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利用毛细管电泳免疫分析法在人血小板中寻找肌萎缩侧索硬化潜在生物标志物

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DOI：

10.3791/60638

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2020年2月10日

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1Department of Basic Sciences, Kansas City University of Medicine and Biosciences, 2Rice University School of Medicine, 3University of Kansas Medical Center

本文内容

摘要

神经退行性疾病的血液生物标志物对于开展大规模临床研究至关重要。一种可靠且经过验证的血液检测方法应仅需少量样本，同时具备采样侵入性小、成本低廉和可重复性强等优点。本文表明，高通量毛细管电泳免疫分析技术符合潜在生物标志物开发的各项标准。

摘要

毛细管电泳免疫分析法（CEI），也称为毛细管Western技术，正成为临床试验中筛选与疾病相关的蛋白质和药物的首选方法。该方法具有重复性好、灵敏度高、所需样本量小、可在同一样本中对多种蛋白质进行多重抗体标记、可自动化高通量分析（最多达24个独立样本）以及操作时间短等优势，优于传统的Western印迹免疫分析法。然而，该方法也存在一些局限性，例如无法使用梯度凝胶（4%–20%）基质、在未经纯化的生物样本中背景信号较高，以及个别试剂无法商业化获取。本文介绍了一种在多组实验条件下高效运行CEI的方法，可在同一块检测板中优化蛋白质浓度和一抗滴定条件，并提供了便于用户操作的样本制备模板。此外，还描述了在血小板裂解物胞质中检测总TDP-43及磷酸化TDP-43衍生物的方法，作为基于血液的神经退行性疾病生物标志物开发项目的一部分。

引言

本文所述CEI的总体目标是提供一种更新的逐步操作方案，用于分析人血小板中的靶蛋白。在阿尔茨海默病（AD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、额颞叶变性（FTLD）、帕金森病（PD）、包涵体肌炎（IBM）以及其他与蛋白质聚集相关的病理状况等人类神经退行性疾病生物标志物开发领域中，确定基于血液的特征性分子是一项最重要的任务。在含有大量干扰物质的大量血液中检测微量的此类特征蛋白具有挑战性。因此，所选方法的特异性、灵敏度、高通量样本处理能力以及可重复性至关重要。

人类血小板可作为识别和确定神经退行性疾病潜在生物标志物蛋白的媒介。血小板可作为一种替代性的原代细胞模型，能够反映神经元细胞的某些特征1,2,3。血小板具备若干特性，使其成为分析生物标志物候选蛋白及其化学衍生物的优选手段。首先，可通过微创方式（如静脉穿刺）从供体采血，或从社区血库获取大量血液，从而方便地获得血小板。其次，在设备简单的实验室中，仅需最少的预处理步骤即可从全血中轻松分离血小板4,5。第三，血小板无细胞核，因此是研究代谢变化而无需考虑转录调控的理想模型细胞。第四，血小板内的生物分子被包裹在内部，其微环境可保护内容物免受血清中干扰物质（如蛋白酶）的影响。第五，富血小板血浆可在室温下保存7–8天而不丧失代谢活性。因此，血小板提供了一种可最大限度减少并控制外部因素影响的实验模型。

传统的免疫分析技术，如免疫印迹法（例如，Western印迹法）和酶联免疫吸附测定（ELISA），在特定蛋白质分析中应用更为广泛。然而，这两种方法存在若干缺点，包括实验步骤较多、需要使用有害化学品和试剂、样本用量大、实验重复性问题以及不同批次间数据的变异性。这些问题促使人们开发出步骤更少、操作更简便且可在相对较短时间内完成的方法。尽管经典的Western印迹技术仍将是实验室中常用的方法，但在进行高通量定量蛋白质分析时，其多步骤操作、所需耗材、有毒废弃物（如丙烯酰胺、甲醇等）以及较长的实验时间正变得越来越不具优势。

一种自动化的毛细管电泳免疫分析（CEI）方法正逐渐成为进行高通量蛋白质检测实验室的首选方法6。CEI无需使用凝胶、凝胶电泳装置、膜、电泳及电转印设备，也减少了大量的手工操作环节。若设计得当，CEI检测可在约3.5小时内完成，包括定量数据分析、可用于发表的电泳图谱以及包含统计分析的图表。CEI系统的另一优势在于其仅需10至20倍更低的蛋白浓度，使其在临床试验所用的人体样本分析中具有理想适用性7,8。

CEI 中最关键的步骤是针对从不同供应商购买的每种抗体、抗体类型（单克隆 vs. 多克隆）、最佳蛋白浓度、样品制备、样品变性温度以及毛细管上施加的电泳电压，优化检测条件。我们已开发出一种适用于 CEI 的单次检测格式优化方法，应在开展任何新检测前实施，以节省时间和资源。该优化步骤之后，将对转录激活反应 DNA/RNA 结合蛋白（TARDP）的总蛋白及其磷酸化衍生物进行自动化定量评估。由于其分子量为 43 kDa，本文中将统一使用其缩写 TDP-43。本研究中检测了来自肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者的人血小板裂解液中的 TDP-43 蛋白，以协助建立预测性磷酸化值（PPV），作为潜在的预后生物标志物。

