，暴露汇入其右侧的小静脉，并使用双极电外科设备进行电凝。同时电凝所有汇入 IHVC 的腰静脉。
  16. 在两条 7-0 丝线结扎线之间切断右侧肾上腺静脉，结扎位置应靠近 IHVC。在轻柔牵引下切断肝脏后方的韧带，使肝脏游离。
  17. 使用精细电凝头将右肾静脉与右肾动脉及周围组织分离。使用 8-0 不可吸收无菌缝线封闭右肾静脉开口。
  18. 剥离门静脉（PV）周围的脂肪组织，以定位幽门静脉（即右胃静脉）和脾静脉汇入 PV 的位置。使用 7-0 丝线结扎这些静脉，并在靠近 PV 的一侧使用 8-0 不可吸收无菌缝线加强结扎。在结扎线之间切断这些静脉。
    注意：使用小块湿润纱布向后牵拉十二指肠以暴露 PV。若将脂肪从 PV 周围剥离，有助于更顺利地插入套管，并可防止 PV 套管发生狭窄。
  19. 使用 1 mL 注射器（31 G 针头）将 300 IU 肝素钠溶于 1 mL 生理盐水中，注入 IHVC。
  20. 在胆总管（BD）分叉下方 5 mm 处做一切口，将 BD 支架插入公共 BD。在切口上方 1 mm 处用 7-0 丝线结扎固定支架。可在分叉下方 10 mm 处再做一额外结扎。支架固定后，在两结扎线之间切断 BD。
  21. 切勿夹闭 BD 或肝固有动脉（HA）。在 BD 切口处的 3 点钟位置缝合一针 10-0 不可吸收无菌单股外科缝线作为标记，以防再连接时发生扭转。
  22. 暴露肝固有动脉，于两条 7-0 丝线结扎线之间切断胃十二指肠动脉（GDA）。暴露左胃动脉、脾动脉和腹腔干。在远端及其起始处分别结扎这三条动脉。
  23. 在动脉结扎线之间切断左胃动脉、脾动脉和腹腔干。使用带有 21.5 G 针头的 20 mL 注射器，缓慢向 PV 注入 20 mL 冷（4 °C）乳酸林格液。在左肾静脉汇入 IHVC 的位置下方切断下腔静脉，以允许灌注液流出。
    注意：针头应尽可能远离肝门。供体肝脏的冷灌注时间应持续 1–2 分钟。灌注过程中，另一只手应持续将冷乳酸林格液喷洒于肝脏表面。
  24. 灌注完成后，在脾静脉汇入处下方切断 PV 主干。在左肾静脉上方紧邻处切断 IHVC。在紧邻膈肌处切断 SHVC。
  25. 切断肝脏与后腹膜之间的韧带和结缔组织。
    注意：确保前壁和后壁的肝上段下腔静脉有足够的长度，以便于上腔静脉吻合。关键是在紧邻膈肌处切断，以尽可能保留最大长度。
  26. 肝脏从腹腔取出后，迅速将其放入盛有 4 °C 乳酸林格液的培养皿中。将培养皿置于冰垫上以维持低温。
  27. 根据机构指南处理供体大鼠的遗体。

3. 供体大鼠肝脏准备（"背台操作"）

  1. 将足够体积的4 °C林格乳酸盐溶液倒入冰冷的培养皿中，以完全浸没供体大鼠肝脏。小心旋转漂浮在培养皿中的供体肝脏，使其下表面朝上。将门静脉（PV）和下肝静脉（IHVC）的套管（分别为补充材料1和补充材料2）放入培养皿中。
  2. 将门静脉（PV）穿过PV套管，并将静脉末端翻折覆盖在套管上。使用7-0丝线将PV牢固地结扎在套管周围。用10 mL的4 °C林格乳酸盐溶液冲洗PV。
  3. 对IHVC重复步骤3.2，但无需冲洗。
  4. 清除腹腔干周围的脂肪组织。通过切开腹腔干、脾动脉和左胃动脉的分叉处，制作一个较大的动脉套管（图2A）。
    注意：将动脉支架插入肝总动脉（HA）较为困难。在插入支架前，需用镊子多次拉伸并捋直动脉。确保支架斜面朝上，且动脉无扭曲（图2B）。
  5. 通过动脉套管将长度为1.5 mm的24 G动脉支架插入供体肝总动脉（HA）中。使用8-0聚丙烯缝线固定支架（图2C），并用林格乳酸盐溶液冲洗支架（图2D）。
  6. 在近端IHVC上放置一个微型夹（长度为4–6 mm），以防止门静脉再灌注后出血，并避免空气栓塞。
  7. 旋转肝脏，暴露其上表面。在SHVC的外侧缘和内侧缘分别插入两根8-0聚丙烯锥形针缝线。
  8. 将肝脏保持在4 °C环境中，以备移植至受体。

