本方案展示了利用无标记阻抗检测技术，从生长在单个微电极上的单层细胞中实时记录激动剂诱导的G蛋白偶联受体（GPCR）激活全过程剂量-反应关系的方法。新的加样方案在不损失时间分辨率的前提下显著提高了通量。
本方案展示了利用无标记阻抗检测技术，从生长在单个微电极上的单层细胞中实时记录激动剂诱导的G蛋白偶联受体（GPCR）激活全过程剂量-反应关系的方法。新的加样方案在不损失时间分辨率的前提下显著提高了通量。
无标记阻抗检测方法正越来越多地用于在细胞培养实验中非侵入性地研究配体诱导的 G 蛋白偶联受体（GPCR）活化。该方法可实现对细胞的实时监测，设备依赖的时间分辨率可达数十毫秒，并具有高度自动化的特点。然而，当样本数量较大时（例如针对多种不同配体的剂量-反应研究），一次性电极阵列的成本以及逐孔顺序记录时可获得的时间分辨率可能成为限制因素。因此，本文提出一种连续激动剂添加方案，有望显著提高无标记 GPCR 检测的产出效率。采用连续激动剂添加方案，可在持续监测样本阻抗的同时，将 GPCR 激动剂以递增浓度依次加入同一细胞层中（激动剂模式）。通过这种连续方法，现在仅需一个细胞层即可建立完整的 GPCR 激动剂剂量-反应曲线。该连续激动剂添加方案适用于不同类型的 GPCR 耦合方式，包括 Gq、Gi/0 和 Gs，并可兼容受体在重组表达或内源性表达水平下的检测。同时，也可评估 GPCR 拮抗剂对受体的阻断作用（拮抗剂模式）。
本报告详细描述了一种序列加样方案，该方案通过无标记阻抗检测技术，用于定量测定贴壁生长细胞中配体诱导的G蛋白偶联受体（GPCR）活化。G蛋白偶联受体（GPCRs）参与多种生理功能及人类疾病1。由于其在细胞表面易于接触且功能重要，GPCRs成为最重要的药物靶点之一。这一评估体现在目前约有700种获批药物以GPCRs为靶点，占所有上市药物的约35%2。
新药研发包含两个核心过程：（i）生物靶点分子的鉴定与功能表征，以及（ii）新型先导化合物的发现及其向可给药药物的开发。在这两个过程中，均需要高效的方法来定量评估药物与靶点之间的相互作用及其引发的后续生物学下游反应。临床前药物研发的不同阶段采用不同的分析方法，范围从药物与靶点之间的生物分子相互作用研究，到细胞培养的功能研究，再到离体器官组织或整体动物的实验。从前者到后者，其生理意义和生物学复杂性逐步增加3。尽管总体目标是尽量减少动物实验，但使用实验动物的离体器官甚至整体动物进行药理学研究仍被视为全面表征新药候选物所不可或缺的手段。在分析检测方面，器官药理学研究提供了具有最高生理相关性的远端、整合性"整体性"功能反应。此类实验的一个缺点是，出于技术和伦理原因，无法适用于高通量筛选，因此在很大程度上已被基于体外细胞培养的研究所取代
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1. 在电极阵列上接种细胞
注意：电极布局的选择需要在灵敏度和研究细胞数量之间进行权衡。电极越小，测量灵敏度越高，但可研究的细胞数量越少。对于在基础条件下随时间表现出强烈阻抗波动的细胞，建议使用较大或叉指状电极。
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使用组胺作为激动剂，在8孔电极阵列上进行实验时，各种激动剂溶液的典型配制方案见表1-4。表1和表2列出了采用加样模式1（参见图1）的实验所需的体积和浓度，而表3和表4则列出了采用加样模式2（参见图1）的实验所需的体积和浓度。数据由公式(1)计算得出。
一个代表性实验如图所示 图2 对于在8孔电极阵列上培养的U-373 MG细胞融合层，该细胞内源性表达组胺1受体，其工作电极为 250 µm 使用组胺作为激动剂测定血管直径。测量在12 kHz的单一频率下进行。激动剂浓度梯度的添加按以下步骤进行 模式1在选定的实验中，依次每15分钟加.......
