通过孤立检查视觉诱发电位评估患者早期开角型青光眼

摘要

本研究采用分离检查视觉诱发电位（icVEP）方法，评估在青光眼早期即首先受损的大细胞ON通路。研究展示了使用icVEP获取可靠结果的标准操作流程。该方法已被证实可作为青光眼早期检测的一种有效的客观诊断技术。

摘要

近期，研究设计并报道了一种孤立检查视觉诱发电位（icVEP）技术，该技术可更早且更快地检测青光眼损伤。该方法产生低空间频率/高时间频率的明亮刺激，并记录主要由大细胞ON通路传入纤维引发的皮层活动。该通路中的神经元具有较大的胞体体积和轴突直径，在早期青光眼中优先受损，可能导致视野缺损。本研究所采用的icVEP标准操作流程（SOP）可获得可靠的结果，能够通过信噪比（SNR）检测早期开角型青光眼（OAG）患者的视功能损害，该SNR与视网膜神经纤维层（RNFL）的缺损相对应。选择10 Hz的刺激频率和15%正对比度（明亮）条件以区分OAG患者与对照组受试者，每只眼检查包含八次运行，每次运行持续2秒（共20个周期）。在每次检查前设置30分钟的静息期，并构建流程图，记录瞳孔大小和眼内压的变化。此外，通过规范双眼测试顺序以获取可靠的脑电图信号。视觉诱发电位由软件自动记录和分析，信噪比基于多元统计方法计算得出，SNR ≤ 1被视为异常。采用受试者工作特征（ROC）曲线分析组别分类的准确性。随后，将该标准操作流程应用于一项横断面研究，结果表明icVEP能够以SNR的形式检测中心视野中的青光眼性视功能异常，该数值与RNFL变薄程度相关，并对早期OAG具有较高的分类准确性。因此，icVEP可作为青光眼早期检测的一种有效且客观的诊断技术。

引言

开角型青光眼（OAG）是一种慢性、不可逆的疾病，也是导致失明的主要原因之一。既往研究表明，目前用于检测青光眼性视觉损害的金标准——视野检查，依赖于传统的标准自动视野计（SAP），但其在视网膜神经节细胞（RGCs）损伤达到20%–40%之前，无法检出早期青光眼功能损害^1,2。此外，由于SAP是一种主观的心理物理学检测方法，且对患者而言耗时较长，其重复检测的可靠性也仅处于中等水平³。

在检测青光眼时，客观的电生理视野功能测量方法具有更好的重复性测试可靠性。这类方法包括多焦视觉诱发电位（mfVEP）和图形视网膜电图（pERG）。然而，pERG无法提供拓扑信息，而mfVEP比SAP^4,5,6,7,8更耗时。幸运的是，孤立检查视觉诱发电位（icVEP）最近被设计为一种额外的技术，可用于更早且更快地检测青光眼损伤⁹。

在视网膜中，存在多种视网膜神经节细胞（RGC）亚群，例如大细胞（M-细胞）、小细胞（P-细胞）和双层细胞。这些亚群构成了将视觉信息传递至大脑的平行通路（图1）^9,10。为了分别调控明度和暗度的感知，已建立起ON通路与OFF通路的二分系统^11,12。在人类中，大细胞ON型（M-ON）细胞明显大于大细胞OFF型（M-OFF）细胞，而M-细胞又明显大于P-细胞^13,14。M-细胞通路主要传递低空间频率/高时间频率的信息¹⁵。因此，参与M-ON通路的细胞对低亮度对比度敏感，但对色度信息不敏感，且具有较粗的轴突，这些轴突在青光眼早期易受损伤^16,17。因此，icVEP通过产生低空间频率/高时间频率的明亮刺激，记录主要由传入神经纤维（如M-ON通路中的纤维）引发的皮层活动，用于青光眼的早期检测^{18,19,20,21,22,23}。

方案

本研究经北京大学第三医院伦理委员会审查委员会批准，并符合《赫尔辛基宣言》的规定。

1. 设置

注意：使用每支电子枪配备8位数模转换器的标准显卡时，icVEP硬件需要重新评估有利于M-ON通路的刺激条件。

1. 点击 Test CFG 按钮，然后选择 icvep-bc-8.cfg。
2. 点击 System 按钮，选择 Configuration → Test Configuration，然后点击 Edit Stimulus 按钮。请确保帧率为 60 Hz，显示器静态背景的亮度为 51 cd/m²，总周期数为 20。
3. 为区分原发性开角型青光眼（OAG）患者与对照组受试者，请确保满足以下条件：10 Hz 的正弦时间信号（每周期 6 帧），15% 正对比度（亮刺激，对比度 7.50%，亮度偏移 7.50%，对比度偏移 0.00%）。