4. 受体操作

  1. 参考上述供体手术部分，重复步骤 2.1–2.4。
    注意：此处使用12-14周龄的雄性Lewis大鼠，体重比供体重5-20 g。手术过程中，通过观察呼吸频率、心率、器官/黏膜颜色以及是否存在足底回缩反射来监测麻醉深度。
  2. 将手术巾铺好 将大鼠腹部朝上放置。将鼻部置于异氟烷吸入麻醉回收装置中。用眼用润滑剂湿润眼睛。先用聚维酮碘，再用70%乙醇清洁腹壁。
  3. 在腹壁下侧两侧皮下注射5 mL乳酸林格液。请外科助手协助完成 术前于左腹壁肌内注射0.5 mL浓度为200 mg/kg的哌拉西林钠；另于右腹壁皮下注射0.5 mL浓度为10 mg/mL的布比卡因。
    注意：术后每日1次，连续3天给予相同剂量的哌拉西林钠。
  4. 再次使用聚维酮碘对腹壁进行消毒，随后使用70%乙醇。从胸骨剑突开始，沿中线切开至耻骨联合上方1 cm处。切开后，将异氟烷浓度降至2%，气流速度调至0.5 L/min，吸入氧浓度维持在70%，以维持麻醉状态。
    注意：可使用蚊式钳夹住剑突并向头侧牵拉。用胶带将蚊式钳固定在适当位置。使用3D打印的牵开器保持体腔开放（参见 补充材料 3用橡皮筋将两侧固定在通过磁力吸附于手术平台的装置上。
  5. 用浸有乳酸林格液的湿无纺纱布（4 cm × 4 cm）包裹小肠和大肠。用浸有乳酸林格液的小块湿无纺纱布（2 cm × 4 cm）轻轻覆盖肝脏。
  6. 放置一个小型3D打印支撑垫（背部固定器；参见 补充材料 4）置于大鼠躯干中部下方，通过屈曲脊柱以更好地暴露下腔静脉（SHVC）。该操作可在大鼠中安全进行 由外科助手执行。
  7. 切断镰状韧带，用小块湿润的无纺纱布轻轻将肝脏从剑突处推开，暴露左膈静脉。使用显微镊子将左膈静脉与下腔静脉（SHVC）分离。在靠近膈肌处用7-0丝线结扎左膈静脉。
  8. 用圆头剪刀剪断左侧三角韧带和胃肝韧带。
  9. 用一小块湿润的无纺纱布轻轻将左叶和中叶推向剑突，以暴露尾状叶。切断尾状叶与肝脏其余部分之间的韧带。
  10. 分离肝食管韧带，并使用双极电外科设备紧贴肝脏电凝任何出血点。切断肝脏后方的韧带。
  11. 将小肠和大肠小心地移至腹腔左侧，并用湿润的无纺纱布覆盖。
  12. 解剖下腔静脉（IHVC）周围的腹膜后组织和脂肪，暴露并游离下腔静脉至右肾静脉水平。用棉签轻轻推移下腔静脉，使用双极电凝设备烧灼汇入下腔静脉右侧的所有细小静脉。同样，烧灼进入下腔静脉的腰静脉。
  13. 在两根7-0丝线结扎之间离断右侧肾上腺静脉。在轻柔牵引下切断肝脏后方的韧带，游离肝脏。
  14. 使用浸有乳酸林格液的小块湿纱布牵拉十二指肠，暴露门静脉（PV）。分离门静脉与幽门静脉分叉处的脂肪组织。
  15. 在肝门分叉下方0.5 cm处切断胆总管，并将胆总管支架插入远端胆总管。在切口下方约0.2 mm处用7-0缝线将支架固定到位。可在切口上方靠近分叉处再加一结扎线。在靠近肝脏侧但结扎线远端处切断胆总管。
  16. 用镊子分离BD，避免夹伤BD或正常的HA。在BD的3点钟位置放置一根10-0不可吸收单丝缝线（例如Ethilon），作为标记，以防止再连接后发生扭转。
  17. 暴露正确的肝动脉（HA）以及肝总动脉（HA）与胃十二指肠动脉（GDA）的分叉。暴露左肝动脉、中肝动脉和右肝动脉。在肝总动脉分叉远端结扎这三条动脉，并在结扎线靠近肝脏一侧、紧邻肝脏处切断动脉。
  18. 将一条细长的纱布条放置于SHVC后方。
  19. 放置一个3D打印的IHVC支架或 "手柄" （Cava 150g 2.1；参见 补充材料 5）位于IHVC后方，并缝合3D打印部件的末端 "手柄" 使用10-0非吸收性单丝缝线进行缝合图3A).
  20. 放置一个3D打印的PV支架或 "手柄" (Porta 1.4.1-参见 补充材料 6位于门静脉后方、肝脏正下方，缝合3D打印的两端 "手柄" 使用10-0非吸收性单丝缝线进行缝合。
  21. 在两个3D打印固定器（IHVC和PV）下方松松地系上7-0丝线结扎线（图3A).
  22. 在右肾静脉上方夹住下腔静脉，此处位置应仍低于3D打印的下腔静脉固定器。
  23. 在门静脉主干上夹闭，位置应位于幽门静脉上方，且低于3D打印的门静脉支架。记录无肝期时间，此时开始计算。将异氟烷浓度降至0.5%，气流调至0.5 L/min，FiO₂调至70%2 用于麻醉维持。
  24. 使用带27 G针头的3 mL注射器，通过门静脉分支注入2 mL 37 °C的乳酸林格液。
