本文介绍了一种基于小分子 Shield-1 条件性调控簇状规律间隔短回文重复序列相关蛋白9（Cas9）时空稳定性的基因组编辑工具。该方法可用于培养细胞和动物模型。
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本文内容
摘要
摘要
成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白9（CRISPR/Cas9）技术已成为在基因组中引入精确且靶向性修饰的常用实验工具。与早期技术相比，该技术因其操作简便和高准确性而迅速普及。然而，该系统的组成型激活限制了其应用范围。本文介绍一种基于Cas9蛋白条件性稳定化实现对CRISPR/Cas9活性进行时间调控的新方法。通过将雷帕霉素结合蛋白FKBP12的工程化突变体融合至Cas9蛋白（DD-Cas9），可实现Cas9的快速降解，而该降解过程可通过添加FKBP12合成配体（Shield-1）得以逆转并稳定Cas9蛋白。与其他可诱导系统不同，该系统可轻松改造为双顺反子系统，用于共表达DD-Cas9与另一个目的基因，同时不对第二个基因进行条件性调控。该方法可构建可追踪的系统，并实现由Cas9核酸酶靶向的等位基因进行平行且独立的操控。该技术平台可用于在体外和体内环境中对必需基因进行系统性鉴定与功能表征，并解析基因间的功能相互作用。
引言
CRISPR-Cas9 是 "clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein 9" 的缩写，最初是在细菌适应性免疫系统的研究中被发现的1,2。如今，CRISPR/Cas9 已成为最广为人知的可编程基因编辑工具，该系统的多种改进版本已被开发出来，可用于转录调控和表观遗传修饰3。该技术能够对几乎任何DNA序列进行高度精确的遗传操作4。
CRISPR 基因编辑的核心组分包括可定制的引导 RNA 序列和 Cas9 核酸酶5。该 RNA 引导序列与 DNA 中的靶向互补序列结合，从而引导 Cas9 核酸酶在基因组的特定位点产生双链断裂3,4。随后，该断裂位点通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）进行修复，从而在靶向的 DNA 序列中引入相应的改变5。
基于C....
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方案
1. DD-Cas9 载体
- 从 Addgene 获取 DD-Cas9 载体（含填充序列和 Venus（EDCPV）的 DD-Cas9，质粒编号 90085）。
注意：这是一种慢病毒 DD-Cas9 质粒，含有 U6 启动子以驱动单导向 RNA（sgRNA）的转录，同时 EFS 启动子驱动 DD-Cas9 的转录。Cas9 的 C 末端带有 DYKDDDDK 序列（flag 标签），其后接有 2A 自剪切肽（P2A），用于分隔 DD-Cas9 与修饰的荧光蛋白 Venus（mVenus）。
2. 小向导RNA（sgRNA）设计
- 使用多种算法之一设计将克隆至 DD-Cas9 载体中的小向导 RNA（sgRNA），以靶向特定基因组区域。
注意：为降低脱靶效应，建议通过网站 http://crispr.mit.edu 选择得分最高的 sgRNA 序列。 - 为每条 sgRNA 序列设计并订购两条寡核苷酸，以构建完整的 sgRNA。
注意：由于质粒将被 BsmBI 酶消化，因此在设计正向和反向寡核苷酸时，需在 sgRNA 序列两端添加 BsmBI 酶切黏性末端。请参考表 1中的模板。
3. 将sgRNA克隆至慢病毒DD-Cas9载体
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结果
为了实现 Cas9 的条件性表达，我们开发了一种双慢病毒载体系统，该系统包含一个由 U6 启动子驱动的、用于持续表达 sgRNA 的元件，以及一个由 EF-1α 核心启动子驱动的、用于表达 DD-Cas9 融合蛋白的元件（图1A)19. 为阐明该系统的稳健性与高效性，我们利用慢病毒载体对肺腺癌 A549 细胞系进行了转导。通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和使用抗-Flag 特异性抗体的蛋白质印迹法（Western blot analysis），检测了在有或无配体 Shield-1 存在条件下 Cas9 的表达水平。实验以未感染细胞和模拟感染细胞（载体对照）作为对照组。细胞经 10 至 1000 nM 浓度范围的 Shield-1 处理 7 天。结果显示，Shield-1 能够以显著的剂量依赖方式调控 DD-Cas9 的表达（图1B 和 图2A.......
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讨论
CRISPR/Cas9 技术彻底改变了对基因组进行功能性研究的能力2。然而，基因的失活常常导致细胞死亡、功能缺陷以及发育异常，从而限制了此类方法在基因功能研究中的应用7。此外，Cas9 的持续表达可能导致细胞毒性以及脱靶效应的产生6。目前已开发出多种方法以实现对 CRISPR-Cas9 基因组编辑技术的时间控制6。这些系统主要基于对 Cas9 和/或 sgRNA 的转录调控，或 Cas9 在转录后及翻译后的激活机制21,22,23。作为对这些系统的替代，我们开发了一种基于 Cas9 条件性不稳定化的新颖工具包。
本方案的关键步骤是针对特定基因设计至少两个或三个单导向RNA（sgRNA），以避免脱靶效应并促进高.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
感谢本实验室的前任成员以及科学家Serif Senturk在前期工作中所做出的贡献。感谢Danilo Segovia对本文稿的审阅与批评指正。本研究的开展与完成得益于Swim Across America以及美国国家癌症研究所癌症靶点发现与开发中心项目的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 mM DTT | 赛默飞世尔科技 | ||
| 10X FastDigest缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | B64 | |
| 10X T4 连接缓冲液 | NEB | M0202S | |
| 比色BCA试剂盒 | 皮尔斯 | 23225 | |
| DMEM，高糖，GlutaMax | 赛默飞世尔科技 | 10566024 | |
| FastAP | 赛默飞世尔科技 | EF0654 | |
| FastDigest BsmBI | 赛默飞世尔科技 | FD0454 | |
| Flag [M2] 小鼠单克隆抗体 | Sigma | F1804-50UG | |
| 基因组DNA提取试剂盒 | Macherey Nagel | 740952.1 | |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Phusion高保真DNA聚合酶 | NEB | M0530S | |
| 寡核苷酸 | Sigma Aldrich | ||
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polybrene | Sigma Aldrich | TR-1003-G | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| QIAquick PCR & 凝胶回收试剂盒 | Qiagen | 28506 | |
| 二抗 | LICOR | ||
| Shield-1 | Cheminpharma | ||
| Stbl3 感受态细菌细胞 | 赛默飞世尔科技 | C737303 | |
| SURVEYOR 突变检测试剂盒 | Transgenomic/IDT | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Taq DNA聚合酶 | NEB | M0273S | |
| α微管蛋白 [DM1A] 小鼠单克隆抗体 | Millipore | CP06-100UG |
参考文献
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, New York, N.Y. 816-821 (2012).
- Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats....
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重印与许可