2. 检查

1. 选择待测眼，并确保空间模式为24 × 24的孤立棋盘格阵列，覆盖11°视觉视野，中央设置2 × 2阵列的注视十字，不包含正弦时序信号，以引导受试者更轻松且准确地注视屏幕中心（图2）⁹。
2. 根据国际10-20系统，在头皮中线位置放置填充电解质水溶性导电膏的金杯电极（图3）²⁴。确保测试距离为114 cm。
3. 点击开始测试按钮。单次运行持续2 s：前1 s以半强度测试对比度（7.50%）作为适应条件，随后1 s呈现完整测试对比度（15.0%）。
4. 当程序提示错误：离群值，或检测到噪声及脑电图（EEG）片段被拒绝时，需重复该次运行。
5. 当运行被判定为有效，且操作员被提示点击停止测试按钮以根据数据可靠性进行判断时，注意观察操作员显示器上显示的EEG数据。

3. 使用软件进行自动数据处理

注意：数据在记录脑电图信号后，通过离散傅里叶变换计算得出。

1. 请注意，一旦数据被接受，程序将通过一声叮声提示操作者，并自动启动下一次运行，直至累积获得8次有效运行。
2. 请注意，每次运行都会产生一个基频分量（FFC），如果其中一个FFC相对于其余7个为异常值，程序将舍弃该FFC，并提示操作者重复该次运行，直至收集到8次合格的运行数据。
3. 等待程序在几秒内基于8个FFC，使用T²_circ统计量²⁵自动计算出平均FFC及95%置信圆的半径。
4. 确保个体和平均FFC值、置信圆以及信噪比（SNR）在测试结束后的1分钟内自动显示在显示器上（图4A）。

4. 评估结果可靠性的流程图

1. 确保屈光不正已矫正，以适应114 cm的检查距离。
2. 确保检查当天眼内压（IOP）≤ 30 mmHg。
3. 确保瞳孔直径≥ 2 mm，且无散瞳状态。
4. 确保每位受试者在检查前休息并保持安静至少30分钟。
5. 为避免学习曲线的影响，先检查右眼，再检查左眼；随后再次检查右眼和左眼，并记录第二次检查结果。
6. 当双眼之间的R值（鼻环半径）差异> 0.2时，表明结果因情绪波动而不可靠，应在至少休息30分钟后重新检测。

结果

近期研究表明，icVEP用于青光眼诊断的准确率范围为91%–100%^9,22,26。本文展示了在中国开展的横断面研究，旨在进一步评估icVEP在原发性开角型青光眼早期阶段的潜在诊断价值。

研究对象
研究对象为原发性开角型青光眼（OAG）患者和健康志愿者，由北京大学第三医院眼科于2015年至2016年期间招募。OAG患者的纳入标准包括：年龄25至75岁；最佳矫正视力（BCVA）< 0.3（最小分辨角对数，log MAR）；球镜屈光度在-6至+3屈光度之间；以及透明的眼部屈光介质。此外，患者需确诊为OAG（具有开角、与青光眼性视神经病变[GON]相对应的视野缺损，且眼压[IOP]正常或升高但无继发性病因），其IOP经药物治疗控制良好，并具有可靠的视野检查结果（假阳性错误≤20%，假阴性错误≤20%，固视丢失≤30%），且标准自动视野计（SAP）检查显示存在早期青光眼性视野缺损。

对照组受试者的纳入标准包括：无眼部异常，尤其是双眼均无青光眼性视神经病变（GON）；眼压正常，且从未超过21 mmHg。排除标准包括：患有糖尿病或任何其他全身性疾病；有眼部或神经系统疾病史；瞳孔大小不等或瞳孔直径<2.0 mm；固视能力差；目前正在使用可能影响视野敏感度的药物（如乙胺丁醇、羟氯喹、氯丙嗪）；以及既往有眼内手术或屈光手术史。

原发性开角型青光眼诊断检查
所有患者均佩戴眼镜矫正，以减少模糊对视野敏感度的可能影响。在基线期，每位患者至少接受了两次可靠的SAP检测，检测使用Humphrey视野分析仪II 30-2 SITA标准程序进行。本研究采用第二次获得的可靠视野结果，以尽量减少学习效应的影响。²⁷青光眼性视野缺损的早期阶段定义为平均缺损（MD）≥ -6.00 dB，并满足以下至少一项条件：1）在视野的预期受累区域存在≥3个点的簇状缺损 < 5% 水平，其中至少有一个是 < 模式偏差图上1%水平；2) 校正后的模式标准差或模式标准差在p值上显著 < 0.05；3）青光眼半视野检测结果为“超出正常范围”²⁸.

