一种用于评估鱼类福利的标准化偏好测试方案

摘要

评估圈养动物福利的一个基本方面是考察动物是否获得了它们所期望的条件。本文介绍了一种实验方案，用于确定斑马鱼（Danio rerio）对环境丰富化以及对水流获取的 housing 偏好。

摘要

动物福利评估技术力求考虑特定动物的具体需求和偏好。提供环境丰容（在饲养环境中添加物理物体或同种个体）通常是让圈养动物能够自主选择与谁或与什么互动以及如何度过时间的一种方式。然而，在圈养条件下，水生环境中的一个基本要素常常被忽视，即动物自主选择进行体力活动的能力。对于包括鱼类在内的许多动物而言，运动是其生活史中的重要组成部分，并已知具有多种健康益处，包括对大脑和行为的积极影响。本文介绍一种评估圈养动物栖息地偏好的方法。该方案可轻松调整，用于研究不同水生物种或陆生物种的多种环境因素（例如，底质选择砾石或沙子、使用塑料植物或活体植物、水流速度选择低流或高流）。偏好程度的统计评估采用雅各布偏好指数（Jacob's preference index），该指数将栖息地偏好程度从-1（回避）到+1（最偏好）进行分级。通过这些信息，可以从动物福利的角度确定动物的需求，包括其偏好的位置。

引言

关于实验动物在圈养条件下应如何饲养的管理规定明确且具体。国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）负责监督和管理所有涉及实验动物工作的组织与机构，并制定了针对不同物种的适宜饲养与 housing（饲养环境）的具体指南。例如，AAALAC的 斑马鱼（Danio rerio）的饲养与护理指南¹ "强烈鼓励" 在圈养斑马鱼时使用环境丰容（即在饲养环境中添加物理物体或同种个体）。该指南进一步指出， "提供人工植物或模拟斑马鱼栖息地的结构，可使动物在环境中拥有选择权。"

有证据表明，环境富集可以刺激大脑中参与空间信息处理区域的新神经元生成（神经发生）²，并且人们认为这些神经变化与学习能力的增强有关³。环境富集对神经发生和学习的影响已在多种生物类群中得到广泛研究，包括鱼类^4,5、鸟类⁶、爬行动物⁷和哺乳动物⁸。尽管这类研究对于理解环境富集对大脑和行为的影响具有重要意义，但它们并未考虑动物对某一特定环境相对于其他环境的个体选择或偏好。

在评估圈养动物福利时，一个基本问题是动物是否拥有它们想要的东西⁹。要探究这一问题并提供切实证据的一种方法是为动物提供选择机会，从而了解其主观偏好。例如，已有两项研究探讨了斑马鱼是否更倾向于进入丰富化环境还是普通环境，这两项研究均表明斑马鱼更偏爱含有环境丰富化设施的区域^10,11。然而，也有研究指出斑马鱼对环境丰富化似乎表现出无差异¹²，因此该问题的答案显然并不明确。偏好测试在动物福利研究中的另一应用是帮助理解丰富化环境的不同方面如何影响个体动物的选择行为。仅就鱼类而言，不同类型的环境丰富化对大脑和行为具有不同的影响，而个体间在性格特征上的差异进一步加剧了这种关系的复杂性¹³。此外，偏好测试还可用于不同物种间环境丰富化效果的比较研究。即使在不同鱼类物种之间，环境丰富化也被证明会影响多种行为类型，包括攻击性¹⁴、大胆性¹⁵、运动活动¹⁶以及冒险行为¹⁷。

雅各布偏好指数是一种常用于量化动物栖息偏好行为的统计检验方法¹⁸。雅各布偏好指数根据不同时段各生境类型中动物的数量，为每种不同的生境赋予一个数值，其偏好值范围从 -1（回避）到 +1（最偏好）。本文介绍了一种利用雅各布偏好指数研究鱼类栖息偏好的方法，并以评估水生环境中的两个重要特征为例：1）环境丰富性的有无；2）水流状况¹⁹。然而，该实验方案可轻松调整，用于研究多种环境因素（例如，底质类型为碎石与沙子的比较、装饰物为塑料植物与活体植物的比较、水流速度为低流速与高流速的比较），并适用于不同物种及不同生境类型（例如水生与陆生环境）。

