使用有条件Cas9稳定评估基因功能的新工具包

Summary

在这里，我们描述了一个基因组编辑工具，基于时间和条件稳定聚类定期间歇性短腹膜重复（CRISPR-）相关蛋白质9（Cas9）下的小分子，盾牌-1。该方法可用于培养细胞和动物模型。

Abstract

聚类定期间歇性短回流（CRISPR-）相关蛋白质9（CRISPR/Cas9）技术已成为一种流行的实验室工具，在基因组中引入准确和有针对性的修饰。其巨大的受欢迎程度和快速的传播归因于其易于使用和准确性相比，其前身。然而，该系统的构成激活应用有限。在本文中，我们描述了一种新方法，允许基于Cas9蛋白质有条件稳定对CRISPR/Cas9活性进行时间控制。将拉帕霉素结合蛋白FKBP12的工程突变物与Cas9（DD-Cas9）融合，使Cas9迅速降解，而这种降解又可以通过存在FKBP12合成配体（盾牌-1）来稳定。与其他诱导方法不同，该系统可以很容易地适应生成双系统，以与另一个感兴趣的基因共同表达DD-Cas9，而无需对第二个基因进行有条件的调节。这种方法能够生成可追溯系统，以及Cas9核酸酶靶向的等位基因的平行、独立操作。该方法的平台可用于对基本基因进行系统识别和定性，并研究基因在体外和体内的功能相互作用。

Introduction

CRISPR-Cas9代表"定期间歇性短回流相关蛋白质9"，作为细菌自适应免疫^1，2研究的一部分首次被发现。今天，CRISPR/Cas9已成为可编程基因编辑的最知名的工具，系统中不同的迭代已被开发，允许转录和表观遗传调制^3。这项技术使^DNA4的几乎任何序列都能够进行高度精确的基因操作。

任何CRISPR基因编辑的基本组成部分是一个可定制的指南RNA序列和Cas9核素^5。RNA指南与DNA中的目标互补序列结合，指示Cas9核素在基因组^3、4的特定点进行双链断裂。由此产生的部位然后修复由非同源端连接（ NHEJ ）或同源定向修复（ HDR ），随之而来的是目标 DNA 序列⁵的变化。

CRISPR/Cas9基于基因编辑是易于使用的，相对便宜相比，以前的基因编辑技术，它已被证明既有效又强大的多重系统^2，4，5。然而，这个系统存在一些局限性。Cas9的构成表达经常被证明会导致偏离目标的数量增加和高细胞毒性^{4，6，7，8。}此外，Cas9对基本和细胞生存基因的构成定位剥夺了其进行某些类型的功能研究的能力，如细胞死亡的动能研究^。

已开发了不同的诱导或有条件控制的CRISPR-Cas9工具，以解决这些问题^6，如泰特-ON和泰特-关闭^9:特定地点重组¹⁰:化学诱导的接近^11:因汀依赖拼接^3:和4-羟基甲基雄激素受体（ER）为基础的核定位系统^12。一般来说，这些程序（因汀拼接和化学诱导的接近分割系统）大多不提供可逆的控制，对药物治疗（Tet-On/Off系统）的动能反应非常缓慢，或不适合高通量操纵^6。

为了解决这些限制，我们开发了一个新的工具包，不仅提供快速和强大的时间控制基因编辑，而且还确保可追溯性，可调和适应高吞吐量基因操作。这种新技术可用于细胞系、器官和动物模型。我们的系统基于一个工程领域，当融合到Cas9时，它会导致其快速退化。然而，它可以迅速稳定与高度选择性，无毒，细胞渗透的小分子。更具体地说，我们设计了人类FKBP12突变的"破坏稳定领域"（DD）到Cas9，标志着Cas9通过无处不在的蛋白体系统快速和构成退化时，在哺乳动物细胞¹³表达。DD合成配体，盾-1可以稳定DD构象，从而防止蛋白质的降解融合到DD（如Cas9）在一个非常有效的方式，并与快速动能反应^14，15。值得注意的是，Shield-1与突变的FKBP12的强度比其野生型对应物¹⁴的强度要紧三个数量级。