  25. 用基茨米勒钳在肝脏上方夹住肝静脉（SHVC），在同一个钳子下方剪断，尽可能靠近肝脏。
  26. 在PV和IHVC的3D打印支架上方进行切割图3A）。取出受体肝脏。仔细调整供体肝脏的方向，并将其置于受体体腔内，使上腔静脉吻合口能够顺利建立。
  27. 使用8-0聚丙烯连续缝合线将供体的SHVC与受体的SHVC在膈肌附近吻合。首先，在供体和受体SHVC的左侧和右侧分别放置8-0聚丙烯固定缝线，然后将其结扎在静脉壁外侧。
  28. 使用左侧的8-0聚丙烯线从左至右缝合SHVC后壁，并与右侧的8-0聚丙烯线打结。使用同一根左侧的8-0聚丙烯线从左至右缝合SHVC吻合口的前壁，保留最后三分之二的缝线处于松弛状态。在松弛的缝线之间注入20 mL乳酸林格液冲洗，同时确保排出所有气泡。
  29. 收紧SHVC外侧的松散缝线并打结，剪除剩余的8-0聚丙烯缝线。
    注意：夹子用于固定受体的下腔静脉（SHVC），便于将供体与受体的SHVC缝合在一起。记录SHVC吻合所需的时间。此时，门静脉夹持装置已连接至持针器臂装置（持针器臂 McGil + 小型持针器臂 LAB + 持针器臂软性部件 1.3；参见 补充材料 7, 补充材料 8，以及 补充材料 9，分别位于肝脏正下方。该装置由一个3D打印的支架底座（支架底座3.1；见 补充材料 10).
  30. 插入PV套管（补充材料 1将供体的门静脉插入受体门静脉，并收紧7-0丝线结扎。在吻合前，用预热至37 °C的乳酸林格液冲洗供体和受体的门静脉。
  31. 先移除肝上腔静脉（SHVC）的无创钳，再移除门静脉（PV）的微血管夹。以温血重新灌注肝脏；至此，无肝期时间结束。记录此时间。
  32. 在肝脏上方倒入10 mL温热的乳酸林格液以进行加温。使用圆头剪刀剪断固定缝线，移除3D打印支架。
  33. 插入供体IHVC套管（补充材料 2) 放入受体髂内静脉（IHVC）中，并用7-0丝线结扎固定。先移除供体IHVC夹，再移除受体的夹子（图3B）。下腔静脉按上述方法固定于固定装置和装置底座上，
  34. 用圆头剪刀移除3D打印机支架（porta和cava）（剪断固定缝线）； 图3C），从而形成一个连通的IHVC（图3D).
  35. 仔细检查肝脏周围区域是否有出血。向体腔内注入3 mL 37 °C的乳酸林格液。
  36. 动脉吻合：将供体腹腔干延伸至支架外的部分剪除。
  37. 夹闭受体的正确肝动脉（HA），并剪断末端的结扎线。剪除血管周围的所有多余组织。图4A）。用林格乳酸盐溶液冲洗供体和受体血管断端的管腔。
  38. 将受体合适的肝动脉（HA）拉入供体HA支架的套管内，以完成HA吻合。用带弯针的10-0 Ethilon缝线从支架远端开口上方2.5 mm处（由外向内）穿过（供体）HA左侧壁，然后从支架末端穿出，使用4 cm长的10-0 Ethilon缝线进行引导。图4B).
  39. 将受体正确的肝动脉在血管开口下方0.5 mm处穿线固定，先从血管左侧由内向外进针，再从外向内进针至动脉右侧。
  40. 将缝线从（供体）HA 右侧管壁内侧穿至外侧，穿刺位置距支架开口的距离与原缝线位置相同。向上牵拉10-0不可吸收单丝缝线的两端，使受体自身HA向上移动并进入HA支架内图4C).
    注意：观察是否有血液泵出。一种方法是切断供体胃十二指肠动脉（GDA）以确认血液是否通过吻合口泵出。若切断了GDA，务必在进入手术下一步之前重新结扎该动脉。
  41. 将10-0非吸收性单丝线在供体HA上方打结固定图4D动脉吻合现已完成。
  42. 胆道吻合：将结扎线松松地绕在受体胆总管和支架周围（图5A），然后移除BD支架。在完成胆道吻合之前，冲洗供体和受体的BD。
  43. 将供体的BD支架插入受体的胆管中（图5B）并收紧先前放置在受体BD周围的结扎线图5C).
  44. 将肠管放回体腔内。向体腔内注入 2 mL 37 °C 的乳酸林格液以冲洗体腔。用纱布吸去部分液体。
  45. 在使用5-0 Monocryl缝合壁层腹膜和皮肤之前，确保肠管已复位至原始位置。
  46. 用5-0单乔线分两层关闭切口。在缝合的壁层腹膜周围注射0.5 mL 0.5%布比卡因，皮肤缝合后重复注射一次。
  47. 转移时用纸巾轻轻包裹受体大鼠。动物苏醒后应可自由获取水和食物。术后24–38小时内，在笼子下方一半区域放置循环温水垫以保温。术后即刻阶段，每只笼子仅饲养一只大鼠。

