基于无标签阻抗的 GPCR 检测中用于提高吞吐量的逐步加量协议

Summary

该协议演示了使用无标签阻抗测量从单个微电极上生长的单个细胞层的激动剂诱导GPCR活化的全剂量-反应关系的实时记录。新的配量方案显著提高了吞吐量，而不会损失时间分辨率。

Abstract

在细胞培养实验中，基于标签的阻抗测定越来越多地用于非侵入性研究配体诱导的GPCR活化。该方法提供实时单元监控，与设备相关的时间分辨率降低至几十毫秒，并且高度自动化。然而，当样本数量变高（例如，不同配体的剂量反应研究）时，一次性电极阵列的成本以及连续井记录的可用时间分辨率可能会受到限制。因此，我们在这里提出了一个串行的激动剂添加协议，它有可能显著增加无标签GPCR检测的输出。使用串行激动剂添加协议，GPCR激动剂按顺序添加到单个细胞层，同时持续监测样品的阻抗（激动器模式）。通过这种串行方法，现在可以从单个细胞层为GPCR激动剂建立一个完整的剂量反应曲线。序列激动剂添加方案适用于不同的GPCR耦合类型，G_q G_i/0或_Gs，与所研究受体的重组和内源表达水平兼容。GPCR 拮抗剂的受体阻塞也是可评估的（拮抗模式）。

Introduction

本报告详细介绍了通过无标签阻抗测量，为在粘附生长细胞中结合诱导的G蛋白耦合受体（GPCR）激活的定量而开发的串行添加方案。G蛋白耦合受体（GPCRs）涉及多种生理功能和人类疾病^1。由于这一点，并且在细胞表面具有良好的可访问性，GPCRs是最重要的药物靶点之一。这一评估反映在估计的700个针对全环苯酚的核准药物数量上，相当于所有上市药物²的35%的份额。

新药的开发包括两个中心过程:（一） 生物靶分子的鉴定和功能表征，和（二）发现新的铅物质及其发展成可管理药物。在这两个过程中，都需要有效的方法来定量评估药物-目标相互作用和随后的生物下游反应。临床前药物开发过程的不同阶段使用不同的分析方法，从药物和目标之间的生物分子相互作用研究，对培养细胞的功能研究，到切除器官材料或整个动物的实验。生理意义和生物复杂性从前者增加到后^3。虽然尽量减少动物实验是总体目标，但使用实验室动物甚至整个动物的分离器官进行药理学研究对于全面描述新药候选者是不可避免的。在分析读出方面，器官药理学研究提供了一个与生理相关性最高的远端、综合的"整体"功能反应。这种实验的一个缺点是，由于技术原因和道德原因，它们与高通量筛选不兼容，并且在很大程度上被基于体外细胞培养⁴的研究所取代。

Protocol

1. 电极阵列上的电池播种

注:选择电极布局是灵敏度和所研究的电池数量之间的权衡。电极越小，测量越敏感，但所研究的细胞数量越小。对于在基线条件下随时间显示强阻抗波动的电池，更可取的是较大的或数字间电极。

1. 在 37°C 水浴中预加热标准细胞通过和播种所需的所有解决方案。对于人体U-373 MG细胞的检测，它需要:不含钙和镁的磷酸盐缓冲盐水（PBS），0.05%（w/v）胰蛋白酶，细胞培养基（Eagle的最小基本介质（EMEM）辅以5%（v/v）胎儿小牛血清（FCS），2mM L-谷氨酰胺和100μg/mL青霉素/链霉素）。
2. 用PBS冲洗传统细胞培养瓶或菜肴底部生长的库存培养液的细胞层。
3. 取出PBS，加入胰蛋白酶溶液（1 mL代表25cm^2），让细胞在37°C孵育5分钟（适用于U-373 MG细胞）。
4. 通过显微镜控制细胞从生长基底完全分离。
5. 停止胰蛋白酶反应，只要细胞完全分离，添加9 mL的细胞培养基每1mL的胰蛋白酶到细胞悬浮液。通过移液在基板上的悬浮液，仔细冲洗细胞培养基底中的剩余细胞。
6. 用移液器收集细胞悬浮液并将其转移到离心管（15 mL 或 50 mL 管）。
7. 在室温下，在110 x g下通过离心使细胞旋转10分钟。
8. 在计算细胞之前，小心地去除上清液并彻底重新悬浮培养基中的细....