方案

本研究已获得宾夕法尼亚州立大学动物护理与使用委员会的批准，并符合其动物护理与使用方案的所有要求；IACUC 编号 46466。

1. 偏好装置的设置

1. 在开始实验之前，须获得研究所动物护理委员会（或同等机构）对所有涉及活体动物的实验和饲养程序的批准。
2. 使用由不透明白色塑料制成的实验水箱。区域之间的隔板由灰色亚克力材料制成，并用硅胶密封剂固定。
   注：实验水箱的尺寸取决于目标物种的大小及所用个体数量（例如，对于8条成年斑马鱼，建议使用76 cm 长 × 76 cm 宽 × 30 cm 高的水箱）。
3. 将实验水箱划分为四个区域，各区域根据待测试的具体生境参数而有所不同。可研究的不同类型环境丰富化示例包括：沙质与岩石基底、人工植物与遮蔽物、水流与人工植物的存在与否（图1）。
   1. 若以水流作为关注参数，可使用小型水泵提供水流喷射（见材料表）。将水泵设定在选定流速，以提供持续且定向的水流。流速的选择应基于目标物种的生态学特征和生活史（例如，斑马鱼建议为14 cm/s）。
4. 在实验水箱中央设置一个用于投放食物的中央区域（图1）。每个区域通过隔板上的小开口通往中央区域。开口应足够大，使目标物种能够无障碍地在各区域间移动，但又足够小，以减少鱼类从其他区域接收到的视觉线索。
5. 在水箱的每个角落放置生物过滤器和加热器，但需位于实验区域之外，以免干扰水流，并确保所有区域的水温保持恒定。
6. 根据空间条件设置额外的实验水箱。在每个实验水箱中轮换不同区域的位置，以减少顺序偏差。确保所有重复水箱具有相同的环境条件（如光照强度、水温等）。
7. 将摄像头（见材料表）安装在三脚架上，并置于每个实验水箱正上方，确保所有区域均在视野范围内。避免使用广角镜头，并确保存储卡有足够的空间用于录像。
8. 将室内照明设置为渐变式（例如，1/2 小时过渡）的12小时光照:12小时黑暗循环，以模拟日出和日落。维持水温在25 ± 1 °C。

2. 捕获、适应与操作步骤

1. 在未进行测试时，将鱼类饲养于各自的家居水族箱中。测试时，用网将所有待测鱼类从其家居水族箱中捞出，并放置于实验水族箱的中央区域（第1天）。尽量缩短捕捞时间以减少应激反应（例如，少于30秒）。
   注意：一种可能减少应激的替代转移方法是将鱼连同水族箱中的水一同倒入烧杯中，再转移至实验水族箱。
2. 在各重复实验水族箱中，保持鱼类数量和性别组成一致，并根据物种的体型和生态特征进行选择。
3. 在第1至第4天，鱼类将用以适应环境并探索不同区域。此期间不进行数据采集。
   注意：可根据具体实验方案适当延长或缩短适应期天数。但适应期应足够长，以最大程度减少操作带来的影响，并使鱼类习惯在实验装置中摄食。
4. 在适应期间，应通过定期检测水质（例如pH、硝酸盐或亚硝酸盐水平）密切监控水质状况，一旦发现问题即更换水体（参见 材料表）。
5. 使用附着于中央区域水体表面墙壁上的浮式饲喂环（参见 材料表），在中央区域投喂薄片饲料（参见 材料表）。饲喂环可确保饲料颗粒保留在中央区域内，避免因饲料漂移而对鱼类区域选择造成偏差。
6. 让鱼类自由摄食0.5小时后，用捞网从实验水族箱中移除剩余饲料。每天上午和下午各饲喂一次。
7. 在第5至第7天进行行为观察。在每次预定的上午和下午饲喂后开启摄像机，连续记录鱼类行为2小时。第8天，用捞网将所有鱼类从实验水族箱中移出，并放回其原有的家居水族箱。
8. 根据蓄水槽中可用水量，至少更换实验水族箱中1/3的水体，补充新鲜的蓄水槽水，以减少应激激素对后续实验批次鱼类的影响。
9. 按照当周的区域轮换计划设置实验水族箱。轮换区域位置可降低因各区域相对位置固定而导致的行为偏好风险。随后，使用新的一批鱼类重新开始测试流程。

