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方法文章

制备肝脏醇脱氢酶的SNS钴(II)钳形模拟配合物

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DOI：

10.3791/60668

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2020年3月19日

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1Department of Chemistry and Biochemistry, Fairfield University, 2Department of Chemistry, Keene State College

本文内容

摘要

本文介绍了肝脏乙醇脱氢酶的SNS钳形钴(II)模型配合物的制备方法。该配合物可通过配体前体与CoCl2·6H2O反应制得，随后将乙醚缓慢扩散至含有钴配合物的乙腈溶液中，即可实现重结晶。

摘要

化学模型配合物被用于模拟酶的活性位点。在本实验方案中，一类三齿钳形配体前体（每个配体均含有两个硫原子和一个氮原子供体官能团（SNS），并基于双咪唑或双三唑化合物）与 CoCl2·6H2O 反应，生成三齿 SNS 钳形钴(II)配合物。制备用于模拟肝脏乙醇脱氢酶的钴(II)模型配合物操作简便。当将 CoCl2·6H2O 加入含配体前体的乙腈溶液时，溶液迅速发生颜色变化，表明配合物快速形成。将溶液回流过夜后，金属配合物的生成即告完成。这些钴(II)配合物可作为肝脏乙醇脱氢酶（LADH）中锌活性位点的模型。配合物通过单晶X射线衍射、电喷雾质谱、紫外-可见光谱和元素分析进行表征。为了准确确定配合物的结构，必须测定其单晶结构。适合X射线衍射分析的配合物单晶，通过将乙醚蒸气缓慢扩散至含钴(II)配合物的乙腈溶液中生长获得。为获得高质量晶体，重结晶过程通常需持续一周或更长时间。该方法可推广应用于其他模型配位配合物的制备，并可用于本科教学实验课程。最后，预计其他研究者也会发现这种获得单晶的重结晶方法对其研究具有借鉴意义。

引言

本方法的目的是制备LADH的小分子类似物，以进一步理解金属酶的催化活性。LADH是一种二聚体酶，包含一个辅因子结合域和一个含锌(II)金属的催化域1。在辅因子NADH存在下，LADH可将酮类和醛类还原为其相应的醇类衍生物2。在NAD+存在下，LADH可催化醇类氧化为酮类和醛类的逆向反应2。LADH活性位点的晶体结构显示，其锌(II)金属中心与一个来自组氨酸侧链的氮原子以及两个来自两个半胱氨酸配体的硫原子配位3。进一步研究表明，锌金属中心还与一个易解离的水分子配位，从而在金属中心周围形成伪四面体几何构型4。

我们此前已报道并使用了SNS钳形配体前体，并利用ZnCl2对这些配体前体进行金属化，生成含有三齿配体前体的Zn(II)配合物5,6,7。这些配体前体如图1所示。这些锌(II)配合物对缺电子醛具有化学计量还原活性，因此可作为LADH的模型配合物。随后，一系列含SNS配体前体的铜(I)和铜(II)配合物的合成与表征也被报道8,9,10。

尽管乳酸脱氢酶（LADH）是一种锌(II)酶，但我们希望制备LADH的钴(II)模型配合物，以获得更多关于LADH中钴(II)类似物的光谱信息。钴(II)配合物具有颜色，而锌(II)配合物为近白色。由于钴(II)配合物有色，因此可获得其紫外-可见光谱，从而获取有关钴(II)配合物中配体场强度的信息。结合高斯计算结果与实验测得的紫外-可见光谱，可推断出配体场强度的相关信息。钴(II)是锌(II)的良好替代离子，因为这两种离子具有相似的离子半径和相似的路易斯酸性11,12。

本方法涉及合成和表征模型配合物，以尝试模拟乳酸脱氢酶（LADH）的天然催化行为5,6。我们此前曾使用ZnCl2对一系列配体前体进行金属化，构建出LADH的锌(II)模型配合物，成功模拟了LADH中锌活性位点的结构与反应性4。通过多次实验验证，这些钳形配体在不同环境条件下表现出良好的稳定性，并能与多种不同的R基团结合而保持结构稳定5,6。

与单齿配体相比，三齿配体更受青睐，因为三齿配体具有更强的螯合效应，使得金属化反应更为成功。这一现象的原因在于，与单齿配体相比，三齿钳形配体的形成在熵变上更为有利13。此外，三齿钳形配体能够有效防止金属配合物发生二聚，而二聚通常会降低配合物的催化活性，因此避免二聚是有利的14。因此，使用三齿钳形配体在有机金属化学中已被证明是制备具有催化活性且结构稳定的配合物的有效策略。相较于其他类型的钳形体系，SNS钳形配合物的研究较少，因为钳形配合物通常包含第二和第三过渡系的过渡金属15。