5. 术后护理

  1. 将食物颗粒浸泡在水中，然后放入培养皿中，置于笼底。
  2. 监测大鼠的心率、呼吸频率和皮肤颜色。
  3. 术后第1、2、3天给予哌拉西林。皮下注射布托啡诺，并在术后最初72小时内监测任何疼痛迹象，如行为改变、嗜睡、毛发凌乱、抑郁、自残或食欲减退。
    注意：移植术后至少每天评估疼痛2次，持续3天，之后至少每天1次。

结果

在采用先前所述方案建立非肝动脉吻合的大鼠肝移植模型时28术后21天和60天，我们的团队观察到的生存率分别为50%和37.5%。尽管已有部分研究团队报道过不进行肝动脉吻合的情况下较高的长期生存率28，这些早期结果凸显了缺乏动脉流入的缺陷。相比之下，优化的HA再连接方案将长期存活率从37.5%显著提高至88.2%（p = 0.015）（图6).

对未进行肝动脉（HA）再连接的移植动物代表性亚组进行组织学分析（术后第6天和第13天），结果显示存在缺氧性肝损伤，伴有小叶中央坏死（图7）。这些动物的肝脏出现广泛性坏死，同时丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平显著升高（图7）。相比之下，接受肝动脉再连接的移植大鼠未表现出肝损伤迹象，组织学分析显示肝脏实质结构正常，肝小叶结构完整，包括有序排列的肝细胞索、肝小叶（如中央静脉和包含肝静脉的门管区三联体）、动脉和胆管（图7）。

尽管在23次独立手术过程中，平均无肝期时间尚可接受（12分钟14秒[±78秒]），但随着操作经验的积累，非肝动脉再连接模型的存活率仍有可能进一步提高。然而需要注意的是，4只未进行肝动脉再连接的移植动物中，有3只（用于长期存活观察）因术后第56天、第96天和第111天出现严重痛苦而被实施安乐死。此外，肝脏的组织学分析显示，缺氧性肝损伤后出现反应性改变，包括明显的胆管增生、门脉周围纤维化和炎症，以及肝实质结构紊乱（补充图2）。这些缺氧性肝损伤的形态学特征进一步证实了肝动脉再连接对于实现有效肝脏灌注和正常功能的重要性。