DD-Cas9/Shield-1对可用于研究培养细胞和动物模型中基本基因的系统识别和表征，正如我们以前通过有条件地瞄准CypD基因所表明的那样，CypD基因在线粒体的新陈代谢中起着重要作用:EGFR，在致癌转化的关键角色;和Tp53，DNA损伤反应中的核心基因。除了时间和条件控制的基因编辑，该方法的另一个优点是DD-Cas9的稳定独立于其转录。此功能可在同一促进器下共同表达可追溯标记以及重组，如雌激素受体依赖重组酶、CRE^ER。在这项研究中，我们展示了我们的方法如何在体外成功使用，以有条件地瞄准DNA复制基因，RPA3。

Protocol

1.DD-Cas9向量

1. 从Addgene（带填充序列的DD-Cas9和金星（EDCPV）、普拉斯米德90085获得DD-Cas9向量。
   注:这是一个带 U6 促进器的扁豆 DD-Cas9 质粒，可驱动单导 RNA （sgRNA） 转录，而 EFS 发起人驱动 DD-Cas9 转录。DYKDDK序列（旗标）存在于Cas9的C终端，然后是2A自裂肽（P2A），它分离DD-Cas9和改性荧光蛋白金星（mVenus）。

2. 小型导引RNA（sgRNA）设计

1. 设计小型导引RNA（sgRNA），通过使用多种算法之一克隆到DD-Cas9向量中，针对特定基因组区域。
   注:为了减少偏离目标的影响，请使用网站选择得分最高的 sgRNA 序列:http://crispr.mit.edu。
2. 设计并订购每个 sgRNA 序列的两个寡核苷酸，以制作完整的 sgRNA。
   注:由于质粒将被BsmBI酶消化，设计前向和反向寡核苷酸，通过添加BsmBI消化悬垂到sgRNA序列。使用 表 1中的模板。

3. 将 sgRNA 克隆成扁豆 DD-Cas9 载体

1. 在限制酶消化反应中使用碱性磷酸酶（FastAP），去磷酰胺将DD-Cas9质粒的5+端除名。
   注:矢量可以在连接过程中重新循环，尤其是当它们被单个限制酶线性化时。为了确保病媒不会重新循环，通过将磷酸酶直接加入消化反应中来去磷酸盐质粒。
   1. 通过准备 5μg 的 DD-Cas9 质粒混合物，用 BsmBI 酶脱磷酰酸盐并消化质粒， 6 μL 的消化缓冲器 （10 倍）， 0.6 μL 的 DTT （100 mM）， 3 μL 的 BsmBI， 3 μL 的 FastAP， 加起来 60 μL 无核酸酶水，使 60 μL 的总反应体积。
      注:将BsmBI酶和快食添加到混合物中。
   2. 在 37 °C 热块或热循环器下孵育混合物 30 分钟。
2. 净化消化的DD-Cas9质粒。
   1. 准备0.8%的DNA阿加罗斯凝胶，以去除未完全消化的质粒和酶的痕迹。使用更宽的凝胶梳子进行更好的分离，并在 90 V 处运行凝胶。
   2. 可视化 360-365 nm 紫外线下的带子，并将较大的质粒带从凝胶中切出。丢弃与填充物对应的 2 kb 片段。
   3. 使用商用凝胶净化套件净化大切凝胶带，并遵循制造商的说明。
3. 利盖特用消化的 DD - Cas9 质粒去功能化寡头。
   1. 磷酸盐和退火的 sgRNA 寡头。
      1. 准备 1 μL T4 Ligation 缓冲器 （10 倍）、 1 μL Oligo 1 （100 μM）、 1 μL Oligo 2 （100 μM）、 6.5 μL 无核酸酶水的混合。最后，添加 0.5 μL 的 T4 PNK。此反应的总容量为 10 μL。
      2. 将反应混合添加到热循环器中，具有以下条件:30 分钟 37 °C，5 分钟 95 °C，然后以 5 °C/分钟的速度降到 25 °C。
         注:在将寡核苷酸放入连体之前，PNK 必须处于热灭活状态，否则 PNK 将对载体进行磷酸化。磷化步骤和退火步骤在热循环器中一起执行。在 sgRNA 寡核苷酸中加入 5' 磷酸盐的磷化步骤是进行连体的必要步骤。
   2. 利盖特 DD-Cas9 消化质粒和 sgRNA 寡头。
      1. 将退火寡头稀释到1:200无核酸酶水中，并在连体反应中使用50ng的质粒DNA。
         注:使用6插入的摩尔比:1向量，促进插入集成或使用连体计算器计算摩尔比:http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation。
      2. 准备连体反应组合:50 ng消化和纯化DD-Cas9载体，适当体积稀释的退火寡头，1微升T4连体缓冲器（10倍），1微升T4脱氧核糖核酸酶，高达10微升无核糖水，以获得反应总容量10微升。
      3. 如果使用"高浓度"韧带，在室温下孵育反应5分钟。否则，在室温下孵育2小时，或达到较高的粘合产量，在16°C的夜间孵育。
         注意:如果在 65 °C 下使用标准 T4 DNA 利加塞 20 分钟，则热灭活。如果您使用韧带主混合物，请不要热灭活。