TDP-43 是肌萎缩侧索硬化症（ALS）的一种新的潜在疾病生物标志物候选分子。TDP-43 是所有有核细胞中普遍存在的蛋白质；因此，其在多种正常细胞事件及神经退行性疾病中的功能已被广泛研究9,10,11,12,13,14。尽管 TDP-43 是一种核蛋白15，但由于其含有核定位信号和核输出信号序列，因而能够在细胞核与细胞质之间穿梭16,17,18,19。细胞质中的 TDP-43 参与多种细胞活动，如 mRNA 的稳定性与运输、应激反应、线粒体功能以及自噬体形成20。然而，除参与神经退行性疾病的发病机制外，关于 TDP-43 磷酸化衍生物的作用目前仍知之甚少21。

本方案阐述了如何优化检测条件，利用CEI方法分析血小板中TDP-43及其磷酸化衍生物的含量。由于磷酸化TDP-43无法商业化获得，建议采用预测性磷酸化值（PPV）来评估肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者中TDP-43的表达谱。该CEI系统每根毛细管仅需少量样品混合液（2.5–3.0 µL）。根据制造商的方案，每根毛细管的总检测体积设定为8.0 µL；因此，研究人员可将同一样品混合液用于两次独立运行。制造商设计的检测流程可最大限度减少甚至完全消除移液误差。24份独立的人血小板裂解液样品混合物被分为半量（即每份2.5–3.0 µL），并在约7小时内连续使用两种不同的抗体依次进行分析。此处描述的CEI系统提供了一种理想的高通量检测模式。在开展大规模筛查前，使用者需针对目标蛋白测试来自不同供应商的抗体及不同的样品制备方法。

方案

所有关于人血小板处理的实验方案均遵循堪萨斯大学医学中心和堪萨斯城大学医学与生物科学机构审查委员会（IRB）的指导原则。

1. 缓冲液与试剂的配制

注意：请按照制造商的说明准备所有样品。在操作过程中佩戴个人防护装备（实验服、手套和护目镜）。

  1. 通过将0.941 g蔗糖（终浓度11 mM）、6.4 mL 5 M NaCl（终浓度128 mM）、5.4 mL 0.2 M NaH2PO4（终浓度4.3 mM）、9.4 mL 0.2 M Na2PHO4（终浓度7.5 mM）、0.352 g柠檬酸钠（终浓度4.8 mM）和0.115 g柠檬酸（终浓度2.4 mM）混合，配制柠檬酸盐洗涤缓冲液。用ddH2O定容至250 mL。经0.45 µm滤膜过滤后，调节pH至6.5。4 °C保存，可保存长达1年。使用前恢复至室温（RT）22。
  2. 在100 mL终体积中，加入250 mM蔗糖、1 mM EDTA和10 mM Tris-Cl（pH 7.4），配制裂解缓冲液。4 °C保存，可保存长达1年。向2 mL裂解缓冲液中加入2 µL磷酸酶抑制剂混合物（终浓度1:1000）和1 µL蛋白酶抑制剂混合物（终浓度1:2000）。冰上保存，即用即取。未用完的裂解缓冲液应丢弃。

2. 血小板分离

  1. 使用含有酸性柠檬酸葡萄糖（ACD）溶液（75 mM 枸橼酸钠、124 mM 葡萄糖和 38 mM 柠檬酸，pH = 7.4；ACD:血液 = 1:9）的黄色盖子采血管采集 8–10 mL 人血。用手轻轻倒置混匀 5–6 次。
  2. 将采血管在水平转子中以 200 x g 离心 20 分钟，室温操作。
  3. 收集富血小板血浆（PRP）（约 3–4 mL）至 15 mL 圆底离心管中，并保留约 0.5 mL PRP 不取，以避免白膜层（外观浑浊的部分）污染。若出现任何红细胞污染，需重复此步骤。
  4. 将 PRP 样品在室温下以 1,200 x g 离心 15 分钟。
  5. 用 1 mL 含蛋白酶抑制剂混合物的枸橼酸洗涤缓冲液轻柔重悬血小板沉淀（P1），然后在室温下以 1,200 x g 离心 15 分钟形成沉淀。
  6. 保留纯净的血小板沉淀，弃去上清液。
  7. 将血小板沉淀重悬于 600 μL 含抑制剂混合物的裂解缓冲液中。
  8. 使用超声破碎仪对血小板悬液进行超声处理。将样品置于小型冰桶中，在连续模式下将超声仪设定为 3 档，处理 20 秒。
    注意：务必用 10% 次氯酸钠溶液清洗探头，随后用蒸馏水冲洗。
  9. 将超声处理后的样品在 4 °C 下以 20,000 x g 离心 30 分钟，以去除膜组分。将上清液分装为每份 60 μL，储存于 -80 °C。避免血小板胞质组分反复冻融。