基线检查包括所有受试者的视力和屈光度检测、自然光下用直尺测量瞳孔直径、裂隙灯生物显微镜检查、前房角镜检查、Goldmann 压平眼压测量（GAT）以及散瞳后立体眼底检查。

在获得icVEP检测报告后的第二天，在青光眼门诊服务时间（当地时间上午8点至11点）通过GAT测量基线眼压（IOP）。每位患者还在局部麻醉下通过超声角膜测厚仪进行中央角膜厚度（CCT）测量²⁹。记录连续五次测量的平均值。

每位患者在散瞳后均获取立体眼底照片，并由两名经验丰富的医生以盲法进行评估。两名医生之间的分歧通过协商一致或由第三名经验丰富的医生裁定解决。青光眼性视神经病变（GON）的定义为符合以下至少一项标准：1）上方或下方盘沿的盘沿与视杯比值 < 0.1；2）存在视网膜神经纤维层（RNFL）缺损；3）视盘出现劈裂状出血^30,31。

每位患者还接受了光学相干断层扫描（OCT）检查，以确认视网膜神经纤维层（RNFL）缺损与立体眼底照相和HFA结果相对应。颞上（TS）象限和颞下（TI）象限RNFL厚度的变化按如下方式计算：RNFL厚度变化 = RNFL厚度测量值 - 正常人群数据库中的标准值（图4B）。

统计学分析
当双眼均符合纳入标准时，随机选择一只眼进行分析。每位受试者的所有数据均需在3个月内完成采集。采用SPSS 22.0统计软件包进行统计检验：正态分布的变量使用独立样本t检验；非正态分布的数值变量采用Mann-Whitney U检验；二分类变量则根据需要使用卡方检验或Fisher精确检验进行比较。采用受试者工作特征（ROC）曲线分析评估对青光眼性损害存在的预测准确性³²。采用Pearson相关系数分析SNR与OCT参数之间的相关性，以及SNR与SAP中央11°视野内异常之间的相关性。若p < 0.05，则认为差异具有统计学意义。

结果
共纳入44例OAG患者和39例对照受试者，且均有完整数据。所有受试者在进行icVEP检测时均无不适主诉。83例受试者均为中国人（男性48例，女性35例），平均年龄为48.54 ± 16.70岁（年龄范围25–74岁）。患者组与对照组在年龄、性别、左右眼、BCVA、球镜等效度数或瞳孔直径方面均无统计学差异（表1，p > 0.05），但患者的信噪比（SNR）显著低于对照组（表1，p < 0.05）。

关于icVEP结果，早期OAG患者中有30只眼为SNR阳性（68.18%），而对照组中仅有2只眼为SNR阳性（5.13%）。采用SNR阈值为1的标准，icVEP在诊断早期OAG时的敏感性为68.18%，特异性为94.87%（计算准确率为67/83 [80.72%]）。然而，ROC分析表明，当SNR阈值 先验的 SNR 阈值为 0.93 时，对患者与对照组的区分效果最佳（图5使用信噪比（SNR）阈值为0.93时，该检测的特异性达到100%，灵敏度为65.90%（计算得准确率为82.10%）。

对于患者，中心11°视野检查（HFA，模式偏差，中心16个测试点；图4C）的异常情况根据不同显著性标准下的异常点数量进行计算。当显著性标准为 p < 0.5 时，中心11°视野中异常测试点的数量与信噪比（SNR）呈显著负相关（p < 0.05，r = -0.332，表2）。颞上象限视网膜神经纤维层（RNFL）厚度变化与SNR呈显著正相关（p < 0.05，r = 0.370，表2），而视野平均缺损（SAP-MD）、对侧眼的SAP-MD、颞下象限RNFL厚度变化以及基线眼压（IOP）和中央角膜厚度（CCT）均与SNR无显著相关性（p > 0.05，表3）。

图1：评估M细胞通路的孤立检查视觉诱发电位示意图。 第1层和第2层参与大细胞（magnocellular）通路。第3、4、5和6层参与小细胞（parvocellular）通路。这六层之间的区域参与双层细胞（bistratified cell）通路。RGC = 视网膜神经节细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：孤立检查型视觉诱发电位屏幕上的明亮条件（正对比度）。 本图改编自先前发表的研究²⁴。 请点击此处查看此图的放大版本。

图3：孤立检查型视觉诱发电位检查示意图。 GND = 接地电极；Cz = 中央中线电极；Pz = 顶叶中线电极；Oz = 枕部中线电极。本图改编自先前发表的研究²⁴。 请点击此处查看此图的放大版本。

