斑马鱼精母细胞减数分裂染色体铺片的制备

摘要

核表面铺展技术是研究减数分裂过程中染色体事件不可或缺的工具。本文中，我们展示了一种制备和可视化斑马鱼精母细胞减数分裂前期 I 染色体的方法。

摘要

减数分裂是产生单倍体配子以进行有性生殖的关键细胞过程。模式生物在揭示减数分裂前期染色体事件（包括确保染色体正确分离的配对、联会和重组事件）方面发挥了重要作用。尽管小鼠在解析这些过程的分子机制方面是一个重要的模型，但该系统中的并非所有减数分裂事件都与人类减数分裂相似。我们最近展示了斑马鱼作为人类精子发生模型的广阔前景。本文中，我们详细描述了在染色体铺展样品中可视化减数分裂染色体及其相关蛋白的方法。此类样品的优势在于能够对染色体结构进行高分辨率分析。首先，我们描述了从成年斑马鱼中解剖睾丸的操作流程，随后进行细胞解离、裂解以及染色体铺展。接着，我们介绍了通过免疫荧光检测减数分裂染色体蛋白的定位，以及通过荧光原位杂交（FISH）检测核酸序列的方法。这些技术共同构成了在斑马鱼系统中对减数分裂染色质结构进行细胞学分析的一套有用工具。斑马鱼研究领域的科研人员应能迅速掌握这些技术，并将其纳入对生殖功能的常规分析中。

引言

有性生殖通过两个单倍体配子的结合进行，每个配子携带体细胞一半的染色体数目。减数分裂是一种特殊的细胞分裂过程，通过一次DNA复制和两次连续的染色体分离，产生单倍体配子。在减数第一次分裂前期I中，同源染色体（同源染色体对）必须完成配对、重组和联会，其中联会的特征是形成联会复合体，该复合体由两个同源染色体轴通过横丝蛋白Sycp1连接而成（图1A,B）。若这些过程未能正确执行，可能导致非整倍体配子的产生，这是人类自然流产的主要原因之一¹。人们对配对、重组与联会之间协调机制的认识，得益于在多种生物（如酵母、C. elegans、小鼠和Drosophila等）中开展的研究²。尽管同源染色体配对后分离这一基本过程在进化上高度保守，但其对重组和联会的依赖性以及这些事件发生的顺序在不同物种间存在差异。

减数分裂中双链断裂（DSB）的形成启动了同源重组，该过程在细线期期间发生在端粒聚集形成的花束结构附近，随后迅速发生联会^3,4。DSB形成与联会起始的这种空间配置同样是人类雄性减数分裂的特征，但在小鼠中并不存在^5,....

方案

所有涉及斑马鱼的实验方法均按照加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用委员会批准的伦理标准进行。

1. 染色体铺展实验步骤

注意：以下实验方案旨在制备 4–6 张载玻片，每张载玻片上含有数百个分散的减数分裂期细胞核。所需睾丸的数量取决于鱼类的大小。预计在受精后约 60 天（dpf）需使用 20 只动物，受精后约 6 个月（mpf）需使用 15 只动物。对于较大的斑马鱼（例如 12 mpf），10 只动物已足够。需注意的是，某些减数分裂突变体（例如 spo11^-/-）的睾丸会略小³。在本方案中，一批睾丸被视为一个样本。建议平行处理的样本数不超过 4 个。

1. 在开始铺板操作前，配制以下溶液
   注意：为便于后续涂布实验的使用，建议按指定用量预先配制以下溶液。
   1. 将3.42 g蔗糖溶解于100 mL蒸馏水中，配制0.1 M蔗糖溶液。使用pH 8的1 M Tris-HCl将蔗糖溶液调节至pH 8。随后对溶液进行过滤除菌。室温保存。
   2. 配制10倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）储备液，其终浓度为1.37 M NaCl、27 mM KCl、73 mM Na₂HPO₄ 和 27.6 mM KH₂

结果

我们已概述了一种制备和观察斑马鱼精母细胞铺展样品的方法。若操作得当，该方法可获得铺展良好且无重叠的细胞核。为获得此类细胞核，需使用适量的起始材料（即睾丸），并在胰蛋白酶中处理足够时间，同时进行充分的DNase I消化处理。随后可对这些铺展样品进行端粒和减数分裂蛋白染色，以研究减数分裂前期I的进程。图1展示了前期I不同阶段染色体特征染色的铺展样品示例。图4展示了一个铺展不良的细胞核示例。

图1：采用P.......

