使用背部皮下聚乙烯醇海绵植入和尾部皮肤切除伤口模型评估急性伤口愈合

摘要

本文介绍了两种小鼠伤口愈合模型，一种用于评估细胞和细胞因子介导的伤口愈合反应，另一种用于量化伤口闭合速率。这些方法可与糖尿病等复杂疾病模型联合使用，以探究伤口愈合不良各个方面的潜在机制。

摘要

伤口愈合是一个复杂的过程，需要经历炎症、肉芽组织形成、纤维化及修复完成等一系列有序的阶段。小鼠模型可为这些过程提供有价值的机制性见解；然而，目前尚无单一模型能够全面涵盖伤口愈合反应的所有方面。因此，理想的做法是采用多种模型来研究伤口愈合的不同方面。本文介绍了两种可分别研究伤口愈合反应不同方面的实验方法。第一种模型是在小鼠背部皮下植入聚乙烯醇海绵。在取出海绵后，可通过机械破碎法分离细胞，并通过离心法提取液体，从而对急性伤口环境中的细胞反应和细胞因子反应进行详细表征。该模型的局限性在于无法评估伤口闭合速率。为此，可采用尾部皮肤切除模型。在此模型中，于尾部背侧近基部处切除一块10 mm × 3 mm的矩形皮肤组织。该模型便于拍照并进行平面测量分析以确定愈合速率，也可进行组织切片以供组织学分析。上述两种方法均可用于基因修饰小鼠品系，或与共病状态模型（如糖尿病、衰老或继发感染）联合使用，以阐明伤口愈合的机制。

引言

目前有多种小鼠模型可用于研究伤口愈合过程，每种模型都有其特定的优势和局限性^1,2。以下方法介绍了两种小鼠伤口模型，每种模型均可针对伤口愈合反应的某一特定方面进行研究，并可用于确定损伤后反应中各种干扰因素的因果关系。伤口愈合过程分为明确的几个阶段。第一阶段为炎症期，其特征是血小板、中性粒细胞以及单核细胞/巨噬细胞迅速浸润，同时产生促炎性细胞因子和趋化因子。随着炎症的消退，微环境转变为更具修复性的状态，促纤维化和促血管生成的细胞因子及生长因子被诱导表达。在此阶段，肉芽组织逐渐沉积，成肌纤维细胞、成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞迁移至伤口部位并形成新生血管。在最后阶段，临时性的细胞外基质被重塑，瘢痕形成并完成伤口闭合^{2,3,4,5,6,7,8}。

目前尚无单一的小鼠模型能够用于研究伤口愈合的所有阶段

方案

本文所述的所有动物实验均经布朗大学机构动物照护与使用委员会批准，并依照美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》进行。  注意：视频中为演示方便省略了手术巾。 

1. PVA 海绵的皮下植入

1. 使用剪刀将聚乙烯醇（PVA）海绵切成 8 mm × 8 mm × 4 mm 的小块。将PVA海绵块浸入无菌1×PBS中，使其充分水化。
2. 将海绵连同1×PBS一起高压灭菌以实现灭菌，并完全冷却。将灭菌后的海绵保存在4 °C的无菌1×PBS中。
3. 在进行手术植入前，于超净工作台内无菌条件下，将所需数量的海绵转移至无菌培养皿中。多余的海绵应继续保存在4 °C的无菌1×PBS中以备后续使用。确保海绵在水化后膨胀至1 cm × 1 cm × 0.5 cm。脱水状态的PVA海绵图像见图1A。
   注意：为保持手术部位的无菌环境，PVA海绵植入操作需由两人配合完成——一人负责固定小鼠并准备手术区域，另一人执行植入操作。
4. 通过腹腔注射80 mg/kg的氯胺酮对8–12周龄雄性C57BL/6J小鼠进行麻醉。 同时腹腔注射40 mg/kg的赛拉嗪以提供镇痛。 通过检测足底反射是否消失来确认麻醉深度。使用电动剃毛器去除背部毛发以准备手术区域。用无菌纱布将聚维酮碘溶液涂抹于剃毛区域两次，随后使用70%乙醇处理。
....