3. CEI 准备

注意：将来自肌萎缩侧索硬化症患者（n = 8–10）的100 µL人血小板裂解液分别混合，健康受试者（n = 8–10）的样品也分别混合，用于检测方法的优化。

  1. 填写机构内部生成的 CEI 布局模板（表 1）和样品制备模板（表 2）。样品混合物制备表为动态表格，将自动计算需从源头移除的体积。
    注意：当在动态表 2 中输入所需源体积时，系统将自动计算 0.1× 样品缓冲液体积。
  2. 预先标记 25 个 0.2 mL PCR 管，编号为毛细管 #1–#25，并将其放入 PCR 管架中。置于冰上。
  3. 预先标记 0.6 mL 微离心管：每种一抗及其稀释液（如需要）各一个，一个用于 0.1× 样品缓冲液，一个用于 luminol-S/过氧化物，以及每个需要稀释的样品各一个（如需要）。将这些管子放在管架中并置于冰上。
  4. 取出样品缓冲液、洗涤缓冲液、一块板以及 CEI 分离 12–230 kDa 主试剂盒分离模块中提供的卡盒。
  5. 从 4 °C 冰箱中取出抗体稀释缓冲液、一抗、二抗、luminol、过氧化氢和标准品包。除标准品包保持室温外，将所有试剂置于冰上。
    注意：标准品包中的试剂为冻干粉，用铝箔密封。使用前应使用小型离心机短暂离心，以减少产品损失。开启时，可用移液器吸头刺穿或从角落处撕开。
  6. 配制 400 mM DTT：向含有 DTT 的透明管中加入 40 µL 去离子水。
  7. 配制 40 µL 荧光 5× 主混合液：向试剂盒提供的粉色管中加入 20 µL 10× 样品缓冲液和 20 µL 已配制的 400 mM DTT 溶液。
  8. 配制生物素化分子量标记物：向试剂盒提供的白色管中加入 16 µL 去离子水、2 µL 10× 样品缓冲液和 2 µL 已配制的 400 mM DTT 溶液。轻轻混匀后转移至 0.2 mL PCR 管中用于变性处理。
  9. 配制 0.1× 样品缓冲液：向 0.6 mL 微离心管中加入 1.5 µL 10× 样品缓冲液和 148.5 µL 去离子水。涡旋混匀后置于冰上。
  10. 配制所需的一抗稀释液。将抗体稀释液按指定体积加入各预标记的微离心管中。若体积相同，使用反向移液技术23；若不同，在分装前预润洗移液器吸头。
    注意：本实验中使用了 a-TDP-43 全抗体和 a-p(S409/410-2) TDP-43 抗体。抗 ERK 抗体作为内参对照，以确保实验组分正常工作。
  11. 按以下步骤进行抗体稀释的反向移液操作。也可参考文献中的额外信息24。
    注意：反向移液技术适用于连续分装小体积溶液23，具有以下优势：(i) 提供精确体积，(ii) 避免试剂在吸头孔口起泡，(iii) 适用于小体积（<5 µL）试剂、粘稠溶液、表面活性剂溶液及高蒸气压溶液。
    1. 将合适的吸头装入移液器，将活塞压至第二档位（步骤 2）。将移液器吸头浸入溶液中几毫米。缓慢释放活塞，使溶液吸入吸头，同时吸头仍浸在溶液中。将吸头从溶液中取出，轻轻触碰试剂容器边缘，以去除吸头外壁残留的多余液体。
    2. 通过将活塞压至第一档位（步骤 1）来分装溶液。不要将吸头中剩余的溶液分装出去。
    3. 通过将活塞压至第二档位（步骤 2）将吸头中剩余的溶液排回试剂容器中。释放活塞至待用位置，准备下一步移液操作。
    4. 将所需体积的一抗加入各预标记的微离心管中（表 1）。不要预润洗移液器吸头：直接将抗体加入稀释液中，并多次冲洗吸头以去除残留抗体。将管子置于冰上。
  12. 为配制 CEI 样品混合液，请对编号为毛细管 #2 至 #25 的 PCR 管执行以下步骤：顺序与 表 1 中一致。
    1. 打开所有管子，使用反向移液技术向每个管中加入 1.6 µL 荧光 5× 样品缓冲液，然后立即关闭每个 PCR 管，以减少样品损失。
    2. 打开所有管子，根据 表 2 中指定的体积向每个管中加入 0.1× 样品缓冲液，然后立即关闭。若体积相同，使用反向移液技术；若不同，在分装 0.1× 样品缓冲液前预润洗移液器吸头。
    3. 打开所有管子，根据 表 2 中指定的体积向每个管中加入蛋白样品，然后立即关闭。若体积相同，使用反向移液技术；若不同，在分装前预润洗移液器吸头。
    4. 将所有 PCR 管在台式离心机中短暂离心（13,000 x g，30 秒），轻弹或涡旋混匀 PCR 管，然后重复离心一次。
    5. 将所有 PCR 管转移至带有加热盖的热循环仪中。在设定的温度和时间下对样品进行变性处理（例如，95 °C 变性 5 分钟；70 °C 变性 10 分钟）。
      注意：变性温度和时间需根据目标蛋白进行优化。
    6. 重复步骤 3.12.4。
    7. 将所有 PCR 管放回管架并置于冰上。
    8. 在变性过程中，配制显影液（1:1 的 luminol-S:过氧化物溶液），加入 200 µL luminol-S 和 200 µL 过氧化物。置于冰上。
    9. 为将上述制备的样品加载至 CEI 预填充板中，将试剂和样品加入检测板中所示的位置（检测布局，图 1）。避免引入气泡。
      注意：若体积和溶液相同，使用反向移液技术；若不同，在分装前预润洗移液器吸头，并且不要使用移液器第二档位将残留液体排入孔中。12–230 kDa 分离模块可能包含彩色编码的板加载指南。在向孔中添加试剂和样品时，将该指南置于板下方，有助于直观定位样品加载位置。该指南也可从公司网站下载。
      1. 在 E 行，向每个孔中加入 15 µL luminol:过氧化物混合液。
        注意：建议在使用前立即配制该试剂并加入各孔。若不便操作，可在上板前不超过 30 分钟内配制该混合液。
      2. 在 D 行，向 D1 孔中加入 10 µL 链霉亲和素-HRP。
      3. 在 D 行，向 D2–D25 孔中加入 10 µL 指定的二抗。
      4. 在 B 行，向每个孔中加入 10 µL 抗体稀释液。
      5. 在 C 行，向 C1 孔中加入 10 µL 抗体稀释液。
      6. 在 C 行，向 C2–C25 孔中加入 10 µL 指定的一抗。
      7. 在 A 行，向 A1 孔中加入来自 PCR 管 #1 的 5 µL 生物素化分子量标记物。
      8. 在 A 行，向 A2–A25 孔中分别加入 3 µL 样品（PCR 管 #2–#25）至对应孔 #2–#25。
      9. 向每个指定的洗涤缓冲液孔中加入 500 µL 洗涤缓冲液。
      10. 在室温下以 1,000 x g 离心 5 分钟。