用于精确组装和分析的机械部件示意图，标注了尺寸。
图1：门静脉和肝下下腔静脉用3D打印袖套设计的示意图。 第一个结扎线收紧于靠近手柄（iii）的凹槽（ii）中，第二个结扎线收紧于距离手柄最远的凹槽（i）中。外径分别为（iv）门静脉（PV）2.38 mm，肝下下腔静脉（IHVC）2.15 mm；内径分别为（v）PV 1.74 mm，IHVC 1.38 mm；长度分别为（vi）PV 2.60 mm，IHVC 2.15 mm（所有3D打印材料的详细规格见补充材料）。请点击此处查看该图的放大版本。

手术缝合技术序列，带镊子的标记部分，操作示意图。
图2：移植物中肝动脉支架的插入。 （A）通过从脾动脉向左胃动脉方向剪开，扩大腹腔干（i）的开口端，从而暴露肝总动脉（HA）的分叉处。（ii）在取出供体大鼠肝脏前，预先将胆管（BD）支架结扎。（iii）门静脉（PV）套管和（iv）肝下下腔静脉（IHVC）套管通过将血管末端翻折覆盖在套管上后结扎固定。（B）（i）为插入肝动脉支架，需用镊子反复牵拉暴露的肝总动脉。（C）（i）将肝动脉支架牢固地置入肝总动脉，并用8-0聚丙烯线结扎固定。（D）（i）用（ii）乳酸林格液冲洗肝动脉支架（BD = 胆管，IHVC = 肝下下腔静脉，HA = 肝动脉）。 请点击此处查看该图的高清版本。

逐步放大展示外科肝吻合过程，重点关注组织与钳夹装置的相互作用。
图 3：使用 3D 打印支架进行肝下腔静脉吻合。（A）(i) 门静脉（PV）采用与肝下腔静脉（IHVC）相同的吻合技术进行连接。供体血管 (ii) 在 (iii) IHVC 套管上方被夹闭。受体 IHVC 开口处 (iv) 被缝合至 3D 打印支架的两侧，以保持其充分张开。一条松散的 (v) 7-0 丝线环绕结扎于受体 IHVC 周围。（B）供体 IHVC 套管 (i) 插入受体 IHVC 内部，随后收紧松线。（C）移除血管夹，并用剪刀 (i) 拆除 3D 打印支架。（D）若吻合不够牢固，可额外使用一条 (i) 7-0 丝线环绕结扎，但通常一条结扎线已足够（PV = 门静脉，IHVC = 肝下腔静脉）。请点击此处查看该图的高清版本。

肝动脉吻合过程；手术示意图及操作步骤 A-D，缝合技术。
图 4：肝动脉的微血管套管连接。 （A）(i) 胆管（BD）支架未与受体连接。(ii) 肝动脉（HA）支架置于移植物中，并与 (iv) 受体的肝固有动脉相连。(iii) 门静脉（PV）已连接。（B）使用 (i) 弯针的10-0 Ethilon缝线从肝动脉支架穿出，至受体肝动脉开口端的两侧。（C）将10-0 Ethilon缝线反向穿过肝动脉支架；因此，受体的肝固有动脉像套入袖管一样被拉过支架。（D）(i) 当受体的肝固有动脉被拉入支架并到达最初穿过肝动脉支架的部分时，使用10-0 Ethilon缝线打结固定。（E）此处展示的是（B）、（C）和（D）中所述肝动脉吻合的示意图（BD = 胆管，HA = 肝动脉，PV = 门静脉）。*通过从脾动脉切断至胃左动脉，扩大腹腔干的开口端。请点击此处查看该图的放大版本。

医疗手术中的外科缝合操作，展示带有标注点的详细步骤。
图5：使用两个支架进行胆管连接。（A）(i) 在 (ii) 松绑于受体胆管开口处的支架辅助下，将移植物胆管支架插入受体胆管中。(iii) 在胆管连接前先吻合门静脉（PV），门静脉位于胆管后方。（B）移除受体胆管末端的支架，并将其作为扩大的开口，用于 (i) 插入与移植物绑在一起的胆管支架。（C）原本用于松绑固定受体支架的结线现用于结扎吻合口，且 (i) 另用一根7-0丝线牢固固定支架，防止支架滑脱或扭转。请点击此处查看该图的高清版本。

生存分析图；有/无肝动脉再连接，Kaplan-Meier 曲线，术后天数比较
图 6：移植后存活率百分比。 无肝动脉再连接（n = 8）与有肝动脉再连接（n = 17）的大鼠原位肝移植。移植后至少 60 天内密切观察动物是否出现肝功能衰竭和/或感染的迹象。术后未出现并发症的大鼠被视为存活者（*p = 0.015，由 Kaplan-Meier 估计法[长秩检验]计算得出）。请点击此处查看此图的放大版本。