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本方案描述了一种无标记阻抗检测方法，用于确定激动剂诱导的G蛋白偶联受体（GPCR）激活在有或无特异性拮抗剂存在情况下的剂量-反应关系。该方法的概念验证已在近期发表的研究中得到证实12。据我们所知，这是首次报道利用单层体外细胞建立激动剂介导的GPCR激活完整剂量-反应曲线的研究。该方法必然需要采用无标记的细胞监测技术，因此不适用于终点检测实验。
本方案以U-373 MG细胞为例进行了演示，该细胞内源性表达人组胺1受体（hHR1），通过一系列浓度递增的内源性激动剂组胺进行刺激，同时连续记录细胞的阻抗变化。为验证该方案在拮抗剂研究中的适用性，实验在存在恒定浓度的苯海拉明（一种hH1R的竞争性拮抗剂）条件下重复进行。此外，阻抗记录技术已成功用于研究其他H1R激动剂（如UR-KUM53011，单次及逐步给药）和拮抗剂（如美吡拉明）12，除本文所示示例外。同时，该方案也已应用于其他细胞系和受体，例如表达多巴胺D2受体（D2R）的CHO-D2R细胞或表达.......
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作者无任何利益冲突需要披露。
我们感谢 Barbara Goricnick 和 Nadja Hinterreiter 在细胞培养及实验溶液制备方面的帮助。作者谨此感谢研究培训组 1910 提供的经费支持。 "选择性G蛋白偶联受体配体的药物化学" 由德国研究基金会（DFG）资助，项目编号222125149。JAS特别感谢巴伐利亚州性别平等计划提供的奖学金。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Bü血细胞计数板 | 马里恩费尔德（劳达-科ö尼格斯霍芬，德国 | 640210 | |
| 25 cm 细胞培养瓶2 | Greiner bio-one（德国弗里克海姆） | 690175 | |
| 细胞培养箱（Heraeus Function Line BB15） | 赛默飞世尔科技（德国达姆施塔特） | \ | |
| 离心机（Heraeus 1S-R） | 赛默飞世尔科技（德国达姆施塔特） | \ | |
| 盐酸苯海拉明 | Sigma Aldrich（德国陶夫基兴） | D3630 | |
| 含4.5 g/L D-葡萄糖和2.2 g/L NaHCO₃的Eagle最小必需培养基3 | Sigma Aldrich（德国陶夫基兴） | D5671 | |
| 阻抗仪（ECIS Zθ) | 应用生物物理学公司（美国纽约州特洛伊） | \ | |
| 8通道电极阵列（8W1E PET） | 应用生物物理学公司（美国纽约州特洛伊） | \ | PET 基材，厚度 0.049 mm2 工作电极和约50 mm2 对电极（金） |
| 96孔电极阵列（96W1E+ PET） | 应用生物物理学公司（美国纽约州特洛伊） | \ | 带两个电极（金）的PET基底，电极间距为0.256 mm2 总电极面积 |
| 胎牛血清（FCS） | Biochrom（德国柏林） | S0615 | |
| 盐酸组胺 | 卡尔·罗特（德国卡尔斯鲁厄） | 4017.1 | |
| 层流罩（Herasafe，KS 12） | 赛默飞世尔科技（德国达姆施塔特） | 51022515 | II级生物安全柜 |
| Leibovitz' L-15 培养基 | 赛默飞世尔科技（德国达姆施塔特） | 21083-027 | |
| L-谷氨酰胺 | Sigma Aldrich（德国陶夫基兴） | G7513 | |
| 大号微量移液器（100 - 1000 µL | Brandt（德国韦尔泰姆） | 704780 | |
| 大号微量移液器（20 - 200 µL) | Brandt（德国韦尔泰姆） | 704778 | |
| 显微镜（相差，Nikon Diaphot） | 尼康（Dü德国杜塞尔多夫 | ||
| 青霉素/链霉素 | Sigma Aldrich（德国陶夫基兴） | P0781 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma Aldrich（德国陶夫基兴） | D8537 | |
| 移液管，血清学 | Greiner bio-one（德国弗里克豪森） | 607 180 | |
| 移液器（accu-jet pro） | Brandt（德国韦尔泰姆） | 26300 | |
| 胰蛋白酶 | Sigma Aldrich（德国陶夫基兴） | T4174 | 在含1 mM EDTA的PBS中 |
| 15 mL 离心管 | 德国弗里克豪森 Greiner bio-one 公司 | 188 271 | |
| 50 mL 离心管 | Greiner bio-one（德国弗里克豪森） | 210 261 | |
| U-373 MG 细胞 | ATCC（美国马里兰州罗克维尔） | ATCC HTB-17 | |
| 水浴锅（TW21） | Julabo（德国席尔巴赫） | \ |
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