用于蛋白质分析的微孔板布局图中的抗体滴定实验；显示稀释系列。
图1：实验布局。 可在一次实验中同时进行一抗和目标蛋白样品的优化。毛细管2–7、8–13、14–19和20–24分别代表不同蛋白浓度和一抗浓度梯度。毛细管25为阳性对照。本实验使用了抗ERK抗体，但也可选用其他合适的阳性对照。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 在 1 号板上进行 CEI 操作

  1. 首先，打开 CEI（材料表）分析仪，然后打开计算机。启动软件（材料表）
  2. 将分析仪连接至在线系统（材料表）。这是收集运行数据以用于故障排查和数据恢复的必要步骤。
  3. 点击左上角菜单中的 仪器，然后点击 连接。在弹出的菜单中选择仪器序列号，点击 连接。
  4. 选择“检测”选项卡，然后选择 新建检测 或选择一个已保存的模板。
  5. 输入检测参数（表 1）或当前修改模板。保存文件名和存储位置。
  6. 确保分析仪上的闪烁蓝色指示灯变为稳定的蓝色。
  7. 按压橙色门顶部的银色金属按钮以打开门。
  8. 小心地从包装中取出毛细管盒，按照制造商的说明将毛细管盒插入。若安装正确，内部指示灯将变为“蓝色”。
  9. 移除检测板上的保护封膜。目视检查预填充孔中是否存在气泡。若发现气泡，使用小移液器吸头（长杆 P10 移液器吸头效果良好）将其刺破。
  10. 将检测板放入板架中并关闭门。在计算机上点击 开始 按钮。
    1. 将装有温度敏感试剂和样品的冰盒置于暗处 4 °C 保存，直至准备第二个预填充板时使用。
    2. 将第二个板所需的试剂/耗材置于室温下放置。

5. 在2号板上进行CEI操作

注意：此板用于分析磷酸化 TDP-43 的水平。

  1. 从4 ˚C冰箱中取出冰盒，放置于实验台上，时间约为第一块板完成前1小时。取出第二块板和配套的芯片盒。
  2. 配制第二轮实验所需的各种抗体稀释液，并置于冰上保存。重新配制新鲜的1:1鲁米诺-S:过氧化物溶液（见上述步骤3.12.8）。
  3. 重新混匀并短暂离心第一块预填充板所需的样品混合物及试剂。按照图1加载第二块板。在C行各孔中加入抗-p(S409-410-2) TDP-43抗体溶液。
  4. 第一轮运行完成后，丢弃第一块板和芯片盒。取下芯片盒并放入锐器盒中处理。保留板和芯片盒上的标签以供后续参考。
  5. 关闭软件文件并重新选择同一模板。软件将自动保留上一轮运行的设置参数。根据需要修改注释信息（例如更换一抗名称）。
  6. 重复步骤4.8–4.10。将12–230 kDa主试剂盒中的分离模块试剂及相关耗材妥善归置。
  7. 根据学校相关规定，丢弃剩余的CEI样品混合液、抗体稀释液、0.1x样品缓冲液以及鲁米诺-S:过氧化物混合液。