对金属酶的这项研究有助于进一步理解其酶活性，这些知识可应用于生物学的其他领域。与替代方法（合成LADH的完整蛋白质）相比，合成模型配合物的方法具有多项优势。首先，模型配合物分子质量较低，但仍能准确模拟天然酶活性位点的催化活性和环境条件。其次，模型配合物更易于操作，并能产生可靠且具有可比性的数据。

本文描述了LADH的两种钴(II)钳形模型配合物的合成制备与表征。这两种配合物均含有一个包含硫、氮和硫供体原子的钳形配体。第一个配合物（4）基于咪唑前体，第二个配合物（5）基于三唑前体。这些配合物在氢供体存在下，对缺电子醛类化合物表现出化学计量还原反应活性。相关反应性结果将在后续论文中报道。

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方案

1. 氯-（η3-S,S,N）-[2,6-双(异丙基-N’-亚甲基咪唑-2-硫酮)吡啶]钴(II)四氯合钴酸盐的合成 [4]

  1. 制备配合物 4：将 0.121 g（3.12 × 10-4 mol）的 2,6-双(N-异丙基-N’-亚甲基咪唑-2-硫酮)吡啶（C19H25N5S2）6 加入 15 mL 乙腈中，置于 100 mL 圆底烧瓶内。随后向该溶液中加入 0.0851 g（3.58 × 10-4 mol）的六水合氯化钴(II)（CoCl2·6H2O）。加入六水合氯化钴(II)后，反应溶液应立即由浅黄色变为翠绿色。
  2. 向烧瓶中加入搅拌子，加热回流并搅拌 反应液 20 小时，以确保反应完全。然后在减压条件下使用旋转蒸发仪除去溶剂。

2. 通过缓慢蒸气扩散法重结晶氯化物-(n3-S,S,N)-[2,6-双(N-异丙基-N’-亚甲基咪唑-2-硫酮)吡啶]钴(II)四氯合钴酸盐[4]

  1. 将溶质溶于乙腈（7.5 mL）中，过滤溶液，并将溶液均匀分装至1 dram小瓶中。每瓶加入1.5 mL乙腈溶液。
    1. 在瓶口加盖棉花，以实现缓慢的蒸气扩散。将棉花紧密地塞入小瓶顶部开口处。
    2. 将小瓶放入盛有50 mL乙醚的240 mL广口瓶中。用瓶盖密封广口瓶。
    3. 静置1周时间使晶体生长。
      注意：重结晶过程可能需要超过1天的时间。

3. 氯-（η3-S,S,N）-[2,6-双(异丙基-N’-亚甲基三唑-2-硫酮)吡啶]钴(II)四氯合钴酸盐[5]的合成

  1. 制备配合物 5：将 0.183 g（4.70 × 10-4 mol）的 2,6-双(N-异丙基-N’-亚甲基三唑-2-硫酮)吡啶（C17H23N7S2）6 加入 100 mL 圆底烧瓶中的 15 mL 乙腈中。向该溶液中加入 0.223 g（9.37 × 10-4 mol）六水合氯化钴（CoCl2·6H2O）。加入六水合氯化钴(II)后，反应溶液应立即由浅黄色变为宝蓝色。
    1. 向烧瓶中加入搅拌子。回流并搅拌反应 20 小时，以确保反应完全。在减压条件下使用旋转蒸发仪除去溶剂。

4. 通过缓慢蒸气扩散法对氯-（η3-S,S,N）-[2,6-双(异丙基-N’-亚甲基三唑-2-硫酮)吡啶]钴(II)四氯合钴酸盐[5]进行重结晶

  1. 将溶质溶于乙腈（9.0 mL）中，过滤溶液，并 将溶液均匀置于1 dram小瓶中，每瓶加入1.5 mL乙腈溶液。
    1. 在离心管口添加棉塞，以实现缓慢的蒸汽扩散。将棉塞紧密地塞入离心管顶部的开口中。
    2. 将小瓶放入含有50 mL乙醚的广口瓶中，用瓶盖密封小瓶。
    3. 让晶体生长1周时间。
      注意：重结晶可能需要超过1天的时间。