讨论

本文介绍了检测斑马鱼睾丸中分离的精母细胞核表面铺展样本中端粒及染色体相关蛋白定位的方法。我们预计，通过调整睾丸大小参数，这些方法也可适用于其他硬骨鱼类物种精母细胞的分析。

尽管目前针对斑马鱼减数分裂蛋白产生的抗体较少，但我们成功使用了以下针对人（h）或小鼠（m）蛋白产生的抗体。本实验室已在鸡体内制备了针对斑马鱼Sycp1蛋白（zfSycp1）的抗体，该抗体可稳定标记联会复合体（SC），但该蛋白仅存在于从早期偶线期到晚期粗线期之间，即染色体完全联会的阶段。兔抗人SYCP3抗体（anti-hSYCP3）在检测从细线期到粗线期末期联会复合体解聚前的减数分裂染色体轴时表现非常可靠。图1B，C值得注意的是，我们未观察到典型的双线期，即由Sycp3定义全长轴且Sycp1缺失的阶段，这表明与小鼠不同，染色体轴可能在粗线期结束后即被降解³其他商业可得的针对小鼠、人或斑马鱼减数分裂蛋白且已获得阳性结果的抗体还包括DNA重组/复制相关的兔抗hRAD51和兔抗hR.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 离心管	多个商业品牌可选
1.5 mL 微量离心管架	多个商业品牌可选
16% 甲醛，无甲醇	ThermoFisher Scientific	28908
2 mL	多个商业品牌可选
24 × 50 mm 玻璃盖玻片	Corning	2980-245
24 × 60 mm 玻璃盖玻片	VWR International	16004-312
50 mL 锥形离心管	ThermoFisher Scientific	363696
高压灭菌袋	多个商业品牌可选		用于制作塑料盖玻片。
牛血清白蛋白（BSA）	Fisher Scientific	BP1605-100	用无菌蒸馏水配制 100 mg/mL 储存液。
细胞筛，100 µm	Fisher Scientific	08-771-19
CF405M 山羊抗鸡 IgY（H+L），高度交叉吸附	Biotium	203775-500uL	使用稀释比例为 1:1000
鸡抗 zfSycp1 抗体	Burgess 实验室制备	N/A	使用稀释比例为 1:100
来自Clostridium histolyticum 的胶原酶	Sigma-Aldrich	C0130-500MG
考普林瓶（Coplin jar）	多个商业品牌可选
DNase I，牛胰腺来源，II 型	Roche Diagnostics	10104159001
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Fisher Scientific	MT10014CV
Dumont No. 5 镊子	Fine Science Tools	11252-30	解剖睾丸时需要两把。
Eppendorf 管，5 mL	VWR International	89429-308
甲酰胺	Fisher Scientific	BP228-100
山羊抗鸡 IgY（H+L）二抗，Alexa Fluor 488 标记	ThermoFisher Scientific	A-11039	使用稀释比例为 1:1000
山羊抗鸡 IgY（H+L）二抗，Alexa Fluor 594 标记	ThermoFisher Scientific	A-11042	使用稀释比例为 1:1000
山羊抗人 DMC1 抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-8973	在我们实验条件下无效
山羊抗兔 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记	ThermoFisher Scientific	A-11008	使用稀释比例为 1:1000
山羊抗兔 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 594 标记	ThermoFisher Scientific	A-11012	使用稀释比例为 1:1000
山羊血清	Sigma-Aldrich	G9023-10mL
肝素钠盐	Sigma-Aldrich	H3393-100KU
湿盒（Humidity chamber）	Fisher Scientific	50-112-3683
杂交炉（Hybridization Oven）	VWR International	230401V（型号 5420）
摇床培养箱（Incubator Shaker）	New Brunswick Scientific	型号 Classic C25
KCl	Fisher Scientific	P217-500
Kimwipes 纸巾	Kimberly-Clark Professional	34155	用于湿盒
KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
显微镜	多个商业品牌可选		任何能够提供至少约 1.65 倍放大倍数的标准显微镜均可满足要求。
显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-544-7
鼠抗仓鼠 SCP3 抗体	Abcam	ab97672	在我们实验条件下无效
鼠抗人 MLH1 抗体	BD Biosciences	550838	在我们实验条件下无效
鼠抗人 RPA 抗体	Sigma-Aldrich	MABE285	在我们实验条件下无效
Na2HPO4 · 7 H2O	Fisher Scientific	S373-500
NaCl	Fisher Scientific	S271-3
Photo-Flo 200 溶液	Electron Microscopy Sciences	74257
塑料移液管	多个商业品牌可选
PNA TelC-Alexa647	PNA Bio Inc	F1013	按制造商说明配制。
PNA TelC-Cy3	PNA Bio Inc	F1002	按制造商说明配制。
ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂	ThermoFisher Scientific	P36970
含 DAPI 的 ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂	ThermoFisher Scientific	P36971
兔抗人 RPA 抗体	Bethyl	A300-244A	使用稀释比例为 1:300
兔抗人 SCP3 抗体	Abcam	ab150292	使用稀释比例为 1:200
兔抗人 Rad51 抗体	GeneTex	GTX100469	使用稀释比例为 1:300
柠檬酸钠	Fisher Scientific	S279-500
蔗糖	Fisher Scientific	S5-500
Supercut 剪刀，30° 角，10 cm	Fisher Scientific	50-822-353	也可使用任意小型剪刀。
Sylgard 试剂盒	Fisher Scientific	NC9897184	按制造商说明配制。
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	用无菌蒸馏水稀释配制成 20% 工作液。室温保存。Triton X-100 在水中稀释时会形成沉淀，沉淀过夜溶解。
胰蛋白酶	Worthington Biochemical	LS003708
鸡蛋清来源的胰蛋白酶抑制剂	Sigma-Aldrich	T9253-500MG
Tween 20	Bio-Rad	170-6531	用无菌蒸馏水稀释配制成 20% 工作液。室温保存。
Vannas 弹簧剪刀 - 4 mm（微型剪刀）	Fine Science Tools	15018-10