6. 数据分析

  1. 运行完成后，确保执行以下质量检查。
    1. 在软件中，选择 显示标准品 图标和 图谱视图 选项卡。检查全部25个毛细管中峰与内部荧光标记大小的对齐情况。通过选择 强制标准品，或右键单击错误的峰并选择 非标准品峰，来校正未对齐的情况。对每个新的毛细管均执行此检查。
    2. 点击 样本 和 单图视图 图标。在实验选项卡中选择第1号毛细管（生物素化分子量标记物）。查看峰与分子量标记物的对齐情况。在 图谱视图 中点击峰，并选择 删除峰，以修正软件错误识别的峰。
      注意：例如，12–230 KDa 的生物素化分子量标记物会在 12 kDa、40 kDa、66 kDa、116 kDa、180 kDa 和 230 kDa 处显示大小标记峰。若未执行此步骤，样本峰的大小测定将不准确，导致结果错误。
    3. 查看电泳过程动画，观察运行过程中是否出现异常迁移现象。
    4. 根据需要导出数据（例如峰表，包括分子量、峰面积、峰高和信噪比 [S/N]）。在 图谱 窗口的右上角提供有图形注释工具，可用于添加有关图谱的更多信息。

结果

血小板胞质蛋白浓度及一抗稀释度的优化
在本实验中，建立血小板胞质蛋白的线性动态范围至关重要，因为信号的变化与血小板胞质中蛋白含量的变化呈正比。使用全血小板裂解液混合物可能导致靶蛋白（TDP-43 和 P(S409-412) TDP-43）信号强度降低，并增加背景信号。因此，本实验采用血小板破裂后的澄清上清液（即胞质组分）（图2）。

全血小板匀浆与胞质组分色谱图；分子量分布分析。
图 2：信号清晰度取决于样本质量。（A）全血小板裂解物匀浆会干扰抗 TDP-43 抗体的结合，因此观察到背景噪声较高的电泳图谱。（B）血小板胞质组分是通过对全裂解物进行离心（16,000 x g，30 分钟）获得的。大部分膜蛋白被去除，因此抗 TDP-43 抗体与 TDP-43 蛋白的结合得到增强（蓝色线迹）。请点击此处查看该图的放大版本。

血小板胞质蛋白浓度的线性动态范围确定为 0.2–0.8 mg/mL。采用一种检测方案模板，可在一次检测中同时完成蛋白浓度测定和一抗滴定（图3）。

蛋白质滴定优化；蛋白-抗体滴定凝胶与动态范围图；电泳。
图3：血小板胞质蛋白浓度的线性动态范围。 （A）在同一运行过程中，于同一块板上同时优化了蛋白浓度和抗体滴定条件。（B）确定了蛋白的线性工作范围（0.2–0.8 mg/mL）。以0.5 mg/mL的蛋白上样量作为阳性对照，由a-ERK抗体进行标记（毛细管25）。请点击此处查看该图的放大版本。

需要注意的是，样品制备管中甘油的含量应低于20%（终浓度），否则高浓度甘油将对一抗结合产生不利影响。

确定最佳曝光时间
在软件的旧版本中，需通过绘制峰面积与蛋白质浓度（mg/mL）的关系曲线来确定最佳曝光时间。新版本提供了一种名为高动态范围（HDR）检测曲线的新工具（图4）。利用图像面板可同时查看所有曝光时间（即 5 s、15 s、30 s、60 s、120 s、240 s、480 s、960 s）。计算机软件分析所有曝光时间，并自动识别出最佳曝光时间（HDR）。由于CEI具有更高的灵敏度，HDR检测曲线可提供显著更宽的动态范围，从而在更宽的样品浓度范围内实现更优的检测与定量效果。然而，用户仍可根据实验目标自主选择任意曝光时间。利用该功能，确定了TDP-43蛋白的最佳曝光时间。图中峰的位置即代表最佳曝光时间（图4A）。在评估了1–512 s范围内的全部九个曝光时间后，为此抗体确定了单一曝光时间（4 s）（图4B）。

高动态范围 (HDR) 与单次曝光色谱图，分子量分析。
图 4：目标蛋白的高动态范围 (HDR) 检测曲线。 （A）TDP-43 蛋白峰代表目标蛋白的最佳曝光时间。抗 TDP-43 抗体（a-TDP-43 Ab）的稀释度为 1:300，血小板胞质蛋白浓度为 0.5 mg/mL。软件定义的蓝线指示最佳曝光时间。（B）该图显示用户在查看了 1–512 秒范围内的全部九个曝光时间后，所设定的单次曝光时间（4 秒）。请点击此处查看该图的放大版本。