3. 测量与数据分析

1. 每次录制结束后，将视频下载到计算机上，以确保每次使用前存储卡有足够的空间。
2. 使用视频分析软件（见材料表）量化区域偏好。在每段2小时的录制时间内，每隔5分钟手动统计每个区域中的鱼类数量（统计时包括中央区域）。若从视频画面中可区分雌雄，则在分析过程中注明鱼类性别。
3. 为分析栖息地偏好，计算每个重复实验缸中各区域的平均鱼类数量（即对连续3天的数据取平均值）。为获得结构利用的偏好评分，计算Jacobs偏好指数¹⁵，公式如下：
   
   J = (r_x − p)/[(r_x + p) – 2*r_x*p]
   
   其中x为关注区域，r_x表示区域x中鱼类数量占所有区域鱼类总数的比例，p表示实验缸中该区域可用空间占所有区域总空间的比例。该指数取值范围为+1（最大偏好）至−1（最大回避）。
4. 为确定在观察期间鱼类在不同区域之间切换的频率是否发生变化，计算每个观察时段前5分钟和后5分钟的切换率r_sr，其中r_sr定义为鱼类从中央区域进入各区域的次数除以鱼类总数。
5. 当鱼体完全穿过分隔区域的开口进入另一区域时，视为已进入该区域。计算每个重复实验缸的起始和结束平均切换率。所有行为观察应由同一名实验人员完成，以减少实验者观察偏差。
6. 使用统计软件（见材料表）进行相关统计分析。建议的分析方法包括以偏好指数为因变量、区域为预测变量的单因素方差分析（one-way ANOVA），以及对每个实验缸起始和结束平均切换率进行配对t检验。
7. 采用Tukey多重比较事后检验进一步分析各区域间的差异，即每两个区域之间均进行比较。更复杂的统计分析可采用混合模型，用于评估时间效应、区域效应、性别效应，甚至个体行为差异。

结果

我们采用偏好测试来研究斑马鱼在不同环境丰富条件下对饲养环境的偏好选择，这些条件包括：1）塑料植物和沙质基底；以及2）水流。实验区域被划分为四个区域：（i）仅丰富环境区；（ii）仅水流区；（iii）丰富环境加水流区；（iv）普通区；以及一个用于投放食物的中央区域¹⁹。斑马鱼对“丰富环境加水流区”的偏好最高，显著高于其他所有区域（仅丰富环境区、仅水流区、普通区和中央区域；p < 0.01）。鱼类回避“仅水流区”和“普通区”，在中央区域停留的时间更长¹⁹（图2A）。此外，斑马鱼在观察期开始阶段在不同栖息区域之间的移动频率高于观察期结束阶段（图2B）。

讨论

本文介绍了一种实验设计，可用于研究鱼类对不同类型栖息地的偏好。在偏好测试中，一些关键步骤至关重要：1）确保不同重复组之间保持条件一致（例如外部噪音或移动、实验人员、水质化学性质、光照强度）；2）在重复组之间轮换区域，并在每次测试之间用大量新鲜的集水槽水替换原有水体，以减少偏差；3）采用适当的样本量，以确保在每组个体数量和重复水族箱数量两方面均能检测到显著结果；4）若对实验过程进行录像，需优化并确保视频录制及文件传输的正确性。

对当前方案的修改包括让鱼类暴露于多种其他生境类型，例如不同的环境丰富化物品、不同的基质，甚至不同的水流速度。此外，或许可以使用动物追踪软件，以进一步了解鱼类如何利用各个区域的空间（例如，在流动区域中，鱼类是否会花费时间逆流游泳，还是完全避开该部分生境）。然而，可能需要对实验水箱的壁面进行改造，以适应此类追踪软件的使用。最后，此处描述的偏好测试可适用于任何鱼类物种，甚至可能适用于实验者希望研究的任何水生生物。

当前方案的一个局限性在于，偏好测试受限于提供给动物的资源。因此，动物可能并非在选择最偏好的选项，而...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人工水族箱植物	Smarlin	B07PDZQ5M5
水族箱用人工海藻水草	MyLifeUNIT	PT16L212
实验水箱	United State Plastic Corporation	6106
漂浮饲料环	SunGrow	B07M6VWH9V
流量计	YSI	BA1100
Jager 水族箱恒温加热器	Ehiem	3619090
Master 水质测试套件	API	34
Macintosh 版 SPSS 统计软件	IBM	Version 25.0
潜水泵，SL-	Songlong	SL-381
TetraMin 热带鱼薄片饲料	Tetra	16106
三重水流角落生物过滤器	Lee's	13405
摄像机	Coleman	TrekHD CVW16HD
Windows Media Player（视频软件）	Microsoft	Windows Media Player 12