使用背部皮下聚乙烯醇海绵植入和尾部皮肤切除伤口模型评估急性伤口愈合

摘要

本文介绍了两种小鼠伤口愈合模型，一种用于评估细胞和细胞因子介导的伤口愈合反应，另一种用于量化伤口闭合速率。这些方法可与糖尿病等复杂疾病模型联合使用，以探究伤口愈合不良各个方面的潜在机制。

摘要

伤口愈合是一个复杂的过程，需要经历炎症、肉芽组织形成、纤维化及修复完成等一系列有序的阶段。小鼠模型可为这些过程提供有价值的机制性见解；然而，目前尚无单一模型能够全面涵盖伤口愈合反应的所有方面。因此，理想的做法是采用多种模型来研究伤口愈合的不同方面。本文介绍了两种可分别研究伤口愈合反应不同方面的实验方法。第一种模型是在小鼠背部皮下植入聚乙烯醇海绵。在取出海绵后，可通过机械破碎法分离细胞，并通过离心法提取液体，从而对急性伤口环境中的细胞反应和细胞因子反应进行详细表征。该模型的局限性在于无法评估伤口闭合速率。为此，可采用尾部皮肤切除模型。在此模型中，于尾部背侧近基部处切除一块10 mm × 3 mm的矩形皮肤组织。该模型便于拍照并进行平面测量分析以确定愈合速率，也可进行组织切片以供组织学分析。上述两种方法均可用于基因修饰小鼠品系，或与共病状态模型（如糖尿病、衰老或继发感染）联合使用，以阐明伤口愈合的机制。

引言

目前有多种小鼠模型可用于研究伤口愈合过程，每种模型都有其特定的优势和局限性^1,2。以下方法介绍了两种小鼠伤口模型，每种模型均可针对伤口愈合反应的某一特定方面进行研究，并可用于确定损伤后反应中各种干扰因素的因果关系。伤口愈合过程分为明确的几个阶段。第一阶段为炎症期，其特征是血小板、中性粒细胞以及单核细胞/巨噬细胞迅速浸润，同时产生促炎性细胞因子和趋化因子。随着炎症的消退，微环境转变为更具修复性的状态，促纤维化和促血管生成的细胞因子及生长因子被诱导表达。在此阶段，肉芽组织逐渐沉积，成肌纤维细胞、成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞迁移至伤口部位并形成新生血管。在最后阶段，临时性的细胞外基质被重塑，瘢痕形成并完成伤口闭合^{2,3,4,5,6,7,8}。

目前尚无单一的小鼠模型能够用于研究伤口愈合的所有阶段²。本文介绍了两种外科伤口模型：一种用于阐明急性期的细胞和细胞因子介导的伤口愈合反应，另一种可用于评估伤口闭合情况以及进行组织学分析。这两种方法可互补使用，以评估某种干扰因素或合并症对伤口愈合反应不同方面的效应。聚乙烯醇（PVA）海绵的背部皮下植入是一种已在啮齿类动物模型中使用数十年的系统，用于阐明细胞反应和肉芽组织反应的多个方面^{9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24}。该方法可回收富含细胞因子的伤口液及浸润的细胞。在此模型中，将尺寸为1 cm × 1 cm × 0.5 cm的PVA海绵植入通过背部后正中线2 cm切口所形成的皮下腔隙中。切口使用外科夹闭合，之后可在不同时间点取出海绵以分离细胞和液体。所回收海绵中的细胞与细胞因子微环境可反映植入后约14天内的急性伤口愈合正常阶段。在更晚的时间点，该模型更适用于研究肉芽组织形成及异物反应¹。利用该系统可分离获得>10⁶个细胞，相较于其他基于活检的方法，在细胞表型与功能分析以及RNA提取方面具有明显优势^{1,22,23,25,26}。

使用尾部皮肤切除模型来确定伤口闭合速率。在此模型中，如Falanga等人最初描述并被其他研究者报道的那样^27,28,29,30，在尾根部附近切除一段1 cm × 0.3 cm的全层尾部皮肤。伤口区域易于观察，并可随时间进行测量。此外，也可取尾部组织用于组织学分析。该方法可作为已建立的背部打孔活检法的替代方案，或与其联合使用。这两种模型的主要区别在于伤口闭合速率、是否存在毛发以及皮肤结构^2,31,32。尾部皮肤伤口提供了更长的评估时间窗口，因为完全闭合大约需要21天。相比之下，未加固定环的背部打孔活检愈合更快（约7–10天），主要通过皮下肌（panniculus carnosus）作用引起的收缩实现。加固定环的背部打孔活检愈合较慢，可减弱收缩性愈合的影响，但依赖于异物的存在以限制基于收缩的愈合机制^{1,2,27,30,31,33}。