肝移植术后肝组织病理学；ALT、AST水平；示意图显示肝动脉重建的影响。
图7：肝脏组织病理学评估。 肝移植（LTx）后第6天和第13天动物肝脏的代表性苏木精-伊红染色切片：(A) 未进行肝动脉（HA）重建；(B) 进行肝动脉重建。(C) 正常肝实质结构，显示门脉三联体（门静脉、动脉和胆管）、肝小叶（包括中央静脉）以及腺泡。紧邻门脉三联体的肝细胞为1区肝细胞；位于肝小叶内中央静脉周围的肝细胞为3区肝细胞；介于1区和3区之间的肝细胞为2区肝细胞（ALT = 丙氨酸氨基转移酶，AST = 天冬氨酸氨基转移酶，CV = 中央静脉）。请点击此处查看此图的放大版本。

显示医用手术尺寸的血管支架和套管，附标尺。
补充图1：支架和套管的尺寸。 请点击此处查看该图的放大版本。

肝移植术后组织学进展，显微镜检查，慢性排斥反应评估。
补充图2：肝脏组织病理学评估显示肝实质结构破坏。 肝移植术后第54、96和111天未进行肝动脉重建动物的代表性苏木精-伊红染色切片。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充材料 1：Porta cuff 200g - 支架 2.0。 请点击此处查看该文件（右键单击以下载）。

补充材料 2：200 克下腔静脉套管 - 支架 2.0。 请点击此处查看该文件（右键单击以下载）。

补充材料 3：肝脏牵开器 200g。 请点击此处查看该文件（右键单击以下载）。

补充材料 4：背板 - 1.2。 请点击此处查看该文件（右键单击可下载）。

补充材料 5：Cava 150g - 2.1。 请点击此处查看该文件（右键单击以下载）。

补充材料 6：Porta 1.4.1。 请点击此处查看该文件（右键单击可下载）。

补充材料 7：麦吉尔夹持臂。 请点击此处查看该文件（右键单击可下载）。

补充材料 8：微型支架臂 LAB。 请点击此处查看该文件（右键单击以下载）。

补充材料9：夹具和机械臂软部件1.3。 请点击此处查看该文件（右键单击可下载）。

补充材料 10：夹持器底座 - 3.1。 请点击此处查看该文件（右键点击可下载）。

讨论

小型动物肝移植模型对于理解移植免疫机制以及发现新的治疗策略具有重要意义32。理想的小型动物肝移植模型应复制人类手术的所有步骤，包括动脉吻合。解读大鼠原位肝移植（OLT）模型的结果可能存在困难，因为大多数现有模型未包含肝动脉（HA）吻合步骤，从而导致并发症和病死率升高42。某些重建手术曾采用肾动脉进行吻合，但该方法需切除肾脏27。本方案避免了器官切除，因其超出了人类肝移植手术的实际操作范围。

通过操作大鼠腹主动脉也可进行动脉重建31。然而，这些方法需要对腹主动脉进行广泛的解剖和夹闭。如果夹闭时间过长，受体大鼠将因远端缺血而出现不良结局43。在人类中，肝移植（LT）手术技术包括结扎并切断受体的胃十二指肠动脉（GDA）。然而，啮齿类动物的生理和解剖特征使得采用该技术进行移植在生理上更具挑战性，并可能导致并发症（例如胰腺和胆管坏死35以及胆汁泄漏44）。本方案中的动脉再连接旨在规避这一挑战，维持胆管血流，并改善受体的预后。

既往已有文献描述采用套管支架技术重建大鼠肝动脉（HA）的方法27。该技术中，以支架作为引导，将供体腹腔干动脉与受体肝总动脉进行吻合重建。随后游离受体肝总动脉，并结扎受体胃十二指肠动脉（GDA）27。由此可能导致受体胆总管下段及胰腺头部的血液供应受损。据认为，该区域的侧支循环通常无法为胆管提供充足的血流。例如，本方案首先使用微血管夹暂时夹闭受体GDA，随后切断受体胆管（BD）。当GDA被夹闭时，切断的胆管不发生出血；而在移除GDA夹闭后，可观察到胆管断端出现明显出血。本方案通过维持受体切断胆管的良好血流，保障了受体肝组织的生理功能，提供了充分的肝脏血液灌注，并预防肝移植术后缺氧性肝损伤。