5. X射线晶体学

  1. 将化合物 4 的单晶置于尼龙环上，在 Rigaku Oxford Diffraction 衍射仪上收集数据。此处，X 射线衍射数据在 173(2) K 下收集。使用直接法，通过 Olex216 和 ShelXT17 结构解析程序求解晶体结构。采用最小二乘法，利用 ShelXL18 精修程序对结构进行精修。
  2. 将化合物 5 的单晶置于尼龙环上，在 Rigaku Oxford Diffraction 衍射仪上收集 X 射线衍射数据。此处，X 射线衍射数据在 173(2) K 下收集。使用直接法，通过 Olex216 和 ShelXT17 结构解析程序求解晶体结构。采用最小二乘法，利用 ShelXL18 精修程序对结构进行精修。

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结果

合成
配合物4和5的合成通过将含有双硫酮配体前体的乙腈溶液与六水合氯化钴(II)反应成功实现（图2）。该反应在空气存在下于回流温度进行。通常情况下，配合物4和5可溶于乙腈、二甲基亚砜、二氯甲烷和甲醇。配合物4呈绿色，配合物5呈蓝色。配合物4和5的产率均为定量。

X射线晶体学
配合物4和5的单晶通过缓慢蒸气扩散法获得，即将化合物溶解于乙腈中，然后让二乙醚蒸气缓慢扩散进入各溶液。这种重结晶方法非常适合生长难以结晶样品的单晶。表1列出了两种配合物的精修数据，单晶结构分别如

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讨论

配合物4和5的制备较为简便。关键步骤是将固体CoCl2·6H2O加入含有相应配体前体的乙腈溶液中。当加入CoCl2·6H2O后，溶液在数秒内变为深绿色，形成配合物4；而加入CoCl2·6H2O后溶液变为亮蓝色，则形成配合物5。为确保反应完全，将溶液回流过夜。

为了培养配合物4和5的单晶，需要浓缩含有配合物4或5的乙腈溶液。必须将配合物溶解于最小量的乙腈中，以制备尽可能高浓度的溶液。通过将含有配合物4或5的乙腈溶液加入1 dram小瓶中来培养4和5的单晶...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

John Miecznikowski 在本项目中获得了以下机构的经费支持：康涅狄格州 NASA 空间资助联盟（资助编号 P-1168）、费尔菲尔德大学科学研究所、艺术与科学学院出版基金、费尔菲尔德大学教师暑期研究津贴，以及美国国家科学基金会重大研究仪器项目（资助编号 CHE-1827854），该资助用于购置一台 400 MHz 核磁共振波谱仪。他还感谢耶鲁大学的 Terence Wu 在获取电喷雾质谱数据方面提供的帮助。Jerry Jasinski 承认美国国家科学基金会重大研究仪器项目（资助编号 CHE-1039027）为购置 X 射线衍射仪所提供的资金支持。Sheila Bonitatibus、Emilse Almanza、Rami Kharbouch 和 Samantha Zygmont 感谢哈迪曼学者项目为其暑期研究提供的津贴。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 mL 圆底烧瓶Chem GlassCG150691100mL 单颈圆底烧瓶，19/22 外接头
乙腈FisherHB9823-4色谱纯级
旋转蒸发仪用冷却器LaudaL000638Alpha RA 8
六水合氯化钴Acros OrganicsAC423571000Acros Organics
乙醚FisherE-138-1无水乙醚
量筒FisherS6345625 mL 量筒
加热搅拌器Fisher11-100-49SHIsotemp 基础型搅拌加热板
广口瓶Fisher05-719-481250 mL 广口瓶
配体----------先前由 Miecznikowski 教授合成
中号脱脂棉球Fisher22-456-80中号脱脂棉球
一打兰样品瓶Fisher03-339带聚四氟乙烯衬垫盖的一打兰样品瓶
移液管Fisher13-678-20B5.75 英寸移液管
移液管吸头Fisher03-448-21Fisher 品牌乳胶移液管吸头
砂浴用重结晶皿Fisher08-741 D325 mL 砂浴用重结晶皿
回流冷凝管Chem GlassCG-1218-A-22带 19/22 内接头的冷凝管
旋转蒸发仪Heidolph Collegiate36000090Brinkmann；Heidolph Collegiate 旋转蒸发仪，配备 Heidolph WB eco 浴槽
砂浴用海砂Acros Organics612355000洗涤过的砂浴用海砂
搅拌子Fisher07-910-23卵形磁力搅拌子
真空润滑脂Fisher14-635-5DDow Corning 高真空润滑脂
旋转蒸发仪用真空泵Heidolph Collegiate36302830Heidolph Rotovac 阀门控制器

参考文献

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