Results

在表1-4中，使用8井电极阵列，将组胺作为激动剂的实验，展示了一种制备各种激动剂溶液的典型方案。表 1和表 2提供了使用加法模式1的实验的体积和浓度（参见图 1），而表 3 和表 4则显示添加模式 2之后的实验的体积和浓度（参见图 1）。数据是使用方程 （1） 计算的。

图2显示了一个代表性的实验，用于U-373 MG细胞的汇层，该细胞内敏地表达组胺1受体，在8孔电极阵列上生长，工作电极直径为250μm，使用组胺作为激动剂。测量以12 kHz的单频进行。在模式1之后执行激动剂浓度系列的添加。在选定的实验中，每15分钟按顺序添加10种增加组.......

Discussion

该协议描述了一种无标签阻抗测量方法，以确定在无电激动剂诱导的GPCR活化或存在同一受体的特定拮抗剂时的剂量-反应关系。该方法的概念证明在最近出版的^第12号出版物中提出。据我们所知，这是第一个研究描述使用体外单细胞层建立激动剂介导的GPCR活化的全剂量反应曲线。该方法不可避免地需要使用无标签细胞监测方法，并且不适用于端点检测。

该协议已在U-373 MG细胞的例子中得到了证明，该细胞内源表达人体组胺1受体（hHR1），在不断记录细胞阻抗时，其内源性激动剂组胺的浓度增加而刺激。为了证明该协议对拮抗剂研究的适用性，在存在一种恒定浓度的二苯胺（hH1R的竞争性拮抗剂）的情况下重复了这些实验。除了此处显示的示例外，还成功地用于研究其他 H1R 激动剂（例如，UR-KUM530^11、单步进给剂）和拮抗剂（例如，Mepyramine）12。此外，该协议还应用于其他细胞系和受体，例如CHO-D2R表达多巴胺D2受体（D2R）或BAEC表达_β2-<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bürker 计数室	Marienfeld （Lauda-Königshofen，德国）	640210
培养瓶25 cm2	Greiner bio-one（Frickenhausen，德国）	690175
细胞培养箱（Heraeus Function Line BB15）	Thermo Scientific（德国达姆施塔特）	\
机（Heraeus 1S-R）	Thermo Scientific（德国达姆施塔特）	\
盐酸苯海拉明	Sigma Aldrich（德国陶夫基兴）	D3630
Eagle 最低必需培养基，含 4.5 g/L D-葡萄糖和 2.2 g/L NaHCO3	Sigma Aldrich（德国陶夫基兴）	D5671
阻抗仪器 （ECIS Zθ）	Applied BioPhysics Inc. （美国纽约州特洛伊市）	\
8 孔电极阵列 （8W1E PET）	Applied BioPhysics Inc. （Troy， NY， USA）	\	PET 基座，具有 0.049 mm2 工作电极和 ~50 mm2 对电极（金）
96 孔电极阵列 （96W1E+ PET）Applied	BioPhysics Inc. （Troy， NY， USA）	\	PET 底座，带两个电极（金），总电极面积为 0.256 mm2
牛血清 （FCS）	Biochrom（德国柏林）	S0615
盐酸组胺	Carl Roth（德国卡尔斯鲁厄）	4017.1
层流罩（Herasafe，KS 12）	Thermo Scientific（德国达姆施塔特）	51022515	II 级安全柜
Leibovitz' L-15 培养基	Thermo Scientific（德国达姆施塔特）	21083-027
L-谷氨酰胺	Sigma Aldrich（德国陶夫基兴）	G7513
微量移液器大（100 - 1000 µL）	Brandt （德国韦特海姆）	704780
微量移液器 大 （20 - 200 & 微量;L）	Brandt（德国韦特海姆）	704778
显微镜（相差，尼康透射	尼康（Dü德国塞尔多夫）
青霉素/链霉素	Sigma Aldrich（德国陶夫基兴）	P0781
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Sigma Aldrich（德国陶夫基兴）	D8537
血清	学 Greiner bio-one 移液器（德国弗里肯豪森）	607 180
移液器 （accu-jet pro）	Brandt（德国韦特海姆）	26300
胰蛋白酶	Sigma Aldrich（德国陶夫基兴）	PBS 中的 T4174	含 1 mM EDTA
管、15 mL	Greiner bio-one（德国弗里肯豪森）	188 271
管、50 mL	Greiner bio-one（德国弗里肯豪森）	210 261
U-373 MG 细胞	ATCC（美国马里兰州罗克维尔）	ATCC HTB-17
水浴 （TW21）	Julabo（Seelbach， 德国）	\