肌萎缩侧索硬化症患者血小板胞质中TDP-43的水平
开展了一项基于血液的生物标志物研究。在优化的检测条件下，采用两组抗体对来自肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者的血小板裂解液胞质组分进行分析（即抗TDP-43[Pan]抗体，以及识别TDP-43蛋白磷酸化衍生物的抗体；此处使用的是a-P[S409/410-2] TDP-43抗体）。本实验展示了疾病特异性的TDP-43蛋白及其磷酸化衍生物（图5）。

散点图与小提琴图比较肌萎缩侧索硬化症（ALS）组与对照组的预测性磷酸化值（PPV），并展示Cohen's d效应量。
图5：TDP-43预测性磷酸化值（PPV）的图示。 磷酸化TDP-43的绝对量以及总TDP-43在ALS组与对照组之间差异不明显。然而，PPV在ALS队列中显示出轻微升高，但由于受试者数量不足（ALS = 25，对照 = 27），两组之间无统计学差异。ALS组与对照组均值之间的Cohen's d值较低，表明由于样本量较小（对照 = 25，ALS = 27），两组间的效应量较小。请点击此处查看该图的放大版本。

使用标准曲线对总TDP-43进行定量分析（图6）

TDP-43蛋白定量与分析的化学发光检测图谱及SDS-PAGE凝胶电泳图
图6：标准校准曲线。 使用市售的重组TDP-43蛋白不同浓度构建标准曲线。每个数据点代表三个重复的平均值。蛋白条带强度与浓度呈依赖关系（插图）。请点击此处查看该图的放大版本。

由于该蛋白尚未商业化供应，无法对磷酸化TDP-43蛋白进行定量检测。因此，建立了一个预测性磷酸化值（PPV），用于定义TDP-43磷酸化形式所占的百分比。PPV通过同一份样品连续进行两次CEI检测，并利用以下公式计算得出。

荧光测量的PPV方程；光谱学中科学数据分析的公式。

在汇集的人类肌萎缩侧索硬化症血小板胞质组分中检测了板内和板间检测的变异性（图7）

电泳分析的日内和日间检测变异色谱图，CV% 分析结果，蛋白质分子量。
图 7：检测变异。 （A）使用相同样品加载两个毛细管，通过 CEI 进行分析，计算日内检测变异，CV% = 14.9。 （B）同一样品在三个不同的检测日和三次独立的检测运行中进行分析，计算日间检测变异，CV% = 18.7。 请点击此处查看该图的放大版本。

尽管同一批次内（毛细管间变异）的变异系数处于可接受范围（CV% = 14.9），但批次间检测的变异系数相对较高（CV% = 18.7）。该变异可能源于使用了不同批次的毛细管盒和样品板。建议在具有相同批号的CEI组件中进行重复性研究。

表1：CEI检测板加样模板。 请点击此处下载该表格。

表2：交互式样品混合液制备模板。 输入未知样品的蛋白质储备液浓度后，交互式单元格将自动计算出制备样品混合液所需的体积。请点击此处下载该表格。

讨论

基于毛细管电泳的免疫分析法现已成为高通量样品分析和药物筛选的首选方法25。该方法具有样品用量少、检测组分优化良好、操作平台和仪器用户友好、试剂消耗低以及变异系数（CV）百分比较低等主要优势26,27。尽管在不同检测模式中存在多种蛋白质分离方法，但本文所述的基于抗体的毛细管电泳免疫分析法（CEI）可被从事血液生物标志物开发的小型实验室所采用。本研究所采用的CEI检测技术可对TDP-4328及其磷酸化衍生物5提供可靠、可重复且高灵敏度的定量检测。

CEI 系统还提供多重分析选择，可同时检测 TDP-43 及其磷酸化衍生物，并在有纯化或重组靶蛋白的情况下，实现对目标蛋白的直接定量。全长的重组 TDP-43 蛋白可商业获得，但重组磷酸化 TDP-43 衍生物尚不可获得。由于磷酸化 TDP-43 无法商业化获取，因此引入了预测性磷酸化值（PPV）以评估肌萎缩侧索硬化症（ALS）患者中的 TDP-43 表达谱。总 TDP-43 和磷酸化 TDP-43 的含量均被永久性地标记上荧光染料，因此无论是否使用定量单位（如 ng/mL、pg/mL 等），TDP-43 表达谱均保持一致。尽管测定 TDP-43 及其磷酸化衍生物（如 P[S409-410-12] TDP-43）的绝对含量可提供更精确的定量结果，但计算 PPV 可避免因缺乏可商业获得的重组磷酸化 TDP-43 而带来的标准化难题。