图4：早期开角型青光眼患者典型的检测结果。（A）异常的孤立性视检查视觉诱发电位结果。（B）光学相干断层扫描报告中视盘周围视网膜神经纤维层厚度（RNFLT）的分类结果。RNFLT变化值 = RNFLT测量值（黑色数字），括号内的绿色数字为正常人群数据库中的标准值。G = 全局；N = 鼻侧；T = 颞侧；NS = 鼻上；TS = 颞上；NI = 鼻下；TI = 颞下。（C）Humphrey视野分析仪30-2 SITA程序中对应中心11°视野的模式偏差点图，共16个测试点。本图改编自先前发表的研究²⁴。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：ROC曲线。 图示为根据开角型青光眼患者与对照组受试者孤立性视检视觉诱发电位信噪比数据绘制的ROC曲线（蓝色）。请点击此处查看该图的放大版本。

	原发性开角型青光眼患者 (n=44)	对照组受试者 (n=39)	p
年龄（岁）	51.59±14.98	44.72±16.88	0.053*
性别（男/女）	28/16	20/19	0.175$
右眼 / 左眼	20/24	19/20	0.770$
最佳矫正视力（log MAR）	0.04±0.06	0.01±0.04	0.093#
球镜等效度数（D）	-1.80±2.16	-1.30±2.00	0.276#
瞳孔直径（mm）	3.43±0.50	3.46±0.51	0.789#
icVEP-SNR	0.85±0.53	1.44±0.57	0.000#
*独立样本t检验，$卡方检验，#Mann-Whitney U检验
OAG：原发性开角型青光眼，BCVA：最佳矫正视力；log MAR：最小分辨角对数；icVEP：孤立性棋盘格视觉诱发电位；SNR：信噪比

表1：原发性开角型青光眼患者与对照组受试者在基线时的临床特征。

异常测试点数量	均值 ± 标准差 (n=44)	r	p*
当 P<5%	4.20±2.60	-0.264	0.099
当 P<2%	2.83±2.34	-0.298	0.061
当 P<1%	2.08±2.12	-0.266	0.097
当 P<0.5%	1.48±1.80	-0.332	0.037
*Pearson 相关性检验
icVEP：孤立性棋盘格视觉诱发电位；SNR：信噪比；SAP：标准自动视野检查

表2：开角型青光眼患者icVEP-SNR与SAP中心11°视野异常之间的相关性。

	均值 ± 标准差 (n=44)	r	p*
SAP-MD (dB)	-3.83±1.26	0.115	0.457
对侧眼 SAP-MD (dB)	-4.86±3.94	-0.15	0.33
OCT-RNFL 厚度变化 (μm)
颞上象限	-39.31±29.89	0.37	0.016
颞下象限	-43.64±29.83	-0.22	0.161
基线 IOP (mmHg)	15.48±2.80	-0.121	0.435
CCT (μm)	523.24±29.64	0.171	0.333
*Pearson 相关性检验
icVEP：孤立性棋盘格视觉诱发电位；SNR：信噪比；SAP：标准自动视野计（HFA 30-2 SITA）；MD：平均缺损；OCT：光学相干断层扫描；RNFL：视网膜神经纤维层；IOP：眼内压；CCT：中央角膜厚度

表3：开角型青光眼患者icVEP-SNR与相关因素的相关性。

讨论

icVEP 的不同设置可刺激不同的 M 细胞通路，并产生不同的脑电图信号。在高时间频率（15 Hz）亮度对比度（16% 正对比度）的 icVEP 条件下，一项纳入 15 名原发性开角型青光眼（OAG）患者和 14 名正常观察者的研究表明，其敏感性为 73.33%，特异性为 100%²²。然而，这些患者中有一半为晚期 OAG 患者。因此，由于样本量较小，无法评估早期 OAG 的敏感性。

Tsai 的研究显示，其敏感性为 78%（在 15% 正对比度和 10 Hz 时间调制条件下），特异性为 100%，ROC 曲线下面积表明准确率为 94%。由于早期青光眼患者具有较低的对比度和空间频率，这些结果优于 Greenstein 的研究。然而，该研究中仅包含 18 名青光眼患者（17 名开角型，1 名闭角型）和 16 名对照者，其中早期原发性开角型青光眼（OAG）患者不足 11 名⁹。

在本研究中，原发性开角型青光眼（OAG）患者仅纳入早期阶段病例，且样本量更大，这表明等效临界视觉诱发电位（icVEP）确实可用于早期OAG的检测 "真实" 早期阶段。约70%的早期原发性开角型青光眼（OAG）眼可通过icVEP检测到，且患者的信噪比（SNR）与正常受试者存在显著差异。