所述的伤口模型有助于理解在无干扰情况下正常的伤口愈合过程。尽管啮齿类动物皮肤的愈合在许多重要方面与人类皮肤存在显著差异，包括结构疏松、依赖收缩性愈合以及其他解剖学差异，但小鼠系统在机制研究和筛选实验中具有某些优势。其中最主要的优势包括近交系和基因突变体的可获得性、良好的遗传可操作性以及较低的成本。从小鼠研究中获得的机制性认识可进一步推广至更接近人类皮肤愈合的复杂动物模型，例如猪模型^2,31。

除了研究稳态条件下的伤口愈合反应外，这些模型还可与合并症条件相结合，以在细胞、细胞因子和整体组织水平上理解伤口愈合缺陷的机制。正是在这种特定情况下，可联合使用这两种模型，评估某种特定合并症（如术后肺炎）对急性细胞伤口愈合反应以及伤口闭合速率的影响³⁰。

方案

本文所述的所有动物实验均经布朗大学机构动物照护与使用委员会批准，并依照美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》进行。  注意：视频中为演示方便省略了手术巾。 

1. PVA 海绵的皮下植入

1. 使用剪刀将聚乙烯醇（PVA）海绵切成 8 mm × 8 mm × 4 mm 的小块。将PVA海绵块浸入无菌1×PBS中，使其充分水化。
2. 将海绵连同1×PBS一起高压灭菌以实现灭菌，并完全冷却。将灭菌后的海绵保存在4 °C的无菌1×PBS中。
3. 在进行手术植入前，于超净工作台内无菌条件下，将所需数量的海绵转移至无菌培养皿中。多余的海绵应继续保存在4 °C的无菌1×PBS中以备后续使用。确保海绵在水化后膨胀至1 cm × 1 cm × 0.5 cm。脱水状态的PVA海绵图像见图1A。
   注意：为保持手术部位的无菌环境，PVA海绵植入操作需由两人配合完成——一人负责固定小鼠并准备手术区域，另一人执行植入操作。
4. 通过腹腔注射80 mg/kg的氯胺酮对8–12周龄雄性C57BL/6J小鼠进行麻醉。 同时腹腔注射40 mg/kg的赛拉嗪以提供镇痛。 通过检测足底反射是否消失来确认麻醉深度。使用电动剃毛器去除背部毛发以准备手术区域。用无菌纱布将聚维酮碘溶液涂抹于剃毛区域两次，随后使用70%乙醇处理。
5. 将小鼠置于无菌手术巾上，并在手术巾下方放置加热垫以维持小鼠核心体温。
6. 手术过程中佩戴无菌外科手套。用镊子将背部皮肤与皮下组织分离，使用无菌外科剪刀在尾根部前方约2 cm处沿背侧中线做一条长约2 cm的切口。用无菌镊子保持切口开放，再使用无菌弯头钝头外科剪刀沿背部皮下组织创建一个皮下囊腔，位置可参考图1B中标示的任一位置。
7. 继续使用镊子将皮肤与深层组织分离。用无菌外科剪刀轻轻夹取培养皿中的一个PVA海绵，挤去多余PBS。用无菌外科剪刀夹住海绵一角，以该角引导，将海绵置入步骤1.4中创建的皮下囊腔内。
8. 重复此操作共5次，总共植入六个海绵，如图1B所示。
9. 用无菌镊子将切开的背部皮肤对合，使用两枚不锈钢伤口夹闭合切口。
10. 每只小鼠均应使用一套全新的无菌外科器械。或者，在不同小鼠之间使用玻璃珠灭菌器对器械进行灭菌处理。

2. 从PVA海绵中分离液体

1. 为评估急性伤口的细胞因子环境，应在植入后第1–14天之间取出海绵。
2. 通过将5 mL注射器的筒体嵌入16 mL培养管中，制备一个液体收集管。
3. 采用CO₂窒息法处死植入PVA海绵的小鼠，随后进行颈椎脱位。
4. 拆除外科缝合钉，用有齿镊子打开切口，并用剪刀沿背部中线延长切口。
5. 使用镊子从皮下囊中取出一块海绵，并将其转移至已准备好的注射器筒体内，注意尽量减少对海绵施加压力。清除仍附着在海绵表面的结缔组织。如有必要，使用剪刀将海绵从周围组织中分离。对剩余海绵重复上述取出操作。将装有海绵的管子置于冰上。
6. 为分离伤口液，将装有海绵和5 mL注射器的培养管在700 ×g 条件下离心10分钟。
7. 离心结束后，弃去注射器和海绵。伤口液将收集在16 mL培养管中。图1D展示了第7天伤口收集液体的代表性图像。将伤口液转移至洁净管中，于-80 °C长期保存。

