从主动脉周围脂肪组织中分离、培养及诱导神经嵴来源的脂肪干细胞向脂肪细胞分化

摘要

我们介绍一种从Wnt-1 Cre^+/-;Rosa26^RFP/+小鼠主动脉周围脂肪组织中分离、培养并诱导神经嵴来源的脂肪源性干细胞（NCADSCs）成脂分化的实验方案。NCADSCs可作为体外研究脂肪生成或脂质合成的便捷ADSC来源。

摘要

血管周围（即血管周围脂肪组织，简称PVAT）存在过量脂肪组织与心血管疾病高风险相关。来源于不同脂肪组织的脂肪源性间充质干细胞（ADSCs）具有不同的特征，而来源于PVAT的ADSCs尚未被充分表征。在最近的一项研究中，我们报道了主动脉弓周围脂肪组织（PAAT）中的一部分ADSCs起源于神经嵴细胞（NCCs），这是一类源自外胚层的短暂存在的迁移性细胞群体。

本文介绍了一种从Wnt-1 Cre^+/-;Rosa26^RFP/+小鼠的主动脉周围脂肪组织（PAAT）中分离红色荧光蛋白（RFP）标记的神经嵴细胞（NCCs），并在体外诱导其向脂肪细胞分化的实验方案。简言之，通过酶消化法从PAAT中分离获得基质血管组分（SVF），再利用荧光激活细胞分选技术（FACS）分离出RFP⁺的神经嵴来源脂肪源性干细胞（NCADSCs）。这些NCADSCs可分化为棕色和白色脂肪细胞，能够进行冷冻保存，并在约3–5代内保持其脂肪生成潜能。本方案可从血管周围脂肪组织（PVAT）中大量获取ADSCs，用于在体外建立PVAT脂肪生成或脂质合成的模型。因此，这些NCADSCs为研究PVAT分化过程中涉及的分子调控机制提供了一个有价值的实验体系。

引言

全球肥胖患病率不断上升，这增加了心血管疾病和糖尿病等慢性相关疾病的风险¹。血管周围脂肪组织（PVAT）包绕着血管，是参与血管功能的内分泌和旁分泌因子的主要来源。临床研究表明，PVAT含量高是心血管疾病的独立危险因素^2,3，其病理功能取决于构成PVAT的脂肪源性干细胞（ADSCs）的表型⁴。

尽管像小鼠3T3-L1、3T3-F442A和OP9这样的ADSC细胞系是研究脂肪生成或脂质生成的有用细胞模型⁵，但不同细胞系与原代细胞之间在脂肪生成的调控机制上存在差异。直接从脂肪组织中分离获得的基质血管组分（SVF）中的ADSCs，经诱导分化为脂肪细胞后，最能模拟体内脂肪生成和脂质生成过程⁶。然而，ADSCs具有脆弱性高、浮力强以及细胞大小和免疫表型变异大等特点，使其直接分离具有挑战性。此外，不同的分离方法也可能显著影响这些细胞的表型及其脂肪生成潜能⁷，因此迫切需要一种能够保持ADSC完整性的标准化操作方案。

脂肪组织通常分为形态和功能上不同的白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（....

方案

动物实验方案已通过上海交通大学动物护理委员会的审查和批准。

1. Wnt-1 Cre^+/-;Rosa26^RFP/+ 小鼠的制备

1. 将 Wnt-1 Cre^+/- 小鼠¹⁶ 与 Rosa26^RFP/+ 小鼠¹⁸ 杂交，以获得 Wnt-1 Cre^+/-;Rosa26^RFP/+ 小鼠。将小鼠饲养于25 °C、45%湿度的无病原体设施中，光照/黑暗周期为12小时，直至其达到4–8周龄。

2. PAAT 的解剖

注意：见图1。

1. 将所有手术器械（例如手术剪、标准镊子以及显微外科剪和镊）在121 °C条件下高压灭菌30分钟。
2. 配制消化液（含1型胶原酶2 mg/mL的高糖Dulbecco改良Eagle培养基[HDMEM]）和培养液（含10%胎牛血清[FBS]和1% v/v青霉素-链霉素[PS]的HDMEM）。使用0.22 μm注射器滤器过滤灭菌后备用。
3. 根据需要，采用紫外线、乙醇、过滤或蒸汽等方式对细胞....