最近一项研究表明，瞳孔大小会影响正常受试者的icVEP结果。icVEP数值受到瞳孔收缩与扩张以及光学模糊的影响³³。这提示在获取icVEP测量结果时，应考虑瞳孔大小和光学模糊的影响，以确保结果解读的准确性。在本研究中，测量了瞳孔大小，并确保所有数值均处于正常范围内。此外，所有脑电（EEG）信号可能受到情绪的影响，从而主要导致假阳性误差。本研究确保受试者在检查当日的眼内压（IOP）≤ 30 mmHg，以避免因高眼压引起的情绪波动。所有患者在每次检查前均休息≥ 30分钟，并进行了重复检查，以排除情绪因素的影响。

信噪比（SNR）定义为快速傅里叶相关（FFC）的平均振幅与95%置信圆半径的比值。SNR为 > 1 表示在 0.05 水平上有显著反应，提示视神经电生理活动正常。信噪比（SNR）≤ 1 表示在 0.05 水平上反应与背景噪声相似或弱于背景噪声，提示视神经电生理活动异常。然而，在本研究中，通过受试者工作特征曲线（ROC 曲线）分析，SNR 为 0.93 时对早期原发性开角型青光眼（OAG）患者与对照受试者的区分效果最佳。因此，在本研究中，采用 SNR 0.93 作为判别标准，可能用于区分早期 OAG 患者视神经损害（GON）的严重程度。

超过50%的M细胞位于黄斑区；因此，若刺激中心凹，则可能产生较强的信号，导致信噪比（SNR）> 1。因此，屏幕上中心位置的2 × 2阵列十字注视点，即使不包含正弦时间信号，也能有效提示受试者保持精确注视，同时避免因注视不良而导致的假阴性错误³⁴。此外，近期的谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）研究证实，在青光眼早期阶段，黄斑区的视网膜神经节细胞（RGCs）即已受到损伤，这是因为视神经乳头受损后引发的蛋白水解及继发性轴突切断可能导致RGC凋亡^35,36,37,38。

本研究基于HFA中模式偏差分析了中央16个测试点，这些点对应于Bjerrum区域的5°-10°范围，该区域分布了近一半的M细胞^{10,11,12,13,14}。研究结果显示，符合不同异常可能性标准的异常测试点数量与信噪比（SNR）呈负相关（负R值）；然而，仅当p < 0.5%时，相关性具有统计学意义，提示icVEP能够检测功能异常，并反映早期原发性开角型青光眼（OAG）中心视野缺损的严重程度。

据报道，在青光眼早期阶段，即使中心视野功能检查未受影响，P细胞和M-ON通路对刺激的反应也已严重受损²⁶。然而，本研究存在一个局限性，即icVEP检测要求患者的BCVA值高于0.3，球镜屈光度在-6至+3屈光度之间，且眼介质透明。该研究仅证明了icVEP在视力较好的早期原发性开角型青光眼（OAG）眼中的应用价值。因此，尚需进一步研究以优化刺激方案，并为视力较差的OAG眼建立更精确的判断标准。这将有助于确定icVEP是否可作为区分青光眼疑似患者以及视野前和早期OAG患者的理想功能检测方法。此外，另一项局限性在于，本研究未考虑优势眼与非优势眼之间的差异。这些通路在两眼间的差异以及对两眼的检测可能影响脑电图（EEG）信号。最重要的是，待进一步研究完成后，该流程图将得到改进。

综上所述，icVEP 能够在近 70% 的早期原发性开角型青光眼（OAG）患者中检测出青光眼性视功能异常，特异性约为 95%。所测得的视功能与标准自动视野计检测的中心 11° 视野缺损严重程度以及光学相干断层扫描（OCT）所测得的视网膜神经纤维层（RNFL）厚度减少均具有相关性。因此，icVEP 可作为诊断早期 OAG 的一种有用且客观的电生理视功能视野检测方法。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CR-2 AF 数字非散瞳眼底相机	Canon U.S.A., Inc., Melville, NY, USA		立体眼底照相
DGH 500 PachetteTM	DGH Technology, Exton, PA, USA		超声角膜测厚
HFA II 750i	Carl Zeiss Meditec Inc., Dublin, CA		Humphrey 视野分析仪 II
Neucodia 新型电生理仪器	Huzhou Medconova Medical Technology Co.Ltd., Zhejiang province, P.R. China		icVEP
Spectralis SD-OCT	Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany		OCT