4. 细菌转化

1. 室温下预热 10 厘米 LB-安非他林阿加板。
2. 解冻 50 μL 的 "一枪 Stbl3" 称职的细菌细胞在冰上。
3. 将 2-3 μL 的结结混合物加入 50 μL 的合格细菌细胞中，然后用手指轻拂管底 4 次，轻轻混合。在冰上孵育30分钟。
4. 使用时间器在 42 °C 下对细胞进行热冲击 40 秒。冷却冰上的细菌细胞5分钟。
5. 在细菌细胞中加入500微升无抗生素的SOC介质，在250 rpm的摇晃培养器中生长45分钟，在37°C下生长。
6. 将100微升转化细菌传播到预热LB-安非他林板上，并在37°C下过夜孵育。

5. 唇膏的迷你/maxi准备

1. 准备 maxi/迷你准备启动器文化。
   1. 第二天选择单个细菌克隆，用含有安培林的 8 mL LB 介质为启动培养接种。
   2. 在 250 rpm、37 °C 10-12 小时的摇晃培养池中培养细菌。
   3. 使用 3-5 mL 的细菌进行迷你准备，或将其用作 maxi 准备的启动培养物。将细菌的其余部分用作细菌甘油库存，在细菌培养比中加入100%甘油:甘油为1:1。
      注意:在这里，我们将描述迷你准备程序。
2. 迷你准备程序
   1. 以 12，000 x g 的 1 分钟收获 3-5 mL 的细菌细胞和离心机。
   2. 用 200 μL 的 P1 缓冲器重新使用细菌细胞颗粒，其中含有 RNase A，并储存在 4 °C 下。
   3. 加入200微升缓冲P2，轻轻倒置管子10次，直到液体清除。
   4. 加入 300 μL 缓冲 P3，通过倒置管子 10 次混合。液体会变得多云。立即以 12，000 x g 的速度离心样品，等待 10 分钟。
   5. 将透明超高超纳特以 12，000 x g 的速度传输到旋转柱和离心机，等待 1 分钟。
      丢弃流过。
      注意:确保超高音符被澄清。粒子会堵塞旋转柱并降低柱的功效。
   6. 在 1 分钟内以 12，000 x g 的速度添加 400 μL 的 PD 缓冲器和离心机。丢弃流过。
   7. 加入 600 μL 的 PW 缓冲器，以 12，000 x g 的速度清洗旋转柱和离心机，1 分钟。丢弃流过。
   8. 以最高速度再次离心旋转柱 3 分钟，以去除缓冲残留物。丢弃流过，让它坐2分钟。
   9. 将旋转柱放入新管中，并添加 50 μL 的放射缓冲。孵育5分钟，离心机以最高速度孵化2分钟。
   10. 使用纳米滴装置用 sgRNA 插入件 （ng/μL） 测量纯化 DD-Cas9 质粒的浓度。
3. 通过DD-Cas9质粒的DNA测序验证sgRNA克隆。在 表2中使用U6引数序列。