结果

采用上述方案，我们从5–6只Wnt-1 Cre^+/-;Rosa26^RFP/+小鼠（48周龄，雄性或雌性）获得了约0.5–1.0 × 10⁶个ADSCs。

从小鼠中采集PAAT的流程图见图1。NCADSCs的形态与其他小鼠脂肪组织来源的ADSC相似。培养7–8天后，NCADSCs达到80–90%融合度，且呈现出伸展的成纤维细胞样形态（图2B,C）。

为进一步证实NCADSCs具有成脂分化潜能，诱导NCADSCs向白色或棕色脂肪细胞分化。采用油红O染色检测成熟脂肪细胞（图2）。诱导后，NCADSCs在白色和棕色脂肪细胞方向均表现出较强的成脂分化潜能。在白色或棕色成脂诱导8天后可观察到成熟脂肪细胞，超过60%的NCADSCs显示出成脂分化（

讨论

本研究中，我们介绍了一种可靠的方法，用于分离、培养及诱导来自Wnt-1 Cre^+/-;Rosa26^RFP/+转基因小鼠PVAT组织的NCADSCs，该小鼠模型可产生RFP⁺ ADSCs。既往研究表明，NCADSCs与非NCADSCs在多种通用的多能间充质干细胞（MSCs）标志物表达上无显著差异²²，且NCADSCs在体外具有较强的向脂肪细胞分化潜能^15,22,23。因此，采用本方案分离获得的NCADSCs适用于大多数ADSC相关研究。

本方法的优势在于，转基因NCADSCs中固有的荧光报告基因使得细胞分离过程简便且经济，无需使用抗体或基于探针的流式细胞术分选（FACS），也无需磁珠激活细胞分选²⁴。此外，RFP的荧光强度强于FITC，进一.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4% PFA	BBI life sciences	E672002-0500	批号 #: EC11FA0001
琼脂糖	ABCONE (中国)	A47902	工作浓度 1%
抗 cebp/α	ABclonal	A0904	工作浓度 1:1000
抗小鼠 IgG，HRP 标记	CST	7076	工作浓度 1:5000
抗 perilipin	Abcam	AB61682	工作浓度 1 μg/mL；批号 #: GR66486-54
抗 PPARy	SANTA CRUZ	sc-7273	工作浓度 0.2 μg/mL
抗兔 IgG，HRP 标记	CST	7074	工作浓度 1:5000
抗β-微管蛋白	CST	2146	工作浓度 1:1000
牛血清白蛋白（BSA）	VWR life sciences	0332-100G	工作浓度 50 mg/mL；批号 #: 0536C008
胶原酶 I 型	Gibco	17018029
地塞米松	Sigma-Aldrich	D4902	工作浓度 0.1 µM
红细胞裂解液	Invitrogen	00-4333
胎牛血清（FBS）	Corning	R35-076-CV	工作浓度 50 mg/mL；批号 #: R2040212FBS
HBSS	Gibco	14025092
高糖 DMEM（HDMEM）	Gelifesciences	SH30243.01	批号 #: AD20813268
IBMX	Sigma-Aldrich	I7018	工作浓度 0.5 mM
胰岛素	Sigma-Aldrich	I3536	工作浓度 1 μg/mL
显微外科镊	苏州明仁医疗器械有限公司（中国）	MR-F201A-1
显微外科剪	苏州明仁医疗器械有限公司（中国）	MR-H121A
油红 O 溶液	Sigma-Aldrich	O1516	工作浓度 0.3%
PBS（磷酸盐缓冲液）	ABCONE (中国)	P41970
青霉素-链霉素	Gibco	15140122
PrimeScript RT 试剂盒	TAKARA	RR047A	批号 #: AK4802
RNeasy 试剂盒	TAKARA	9767	批号 #: AHF1991D
Rosa26RFP/+ 小鼠	JAX	No.007909	C57BL/6 背景；雄性和雌性
罗格列酮	Sigma-Aldrich	R2408	工作浓度 1 μM
标准镊子	苏州明仁医疗器械有限公司（中国）	MR-F424
手术剪	苏州明仁医疗器械有限公司（中国）	MR-S231
SYBR Premix Ex Taq	TAKARA	RR420A	批号 #: AK9003
三碘甲腺原氨酸	Sigma-Aldrich	T2877	工作浓度 10 nM
Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox 小鼠	JAX	No.009107	C57BL/6 背景；雄性和雌性