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方法文章

从主动脉周围脂肪组织中分离、培养及诱导神经嵴来源的脂肪干细胞向脂肪细胞分化

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DOI：

10.3791/60691

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2020年3月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Shanghai Chest Hospital, Shanghai Jiao Tong University, 2Shanghai Institute of Nutrition and Health, Shanghai Institute for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, 3Shanghai Key Laboratory of Hypertension, Shanghai Institute of Hypertension, Ruijin Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 4Department of Cardiology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 5Department of Cardiology, Shanghai Key Laboratory of Clinical Geriatric Medicine, Huadong Hospital Affiliated to Fudan University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们介绍一种从Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+小鼠主动脉周围脂肪组织中分离、培养并诱导神经嵴来源的脂肪源性干细胞（NCADSCs）成脂分化的实验方案。NCADSCs可作为体外研究脂肪生成或脂质合成的便捷ADSC来源。

摘要

血管周围（即血管周围脂肪组织，简称PVAT）存在过量脂肪组织与心血管疾病高风险相关。来源于不同脂肪组织的脂肪源性间充质干细胞（ADSCs）具有不同的特征，而来源于PVAT的ADSCs尚未被充分表征。在最近的一项研究中，我们报道了主动脉弓周围脂肪组织（PAAT）中的一部分ADSCs起源于神经嵴细胞（NCCs），这是一类源自外胚层的短暂存在的迁移性细胞群体。

本文介绍了一种从Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+小鼠的主动脉周围脂肪组织（PAAT）中分离红色荧光蛋白（RFP）标记的神经嵴细胞（NCCs），并在体外诱导其向脂肪细胞分化的实验方案。简言之，通过酶消化法从PAAT中分离获得基质血管组分（SVF），再利用荧光激活细胞分选技术（FACS）分离出RFP+的神经嵴来源脂肪源性干细胞（NCADSCs）。这些NCADSCs可分化为棕色和白色脂肪细胞，能够进行冷冻保存，并在约3–5代内保持其脂肪生成潜能。本方案可从血管周围脂肪组织（PVAT）中大量获取ADSCs，用于在体外建立PVAT脂肪生成或脂质合成的模型。因此，这些NCADSCs为研究PVAT分化过程中涉及的分子调控机制提供了一个有价值的实验体系。

引言

全球肥胖患病率不断上升，这增加了心血管疾病和糖尿病等慢性相关疾病的风险1。血管周围脂肪组织（PVAT）包绕着血管，是参与血管功能的内分泌和旁分泌因子的主要来源。临床研究表明，PVAT含量高是心血管疾病的独立危险因素2,3，其病理功能取决于构成PVAT的脂肪源性干细胞（ADSCs）的表型4。

尽管像小鼠3T3-L1、3T3-F442A和OP9这样的ADSC细胞系是研究脂肪生成或脂质生成的有用细胞模型5，但不同细胞系与原代细胞之间在脂肪生成的调控机制上存在差异。直接从脂肪组织中分离获得的基质血管组分（SVF）中的ADSCs，经诱导分化为脂肪细胞后，最能模拟体内脂肪生成和脂质生成过程6。然而，ADSCs具有脆弱性高、浮力强以及细胞大小和免疫表型变异大等特点，使其直接分离具有挑战性。此外，不同的分离方法也可能显著影响这些细胞的表型及其脂肪生成潜能7，因此迫切需要一种能够保持ADSC完整性的标准化操作方案。

脂肪组织通常分为形态和功能上不同的白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）8，二者含有不同的脂肪源性间充质干细胞（ADSCs）9。尽管已有研究对来源于腹膜后和腹股沟皮下WAT的ADSCs进行了表征9,10,11,12，但对于主要由BAT构成的血管周围脂肪组织（PVAT）来源的ADSCs，目前了解较少13。

在最近的一项研究中，我们发现主动脉弓周围脂肪组织（PAAT）中的一部分常驻ADSCs来源于神经嵴细胞（NCCs），这是一类起源于外胚层的短暂存在的迁移性前体细胞群体14,15。我们使用Wnt1-Cre转基因小鼠来追踪神经嵴细胞的发育过程16,17。通过将Wnt1-Cre+小鼠与Rosa26RFP/+小鼠杂交，获得Wnt1-Cre+/-;Rosa26RFP/+小鼠，在该小鼠中，NCCs及其后代被标记为红色荧光蛋白（RFP），可在体内和体外方便地进行追踪15。本文中，我们描述了一种从小鼠PAAT中分离神经嵴来源的ADSCs（NC来源的ADSCs，或NCADSCs）的方法，并诱导NCADSCs分化为白色脂肪细胞或棕色脂肪细胞。

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方案

动物实验方案已通过上海交通大学动物护理委员会的审查和批准。

1. Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+ 小鼠的制备

  1. 将 Wnt-1 Cre+/- 小鼠16 与 Rosa26RFP/+ 小鼠18 杂交，以获得 Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+ 小鼠。将小鼠饲养于25 °C、45%湿度的无病原体设施中，光照/黑暗周期为12小时，直至其达到4–8周龄。