6. 伦蒂维拉尔准备

1. 准备 HEK293T 包装单元以进行转染。
   1. 使用健康的 HEK293T 至通过 10，并均匀地播种它们密度 1-2 x^{10 6} 细胞每 10 厘米组织培养板。使用 10 mL 的葡萄糖杜尔贝科的改性鹰介质 （DMEM） 与 10% 过滤胎儿牛血清 （FBS）.在组织培养孵化器中孵化细胞_，20 小时的 CO 2 和 37 °C 为 5% CO 2 和 37 °C。
   2. 第二天，确认细胞通过亮场显微镜达到70%的汇合度，并且它们均匀地分布在板块中。在转染前将介质更改为单元格 1 h，最终体积为 10 mL。
      注:媒体应该缺少抗生素和抗菌剂。
   3. 准备 2 管与 500 μL 的暖介质（例如 OptiMEM）的混合物。
      1. 加入25微升的转染试剂到管1含有温暖的500微升介质，并在室温下孵育5分钟。
      2. 同时准备混合质粒管 2 包含 3.5 μg 的 DD-Cas9 包含克隆 sgRNA，6 μg 的包装质粒 （psPAX2）， 和 3 μg 的信封质粒 （pMD2.G） 到温暖的 500 μL 媒体。
      3. 将管 1 与管 2 混合，形成转染混合物，并在室温下孵育 20 分钟。
      4. 将转染混合物滴入 HEK293T 细胞，并在组织培养孵化器中孵化板，在 5% CO₂ 和 37 °C 过夜。
      5. 18 小时后，小心地将介质换成 10 mL 的新鲜 DMEM，并配以 10% FBS 以去除转染试剂。孵化为下一个 48 小时。
      6. 48 小时后，用 10 mL 注射器收集超高纳特，并通过 0.45 μm 过滤器将其传递。
      7. 阿利奎特和存储病毒超高在 -80 °C.

7. 用流细胞学确定病毒滴答声和转导功效

1. 将 HEK293T 电池与 5 x 10⁵ 细胞/井一起播种到 6 井板中。将种子细胞放入两个6井板中。第二天用一个盘子数数。
2. 在37°C、95%湿度、5%CO₂ 的夜间孵化孵化器中的板，第二天达到50-60%的汇合度。
3. 第二天，使用6井板块中的1个来计算6口井中的细胞。
4. 解冻用于执行串行稀释并添加 8 μg/mL 聚乙烯试剂的病毒阿利奎特。
5. 准备DMEM与10%的FBS病毒的串序稀释，并添加8微克/mL的聚啤酒试剂。
6. 在含聚乙烯的介质中，将扁豆病毒的 10 倍串序稀释从 1 x^{10 -1} 到 1 x 10^{-4 准备 2} mL。
7. 从 6 井板中取出介质，在井中加入 1 mL 的病毒稀释。将一个井与媒体单独作为负控制和一个井与 100% 病毒。
8. 在孵化器中用病毒孵育细胞24小时。
9. 第二天，从 6 井板中取出带有病毒的介质，并将其换成 2 mL 的新鲜 DMEM 和 10% FBS。孵育细胞48-72小时。每天使用荧光显微镜观察GFP。
10. 48-72小时后，分离细胞，并将其重新悬浮在MACS缓冲器中。
11. 使用流细胞仪确定 GFP 表达的百分比。
12. 使用以下公式计算病毒滴答声:TU/mL = （转导的细胞数 x 百分比荧光 x 稀释因子）/（mL 中的转导体积）

8. 目标细胞的伦特维尔转导

1. 将细胞系镀在10厘米的板材上，并在一夜之间孵育，第二天达到50-60%。
   注:我们使用A549细胞系表达DD-Cas9和两个独立的RPA3基因sgRNA。我们还使用A549细胞系表达向量与雷尼拉控制。我们以2×10³细胞/cm² 的密度播种这些细胞，并在37°C、95%湿度、5%CO₂ 的夜间孵育它们，第二天达到50-60%的汇合。我们使用 RPMI 介质与 10% 过滤 FBS。我们继续采取下一步行动，如下所称:
2. 第二天，在10mL培养介质的总体积中感染500-2000微升病毒颗粒的细胞。孵化病毒介质 24 小时。
3. 第二天，将病毒介质更改为培养介质，并使用流细胞学确定 GFP 阳性细胞的百分比。
4. 通过 FACS 细胞排序或使用青霉素选择选择 GFP 阳性细胞。
5. 扩大积极选择的细胞并冻结库存。