CEI 在检测平台中提供了多个检查点，可准确定位检测失败时的问题所在，从而消除障碍并优化实验设计。该检测流程除加样板的填充外完全自动化，相较于传统的蛋白质印迹分析具有显著优势。此特性确保了不同运行之间的实验一致性。尽管每个实验室都有其独特的标准操作程序，但遵循可最大限度减少人为误差的操作规范至关重要。例如，必须在加样前立即配制鲁米诺-S/过氧化物混合液，因为将过氧化物加入鲁米诺后会启动酶促反应并消耗鲁米诺底物。此外，将样品及一抗/二抗加入孔板时避免产生气泡，也是极为关键的步骤。

此外，由于板孔体积较小且孔之间没有间隙，因此在移液时应格外小心，这是最重要的一步，因为其余步骤均为自动化操作。样品、抗体及其他试剂的加样顺序对检测的一致性至关重要（图1）。板的制备过程大约需要40–45分钟。因此，建议首先将检测所需的组分加入板中，然后在移液前立即配制鲁米诺-S/过氧化物混合液。这样可确保试剂添加顺序的一致性，从而获得稳定的化学发光信号强度。不建议使用过期的鲁米诺-S/过氧化物试剂，因为它主要会影响过氧化物的活性。近年来，通过引入分体缓冲系统以及扩展化学试剂和去污剂的兼容范围，显著提高了检测质量，使结果更加可重复且可预测。目前，同一制造商推出的新款多功能分析仪具备在同一运行中同时分析化学发光和荧光标记抗体样品的功能。这一新功能避免了连续运行两块独立微孔板的需要，消除了批间差异。

检测板应存放在室温条件下。如果选择将检测板保存在4 ˚C冰箱中，则必须在检测前一晚将板取出，并恢复至室温。加样错误的孔在加入正确样本前，需用试剂盒中提供的缓冲液充分清洗4–5次。每种一抗和生物样本均具有独特性，因此在分析生物流体中目标蛋白之前，应先进行抗体/蛋白的优化实验。

此处，默认的一抗孵育时间为30分钟。如果信号较弱，建议用户考虑延长一抗孵育时间，直至达到理想的信号强度，同时避免荧光信号淬灭。对于人血小板样本，采用来自患者的混合样本进行制备并用于优化实验。样本混合能更充分地代表目标生物分子之间的变异情况。建议在CEI检测中使用澄清的上清液，而非全裂解液或全匀浆液。

全血小板裂解液混合物中蛋白质的高浓度可能会降低信噪比（图2）。应避免样本反复冻融，因为这会不利地影响一抗结合。裂解缓冲液的成分至关重要，因为某些试剂与CEI29不兼容。建议在样本制备前，核对生产商网站上提供的兼容试剂列表。这是该系统的一个局限性，即无法耐受高严谨性的样本制备条件。建议使用混合样本优化检测运行参数（例如一抗稀释度、蛋白浓度、一抗孵育时间等），然后再用于分析单个样本。

披露

作者声明不存在竞争性财务利益，除ProteinSimple, Inc.承担了本稿件的出版费用外。

致谢

本研究由授予A.A.的院内基金资助。本工作由美国国立卫生研究院国家转化科学促进中心（NCATS）向堪萨斯大学医学中心授予的临床与转化科学奖（CTSA）资助，用于“前沿：美国中部临床与转化研究所”项目（#UL1TR606381）。本内容仅由作者负责，不代表NIH或NCATS的官方观点。我们感谢堪萨斯大学医学中心肌萎缩侧索硬化（ALS）诊所工作人员协助获得关于从健康志愿者及ALS患者采集血样的伦理审查委员会（IRB）批准。作者感谢Emre Agbas对稿件的校对。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12-230 kDa 分离试剂盒ProteinSimpleSM-W004包含预填充检测板和25通道毛细管卡盒
3000G 梯度PCR仪TechneFTC3G/02用于加热样品混合物
抗小鼠检测试剂盒ProteinSimple042-205包含HRP标记的二抗、缓冲液、鲁米诺试剂和分子量标记物
抗-P(S409-410) TDP-43 抗体ProteinTech22309-1-AP识别磷酸化TDP-43的一抗
抗-P(S409-412) TDP-43 抗体CosmoBio-USATIP-PTD-P02识别磷酸化TDP-43的一抗
抗兔检测试剂盒ProteinSimpleDM-001包含HRP标记的二抗、缓冲液、鲁米诺试剂和分子量标记物
抗-TDP-43（全段）抗体ProteinTech10782-2-AP识别全长TDP-43蛋白的一抗
SimpleWestern（SW）Compass 软件ProteinSimpleVer.4.0.0.用于SimpleWestern仪器的控制与数据分析软件
Sonic Dismembrator；Model100Fisher Scientific超声破碎仪，用于裂解细胞膜。该型号已停产（替代型号为 XL2000-350）
台式离心机Eppendorf22625004型号# 5810，配备摆动板转子
Wes 分析仪ProteinSimple55892-WS-2203执行毛细管凝胶电泳