在供体侧，制备移植物时，通过从腹腔干、左胃动脉和脾动脉创建一个补片，可轻松将肝动脉支架插入腹腔干。支架可通过该宽阔的开口插入，操作难度明显低于单独插入腹腔干。研究发现，24 G 是用作肝动脉支架的理想尺寸。支架长度应为 1.0–1.5 mm，因其作用相当于一个开放的通道，便于将受体的肝固有动脉顺利拉入供体的肝总动脉。只要仔细注意10-0 Ethilon缝线的放置位置，流经此连接处的血液将不会直接接触支架，且受体的肝固有动脉会从内侧将其覆盖，从而降低并发症风险。重要的是，供体肝动脉始终不使用血管夹，以避免发生血管痉挛。动脉重建的成功通过保持供体胃十二指肠动脉（GDA）开放来评估。重建完成后，若吻合成功，则供体GDA可呈现良好的血流。

在本方案中，与其它方法类似，肝上下腔静脉（SHVC）的重新连接是最慢的步骤，最终决定了无肝期的持续时间。随着无肝期时间的延长，缺血性损伤和肝功能障碍的风险也随之增加45。大鼠OLT模型的另一个关键因素是移植物、支架和套管的尺寸。如果移植物过小，可能发生扭转或翻转，从而阻塞血管连接。支架和套管的尺寸可能需要根据大鼠的年龄、性别、体重和品系进行调整。本研究中所使用的套管尺寸如先前所述28，并采用了一种根据大鼠体型进行控制的统一套管尺寸。在随访期间（截至目前：中位随访时间为术后133天，最短为术后115天，最长为术后161天），未观察到任何痛苦或并发症迹象（例如肝淤血、水肿、腹水或脾肿大）。未来有必要进一步研究不同品系大鼠在考虑年龄和性别的前提下，门静脉（PV）和肝上下腔静脉（IHVC）适宜尺寸的选择。

这种改良的大鼠OLT方案采用3D打印的套管用于门静脉（PV）和下腔静脉（IHVC），如先前所述39,40。现有连接PV和IHVC的方法包括显微缝合技术32、套管技术46以及显微缝合-临时夹板技术47。本研究选择3D打印套管技术，因其可根据大鼠品系标准化套管尺寸，且制备和使用简便。相同尺寸的套管可一次性大量打印。套管外表面设有两个凹槽，便于结扎固定并防止滑脱。套管设计中还包含一个尾部结构，以便于操作。总体认为，采用3D打印套管可通过缩短无肝期，提高OLT手术的成功率和可重复性。此外，该技术也被证实可缩短外科手术的学习曲线。