3. 从PVA海绵中分离细胞

1. 为评估急性伤口愈合的细胞微环境，应在海绵植入后1–14天内收集海绵。植入后第7天从伤口获取的海绵如图1E所示。
2. 配制收集培养基：在1x HBSS（含钙/含镁/不含酚红）中添加1% FBS、1% HEPES和1%青霉素-链霉素。
3. 将5 mL HBSS收集培养基分装至15 mL锥形管中。
4. 按照2.2–2.4节所述方法，从安乐死的小鼠体内取出PVA海绵，并将其放入含有5 mL HBSS收集培养基的锥形管中。
5. 通过倾倒方式将海绵和HBSS收集培养基转移至80 mL均质袋中。将均质袋悬挂在桨叶式均质机的舱口上，调整位置使桨叶能够击打海绵和培养基。将桨叶式均质机设置为高速运行60秒，然后按下启动键。
6. 使用移液器将均质袋中的液体转移回15 mL锥形管，留下海绵在袋内。挤压海绵以充分释放残留液体。将桨叶式均质机设置为高速运行30秒，向均质袋中加入5 mL培养基，重复均质过程2次，共完成三次海绵洗涤。
7. 将锥形管在250 x g条件下离心5分钟。离心后，可在管底观察到由细胞和红细胞组成的红色沉淀。
8. 弃去上清液并进行红细胞裂解：向细胞沉淀中加入900 μL去离子水（dH₂O），用移液器吹打混匀。随后加入100 μL 10x PBS进行中和。再向管中加入4 mL 1x PBS以彻底中和裂解液，然后在250 x g 条件下离心5分钟。
   注意：裂解步骤应短暂进行；若去离子水与细胞接触超过3–5秒，可能导致非红细胞发生裂解。
9. 离心后，锥形管底部将出现白色细胞沉淀，其中包含已去除红细胞的伤口细胞。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于适合后续分析的培养基中。

4. PVA 海绵伤口分离的天然白细胞可选流式细胞术分析

1. 将 0.5–1 × 10⁶ 个伤口细胞重悬于 25 μL 含阻断抗体的 2x 溶液中，该溶液含 10 μg/mL 抗-CD16/CD32 FcRγII/III 抗体，用 1x PBS + 1% BSA 稀释。
   注意：所有抗体均应进行滴定，以确定流式细胞术分析的最佳浓度。
2. 将细胞与阻断抗体在冰上孵育 10 分钟。
3. 配制含以下抗体的 2x 抗体混合液：PerCP-eFluor710-Ly6G（2.5 mg/mL）、FITC-Ly6C（5 mg/mL）、APC-Fire750-CD45.2、APC-R700-Siglec-F 和 eFluor660-F4-80（10 mg/mL），用 1x PBS + 1% BSA 稀释。直接向正在阻断抗体中孵育的细胞中加入 25 μL 抗体混合液。
4. 将细胞在冰上避光孵育 20 分钟。
5. 用 1x PBS 洗涤细胞两次。
6. 配制胺反应性可固定活力染料 eFluor506 的母液，用 1x PBS 按 1:1,000 稀释。将细胞沉淀重悬于 50 μL 活力染料溶液中。
   注意：可固定活力染色步骤中必须去除血清，否则会阻碍染料与内源性蛋白的结合。将细胞在冰上避光孵育 20 分钟。
7. 用 1x PBS 洗涤细胞两次。将细胞沉淀重悬于 50 μL 1% 多聚甲醛中。
8. 将细胞与 1% 多聚甲醛在冰上避光孵育 15 分钟。
9. 用 1x PBS 洗涤细胞一次，将沉淀重悬于 1x PBS 中，用于流式细胞术分析。