结果

植入PVA海绵后引发的全身性炎症反应
PVA海绵植入手术可引发全身性炎症反应，表现为损伤后1天血浆中IL-6的表达升高（图2A）。其他促炎性细胞因子，如TNF-α和IL-1β，以及一系列趋化因子，包括CCL2和CXCL1，在PVA海绵植入后的前7天内也出现全身性上调，相关内容已在其他文献中报道^26,30。

PVA海绵伤口中细胞和液体的分离
PVA海绵伤口模型的主要优势在于能够回收足够数量的细胞，用于急性细胞伤口愈合反应的表型和功能分析。从PVA海绵伤口中可回收的细胞数量随时间逐渐增加，从大约2 x 10⁶ 每6块海绵的细胞数，伤口第1天 ×10⁶ 至 8 × 10⁶ 伤口第7天的细胞（图2B细胞数量在.......

讨论

本文介绍了两种可行的小鼠伤口模型，可用于评估急性伤口愈合反应。第一种方法涉及将聚乙烯醇（PVA）海绵手术植入背部皮下间隙。与基于活检的伤口模型相比，该方法具有明显优势，因为从分离的海绵中可获得大量细胞和伤口渗出液。为成功实施该操作，必须通过彻底清洁切口周围皮肤来维持无菌手术区域，因为细菌移位进入伤口会显著改变愈合进程。采用本文所述的细胞分离方法，可从PVA海绵中分离出至少1–10 × 10⁶个细胞，具体数量取决于海绵取出的时间。从PVA海绵伤口中分离的大多数细胞具有活性（图2D）。然而，由于机械解离后死亡细胞可能占分离伤口细胞总数的约20%，因此在进行基于流式细胞术的分析时，强烈建议使用细胞活性染料进行染色。根据CD45阳性结果判断，从PVA海绵伤口中分离的细胞主要来源于造血系统（图2D）。中性粒细胞迅速聚集，随后单核细胞和巨噬细胞浸润，这与伤口修复的急性阶段特征一致^3,4

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x 磷酸盐缓冲液	Fisher Scientific	BP3991
15 mL 离心管，Olympus	Genesee	28-103
1x HBSS（含钙、含镁，–不含酚红）	ThermoFisher Scientific	14025076
5 mL 注射器	BD	309646
抗小鼠 CD45.2-APC Fire750	BioLegend	109852	克隆号 104
抗小鼠 F4/80-eFluor660	ThermoFisher Scientific	50-4801-82	克隆号 BM8
抗小鼠 Ly6C-FITC	BD Biosciences	553104	克隆号 AL-21
抗小鼠 Ly6G-PerCP-eFluor710	ThermoFisher Scientific	46-9668-82	克隆号 1A8-Ly6g
抗小鼠 Siglec-F-APC-R700	BD Biosciences	565183	克隆号 E50-2440
Autoclip 不锈钢伤口夹施夹器	Braintree Scientific	NC9021392
Autoclip 不锈钢伤口夹，9 mm	Braintree Scientific	NC9334081
均质袋，80 mL	Fisher Scientific	14258201
培养管，16 mL，17x100	Genesee Scientific	21-130
胎牛血清 - 标准型	ThermoFisher Scientific	10437028
可固定活力染料 eFluor506	ThermoFisher Scientific	65-0866-14
HEPES 溶液，1 M	Genesee Scientific	25-534
ImageJ 软件	NIH
青霉素-链霉素（5000 U/mL）	ThermoFisher Scientific	15070-063
聚乙烯醇海绵 - 大孔径	Ivalon/PVA Unlimited		www.sponge-pva.com
聚维酮碘溶液，10%	Fisher Scientific	3955-16
喷雾屏障膜，Cavilon	3M	3346E
Stomacher 80 Biomaster，110 V	Seward	0080/000/AJ