综上所述，通过引入动脉吻合步骤，所述方案建立了一个更接近人类肝移植的模型。该方案可适用于研究肝移植中的多种免疫学和外科学问题，并可作为测试与移植相关的新型治疗干预措施的模型。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由多伦多大学健康网络（UHN）多器官移植项目基金以及多伦多综合医院和多伦多西区医院基金会的支持资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10-0 EthilonEthicon2830G10-0 Ethilon 黑色 1×5" BV100-4 圆锥形针
10 mL 注射器BDB302995鲁尔锁头，无菌，一次性使用
1 mL 注射器BDB309628鲁尔锁头，无菌，一次性使用
20 mL 注射器BDB301031鲁尔锁头，无菌，一次性使用
用于 IHVC 的 3D 打印套管定制
用于 PV 的 3D 打印套管定制
用于 IHVC 的 3D 打印支架定制
用于 PV 的 3D 打印支架定制
3 mL 注射器BDB309657鲁尔锁头，无菌，一次性使用
4-0 SofsilkCovidenGS-835编织丝线，未染色，30"，缝合线配 1 枚 26 mm 长 1/2 圆形圆锥头针
5-0 MonocrylEthiconY433H未染色单丝线 1×27" TF
5 mL 注射器BDB309646鲁尔锁头，无菌，一次性使用
7-0 丝线Teleflex Medical103-S黑色
8-0 ProleneEthicon2775G8-0 Prolene 蓝色 1×24" BV130-5 EVP 双针
Barraquer 微型持针器（无锁扣）Aesculap 外科器械FD231R弯曲型，120 mm，4 3/4″
Barraquer 持针器，超细钳口 8.0 mm，弯曲型无锁扣Rumex International Co.8-025T小型，钛材质
Barraquer 持针器，细钳口 12.0 mm，弯曲型无锁扣Rumex International Co.8-021T小型，钛材质
BD Insyte Autoguard BC 22 GA × 1.00 INBD Angiocath / Autoguard38252322 G × 1.00" (0.9 mm × 25 mm) 无翼导管，37 mL/min
BD PrecisionGlide 一次性针头：普通斜面 - 普通管壁BDB305106PrecisionGlide 不锈钢针头，透明彩色编码聚丙烯针座，22 G
BD Precisionglide 注射器针头 21GBD305167规格 21，长度 1.5 英寸，皮下注射针头
BD Precisionglide 注射器针头 30GBD305128规格 30，长度 1 英寸，皮下注射针头
Purdue Products LP 生产的聚维酮碘溶液Purdue Products Lp67618-150-1710% 聚维酮–碘外用溶液 USP
布比卡因注射液 BP 0.5%SteriMax Inc.DIN:024436940.5% (100 mg/20 mL)
弯曲打结钳Duckworth & Kent2-501E6 mm 打结平台，直杆，扁平手柄，长度 88 mm
直流温度控制器FHC Inc.40-90-8D
DK 虹膜剪（弯曲型）Duckworth & Kent1-211B钝头，剪切长度 4 mm，尖端至枢轴长度 11 mm，圆柄，总长 107 mm
乙醇，200 证明（100%），USP，Decon LabsDecon Labs, Inc.2716用 d2H2O 稀释至 70%
精细可调金属牵开器Fine Science Tools17004-05最大展开宽度：3.5 cm，深度 5 cm
Harvard Apparatus 异氟烷漏斗加液挥发器Harvard Apparatus Limited34-1040SV
肝素 LEO（肝素钠）LEO Pharma Inc.DIN:0045381110,000 i.u./10 mL
冰袋CryopakFIP880164.00 英寸 × 7.00 英寸，厚度 1.50 英寸
异氟烷 美国药典（USP）99.9%Piramal Healthcare LimitedDIN: 02231929250 mL，吸入麻醉剂，NDC 66794-017-25
Khaw 经结膜可调节缝线控制钳Duckworth & Kent2-502N5 mm 高度抛光打结平台，直杆，扁平手柄，长度 84 mm
乳酸林格注射液 USP，1000 mLBaxter Co.DIN: 00061085JB2324
McPherson 打结钳Duckworth & Kent2-500E6 mm 打结平台，直杆，扁平手柄，长度 90 mm
Metzenbaum 剪刀 - 14.5 cmFine Science Tools14024-14直型，尖端锐利/钝头
微型 Kitzmiller 钳Scanlan3003-630钳口长度 23 mm，总长 11 cm
显微镜-Leica M525 F20Leica Microsystems无目录号
无纺纱布海绵Fisherbrand22-028-556
Olsen-Hegar 带缝线切割器Fine Science Tools12002-1415 mm 切割刃，2 mm 钳口表面 - 14 cm
OptixCare 眼科润滑膏，25 gOptixCareES-KE8O-69U1原名 Optixcare 外科眼科润滑剂
哌拉西林钠盐Sigma-AldrichP8396青霉素类似物
Puritan 3" 标准棉签带木柄Puritan Medical Products Company LLC803-WC普通棉头涂药棒带木柄
圆柄直型持针器带锁扣Fine Science Tools12075-12圆柄便于指尖调节 - 12.5 cm
Shea 剪刀 弯曲钝头Fine Science Tools14105-12移植剪，轻巧精细设计 - 12 cm
不锈钢微型 Serrefines 弯曲型 - 4 mmFine Science Tools18055-06钳口长度 4 mm，钳口宽度 0.75 mm，总长 16 mm，钳口压力 125 g
不锈钢微型 Serrefines 弯曲型 - 6 mmFine Science Tools18055-05钳口长度 6 mm，钳口宽度 1 mm，总长 17 mm，钳口压力 100 g
不锈钢微型 Serrefines 直型 - 6 mmFine Science Tools18055-03钳口长度 6 mm，钳口宽度 1 mm，总长 15 mm，钳口压力 100 g
手术平台定制，磁性
SurgiVet Vaporstick 麻醉机General Anesthetic Services, IncV7015
T/Pump 局部治疗系统StrykerTP700 系列
真空-压力泵Barnant Co.400-1901
Vannas 剪刀 带微锯齿 直型Fine Science Tools15070-08切割刃：5 mm，尖端直径：0.1 mm - 8.5 cm
Vetergesic 布托啡诺Ceva Animal Health LtdNAC No.:123803520.324 mg/mL 盐酸布托啡诺注射液，用于犬和猫
Vetroson V-10 双极电外科设备Summit Hill Laboratories无目录号
手术铺巾PDC HealthcareDRP1824多用途无菌透明塑料，18" × 24"，每箱 40 片

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