5. 尾部皮肤切除

1. 通过腹腔注射80 mg/kg的氯胺酮对一只8–12周龄的雄性C57BL/6J小鼠进行麻醉。 腹腔注射40 mg/kg的赛拉嗪以提供镇痛。 通过脚掌反射消失确认麻醉深度。
2. 使用无菌纱布将聚维酮碘溶液涂抹于麻醉小鼠尾部手术区域两次，随后用70%乙醇涂抹一次，以准备手术部位。
3. 使用永久性记号笔，参照预先制作的模板，在尾背侧距离尾基部10 mm处划定一个10 mm × 3 mm的区域（图1C）。
4. 将麻醉后的小鼠置于无菌手术单上。
5. 佩戴无菌外科手套进行手术操作。使用无菌手术刀片，沿伤口区域的右侧、底侧和左侧边缘做全层切口。
6. 使用无菌镊子将切除的皮肤从尾部分离，并使用无菌手术剪剪除伤口区域的上缘。
7. 用无菌纱布加压止血。
8. 在创面床喷涂屏障膜。
9. 在固定距离下，定期拍摄伤口照片。通过平面测量法分析照片以确定伤口面积；或者使用游标卡尺测量伤口的长度和宽度。

结果

植入PVA海绵后引发的全身性炎症反应
PVA海绵植入手术可引发全身性炎症反应，表现为损伤后1天血浆中IL-6的表达升高（图2A）。其他促炎性细胞因子，如TNF-α和IL-1β，以及一系列趋化因子，包括CCL2和CXCL1，在PVA海绵植入后的前7天内也出现全身性上调，相关内容已在其他文献中报道^26,30。

PVA海绵伤口中细胞和液体的分离
PVA海绵伤口模型的主要优势在于能够回收足够数量的细胞，用于急性细胞伤口愈合反应的表型和功能分析。从PVA海绵伤口中可回收的细胞数量随时间逐渐增加，从大约2 x 10⁶ 每6块海绵的细胞数，伤口第1天 ×10⁶ 至 8 × 10⁶ 伤口第7天的细胞（图2B细胞数量在...

讨论

本文介绍了两种可行的小鼠伤口模型，可用于评估急性伤口愈合反应。第一种方法涉及将聚乙烯醇（PVA）海绵手术植入背部皮下间隙。与基于活检的伤口模型相比，该方法具有明显优势，因为从分离的海绵中可获得大量细胞和伤口渗出液。为成功实施该操作，必须通过彻底清洁切口周围皮肤来维持无菌手术区域，因为细菌移位进入伤口会显著改变愈合进程。采用本文所述的细胞分离方法，可从PVA海绵中分离出至少1–10 × 10⁶个细胞，具体数量取决于海绵取出的时间。从PVA海绵伤口中分离的大多数细胞具有活性（图2D）。然而，由于机械解离后死亡细胞可能占分离伤口细胞总数的约20%，因此在进行基于流式细胞术的分析时，强烈建议使用细胞活性染料进行染色。根据CD45阳性结果判断，从PVA海绵伤口中分离的细胞主要来源于造血系统（图2D）。中性粒细胞迅速聚集，随后单核细胞和巨噬细胞浸润，这与伤口修复的急性阶段特征一致^3,4

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x 磷酸盐缓冲液	Fisher Scientific	BP3991
15 mL 离心管，Olympus	Genesee	28-103
1x HBSS（含钙、含镁，–不含酚红）	ThermoFisher Scientific	14025076
5 mL 注射器	BD	309646
抗小鼠 CD45.2-APC Fire750	BioLegend	109852	克隆号 104
抗小鼠 F4/80-eFluor660	ThermoFisher Scientific	50-4801-82	克隆号 BM8
抗小鼠 Ly6C-FITC	BD Biosciences	553104	克隆号 AL-21
抗小鼠 Ly6G-PerCP-eFluor710	ThermoFisher Scientific	46-9668-82	克隆号 1A8-Ly6g
抗小鼠 Siglec-F-APC-R700	BD Biosciences	565183	克隆号 E50-2440
Autoclip 不锈钢伤口夹施夹器	Braintree Scientific	NC9021392
Autoclip 不锈钢伤口夹，9 mm	Braintree Scientific	NC9334081
均质袋，80 mL	Fisher Scientific	14258201
培养管，16 mL，17x100	Genesee Scientific	21-130
胎牛血清 - 标准型	ThermoFisher Scientific	10437028
可固定活力染料 eFluor506	ThermoFisher Scientific	65-0866-14
HEPES 溶液，1 M	Genesee Scientific	25-534
ImageJ 软件	NIH
青霉素-链霉素（5000 U/mL）	ThermoFisher Scientific	15070-063
聚乙烯醇海绵 - 大孔径	Ivalon/PVA Unlimited		www.sponge-pva.com
聚维酮碘溶液，10%	Fisher Scientific	3955-16
喷雾屏障膜，Cavilon	3M	3346E
Stomacher 80 Biomaster，110 V	Seward	0080/000/AJ