参考文献

  1. Blair, P., Flaumenhaft, R. Platelet alpha-granules: basic biology and clinical correlates. Blood Reviews. 23 (4), 177-189 (2009).
  2. Mercado, C. P., Kilic, F. Molecular mechanisms of SERT in platelets: regulation of plasma serotonin levels. Molecular Interventions. 10 (4), 231-241 (2010).
  3. Goubau, C., et al. Regulated granule trafficking in platelets and neurons: a common molecular machinery. European Journal of Paediatric Neurology. 17 (2), 117-125 (2013).
  4. Basu, S. S., et al. Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS. Bioanalysis. 5 (24), 3009-3021 (2013).
  5. Wilhite, R., et al. Platelet phosphorylated TDP-43: an exploratory study for a peripheral surrogate biomarker development for Alzheimer's disease. Future Science OA. 3 (4), 238(2017).
  6. Worth, A. J., et al. LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism. Journal of Visualized Experiments. (110), e53941(2016).
  7. Statland, J. M., et al. Rasagiline for amyotrophic lateral sclerosis: A randomized, controlled trial. Muscle and Nerve. 59 (2), 201-207 (2019).
  8. Charytan, D. M., et al. Safety and cardiovascular efficacy of spironolactone in dialysis-dependent ESRD (SPin-D): a randomized, placebo-controlled, multiple dosage trial. Kidney International. 95 (4), 973-982 (2019).
  9. Ugras, S. E., Shorter, J. RNA-Binding Proteins in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Neurodegeneration. Neurology Research International. , 432780(2012).
  10. Amador-Ortiz, C., et al. TDP-43 immunoreactivity in hippocampal sclerosis and Alzheimer's disease. Annal of Neurology. 61 (5), 435-445 (2007).
  11. Baloh, R. H. TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration. FEBS Journal. 278 (19), 3539-3549 (2011).
  12. Buratti, E., Baralle, F. E. The molecular links between TDP-43 dysfunction and neurodegeneration. Advances in Genetics. 66, 1-34 (2009).
  13. Guo, W., et al. An ALS-associated mutation affecting TDP-43 enhances protein aggregation, fibril formation and neurotoxicity. Nature Structural Molecular Biology. 18 (7), 822-830 (2011).
  14. Geser, F., et al. Motor neuron disease clinically limited to the lower motor neuron is a diffuse TDP-43 proteinopathy. Acta Neuropathologica. 121 (4), 509-517 (2011).
  15. Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
  16. Buratti, E., Baralle, F. E. TDP-43: gumming up neurons through protein-protein and protein-RNA interactions. Trends in Biochemical Sciences. 37 (6), 237-247 (2012).
  17. Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. The ALS disease protein TDP-43 is actively transported in motor neuron axons and regulates axon outgrowth. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3703-3718 (2012).
  18. Ayala, Y. M., et al. Structural determinants of the cellular localization and shuttling of TDP-43. Journal of Cell Sciences. 121, Pt 22 3778-3785 (2008).
  19. Fiesel, F. C., Kahle, P. J. TDP-43 and FUS/TLS: cellular functions and implications for neurodegeneration. FEBS Journal. 278 (19), 3550-3568 (2011).
  20. Birsa, N., Bentham, M. P., Fratta, P. Cytoplasmic functions of TDP-43 and FUS and their role in ALS. Seminars in Cell and Development Biology. , (2019).
  21. Liachko, N. F., et al. CDC7 inhibition blocks pathological TDP-43 phosphorylation and neurodegeneration. Annals of Neurology. 74 (1), 39-52 (2013).
  22. Qureshi, A. H., et al. Proteomic and phospho-proteomic profile of human platelets in basal, resting state: insights into integrin signaling. PLoS One. 4 (10), 7627(2009).
  23. Suominen, I., Koivisto, S. Increasing Precision When Pipetting Protein Samples: Assessing Reliability of the Reverse Pipetting Technique. American Laboratory. , (2011).
  24. Pipetting tool box for life sciences. , https://www.mt.com/us/en/home/library/guides/laboratory-division/life-science/pipetting-toolbox-for-life-sciences.html (2019).
  25. Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communication. 9 (1), 5167(2018).
  26. Chen, J. Q., Wakefield, L. M., Goldstein, D. J. Capillary nano-immunoassays: advancing quantitative proteomics analysis, biomarker assessment, and molecular diagnostics. Journal of Translational Medicine. 13, 182(2015).
  27. Moser, A. C., Hage, D. S. Capillary electrophoresis-based immunoassays: principles and quantitative applications. Electrophoresis. 29 (16), 3279-3295 (2008).
  28. Fourier, A., et al. Development of an automated capillary nano-immunoassay-Simple Western assay-to quantify total TDP43 protein in human platelet samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 267-275 (2019).
  29. Compatibility, S.W.S.A.B. , https://www.proteinsimple.com/technical_library.html (2017).

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TDP-43 生物标志物血小板裂解液蛋白质浓度抗体滴定高通量检测血液生物标志物毛细管蛋白质印迹样品制备
利用毛细管电泳免疫分析法在人血小板中寻找肌萎缩侧索硬化潜在生物标志物
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