9. 有条件地诱导Cas9介导基因编辑

1. 感染后24小时板积极选择细胞，以及未转化细胞分别转入12井板。等待，直到细胞连接和改变介质到包含200 nM的盾-1的细胞培养介质。用转导和未转化的细胞替换板中的介质，每个板材留下 2 口井，并作为负控。
2. 在将盾-1添加到油井后，在不同的时间点从每口井中孵育和提取蛋白质:时间 0、2 小时、6 小时、12 小时、24 小时、48 小时和 72 小时。
3. 然后从其他油井中取出带有 Shield-1 的介质，并将其更改为常规细胞介质。
4. 改变介质后，从这些油井中收集 2 小时、6 小时和 12 小时的蛋白质。
5. 通过西方污点分析可视化不稳定的DD-Cas9蛋白调节的可逆性和快速性后，其配体，盾牌-1的添加和退出。使用定向 DYKDDK 标签的抗体来可视化蛋白质和控制抗体靶向，例如β-图布林。
6. 通过西布洛特分析观察到的剂量响应曲线确定盾-1的最佳剂量。

10. 基因编辑的验证

注:GFP 表达式检测，如流细胞学分析和青霉素选择标记仅确认 CRISPR 试剂交付成功，但它们无法确定所需序列是否成功定位。CRISPR实验确认成功基因靶向的最常见测定是桑格DNA测序、下一代测序、测量师Nuclease测定、分解（TIDE）测定对印德尔的跟踪，或西方斑点分析16、17、18。

1. 板积极选择的细胞和改变介质到200 nM的盾-1包含介质。孵育细胞5天，每3天用盾-1改变介质。
2. 使用上述验证技术后 5 天 DD-Cas9 诱导盾-1。

Results

为了实现Cas9的有条件表达，我们开发了一个双扁豆载体结构，包括一个U6驱动的促进器，构成表达sgRNA，和一个EF-1+核心促进器，以驱动DD-Cas9融合蛋白（图1A）19的表达。作为说明系统的稳健性和效率的范例，我们用扁豆结构转导了肺致病性A549细胞系。Cas9 在配体盾-1 存在或不存在的情况下的水平是通过反转录聚合酶链反应 （RT-PCR） 和使用抗标志特定抗体的西式污点分析来测量的。我们使用未受感染的细胞和模拟感染细胞（车辆）作为对照组。这些细胞的治疗浓度为盾-1，浓度从10到1000nM不等，为7分。如图所示，使用盾-1的治疗能够以强剂量依赖的方式调节DD-Cas9的表达（图1B和图2A）。RT-PCR 分析与 DD-Cas9 的特定引物和甘油醛 3 磷酸盐脱氢酶 （GAPDH） 的控制引物，证实 ...

Discussion

CRISPR/Cas9技术彻底改变了功能性地询问基因组²的能力。然而，基因的灭活往往导致细胞致死性、功能缺陷和发展缺陷，限制了这种研究基因功能的方法的效用^。此外，Cas9 的构成表达可能导致毒性和产生偏离目标的影响^6。已开发出不同的方法，以时间控制CRISPR-Cas9为基础的基因组编辑技术^6。这些系统要么基于Cas9和/或sgRNA的转录控制，要么基于Cas9转录后和转录后激活21，22，23。作为这些系统的替代方案，我们根据Cas9的有条件破坏稳定开发了一种新的工具包。

本协议的关键步骤是为特定基因设计至少两到三个 sgRNA，以避免偏离目标的影响并促进高效的基因编辑。限速步骤是与 DD-Cas9 矢量一...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mM DTT	Thermosfisher
10X FastDigest 缓冲液	Thermosfisher	B64
10X T4 连接缓冲液	NEB	M0202S
比色 BCA 试剂盒	Pierce	23225
DMEM、高葡萄糖、谷胱甘肽 Max	Thermo Fisher	10566024
FastAP	Thermosfisher	EF0654
FastDigest BsmBI	Thermosfisher	FD0454
Flag [M2] 小鼠单克隆抗体	Sigma	F1804-50UG
基因组 DNA 提取试剂盒	Macherey Nagel	740952.1
lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	NEB	M0530S
寡核苷酸	Sigma Aldrich
pMD2.G	Addgene	12259
聚凝胺	Sigma Aldrich	TR-1003-G
psPAX2	Addgene	12260
QIAquick PCR &凝胶纯化试剂盒	Qiagen	28506
二抗	LICOR
Shield-1	Cheminpharma
Stbl3 感受态细菌细胞	Thermofisher	C737303
SURVEYOR 突变检测试剂盒	转基因/IDT
T4 PNK	NEB	M0201S
Taq DNA聚合酶	NEB	M0273S
&α;-微管蛋白 [DM1A] 小鼠 mAb	Millipore	CP06-100UG