2. PAAT 的解剖

注意：见图1。

  1. 将所有手术器械（例如手术剪、标准镊子以及显微外科剪和镊）在121 °C条件下高压灭菌30分钟。
  2. 配制消化液（含1型胶原酶2 mg/mL的高糖Dulbecco改良Eagle培养基[HDMEM]）和培养液（含10%胎牛血清[FBS]和1% v/v青霉素-链霉素[PS]的HDMEM）。使用0.22 μm注射器滤器过滤灭菌后备用。
  3. 根据需要，采用紫外线、乙醇、过滤或蒸汽等方式对细胞培养试剂进行灭菌处理。
  4. 准备一个含Hanks平衡盐溶液（HBSS）的培养皿，以及一个含10 mL HBSS并添加1% v/v PS溶液的15 mL锥形管。两者均置于冰上保存。
  5. 用异氟烷麻醉小鼠15，并通过颈椎脱位处死。将尸体浸入盛有75%酒精（200 mL）的烧杯中5分钟，以消毒皮肤表面。
  6. 剪开并分离腹部皮肤，沿腹侧中线从骨盆向颈部剪开。打开腹腔，移开肝脏以暴露膈肌19。
  7. 剪开中线两侧的膈肌和肋骨，掀开肋骨以暴露心脏和肺。
  8. 取出肺和胸腺，并连同主动脉和心脏一起取出胸主动脉周围脂肪组织（PAAT）。
  9. 在主动脉根部切断主动脉以去除心脏。在主动脉弓与降主动脉之间做一切口，小心分离附着于这些结构以及左右颈总动脉周围的脂肪组织与后胸壁。将组织转移至培养皿中预冷的HBSS缓冲液中。
  10. 使用无菌镊子尽可能去除血管系统（如主动脉、颈总动脉及其他小血管）和筋膜，然后将脂肪组织转移至含有0.5 mL冰上预冷HBSS缓冲液的2 mL离心管中。

3. SVF 的分离

将5-6只小鼠的PAAT收集到一个含有1 mL新鲜配制消化液的2 mL微量离心管中，在室温（RT）下用手术剪在Eppendorf管中剪碎组织。

  1. 将混合物转移至含有9 mL消化液的50 mL离心管中。使用1 mL移液器反复吹打10次以均质化组织。
  2. 将离心管置于37 °C、100 rpm持续振荡条件下孵育30–45分钟，并每隔5–10分钟检查一次，以防止过度消化。此步骤对提高细胞活力和得率至关重要。
    注意：良好的组织消化结果应为均匀的浅黄色脂肪组织，在轻轻摇动离心管时肉眼可见。
  3. 加入5 mL含10% FBS和1% v/v青霉素-链霉素（PS）的HDMEM（室温），通过移液充分混匀以终止消化反应。
  4. 将细胞悬液在室温下以500 × g离心5分钟。基质血管组分（SVF）将呈现为棕褐色沉淀。小心吸除漂浮的脂肪细胞，并倾倒剩余上清液，注意不要扰动SVF沉淀。将SVF沉淀溶解于10 mL培养基中，并通过70 µm细胞滤网过滤。
  5. 再次以500 × g在室温下离心5分钟，弃去上清液，将沉淀轻轻重悬于15 mL锥形管中的5 mL红细胞裂解缓冲液中，室温孵育10分钟。
  6. 加入10 mL含1% FBS的1× PBS终止反应。将细胞悬液在4 °C下以500 × g离心5分钟，弃去上清液，再将沉淀重悬于10 mL含1% FBS的1× PBS中。
  7. 再次在4 °C下以500 × g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀在4 °C下用15 mL锥形管中的5 mL培养基轻轻重悬。
  8. 经过最后一次离心（4 °C下500 × g离心5分钟）后，将沉淀细胞重悬于5 mL冰上预冷的FACS缓冲液（含10% FBS、100单位/mL DNA酶I和1% v/v青霉素-链霉素的PBS）中，并用血细胞计数板进行细胞计数。

4. 通过FACS分离NCADSCs

  1. 根据操作手册设置并优化细胞分选仪。选择100 µm喷嘴，对收集管进行灭菌，安装所需的收集装置，并设置侧向液流20。
  2. 建议使用561 nm黄色/绿色激光器及579/16光学滤光片对RFP+细胞进行分选。使用阴性对照和单染阳性对照进行补偿调节。分选门控策略见图2A。
  3. 将细胞通过40 µm滤网过滤，以500 × g离心5分钟，并用2 mL FACS缓冲液重悬细胞，细胞密度为0.5–1 × 107/mL。将细胞转移至明确标记的5 mL圆底聚苯乙烯管中，然后上机分选。
  4. 在4 °C条件下运行实验样本管，打开偏转板，将细胞分选至预先加入含1% FBS和1% v/v PS的RPMI培养基的15 mL锥形管中。
    注意：避免样品暴露于强光下，以尽量减少RFP淬灭。

5. NCADSCs 的培养

  1. 将分选后的细胞以5,000个细胞/cm2的密度接种于12孔培养板中，加入完全培养基，在37 °C、含5% CO2的湿润环境中培养20–24小时。
  2. 移除培养基，用预热（37 °C）的PBS洗涤细胞以去除细胞碎片，然后加入新鲜培养基。
  3. 当细胞融合度达到80–90%时，在37 °C孵育箱中用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化单层细胞3–5分钟，并用2 mL培养基中和。
  4. 将收集的细胞在室温下以250 × g离心15分钟，弃上清，用1 mL培养基重悬细胞，用血细胞计数板计数细胞。
  5. 以5,000个细胞/cm2的密度将细胞接种至12孔培养板中。
  6. 将剩余细胞重悬于含10% DMSO的培养基中，冻存后置于液氮中保存。

6. NCADSCs 的成脂诱导

  1. 在细胞融合度达到80–90%及标准培养条件下，诱导NCADSCs进行脂肪向分化21。
  2. 对于棕色脂肪向诱导，首先使用棕色脂肪向诱导培养基（HDMEM、10% FBS、1% v/v PS、0.5 mM/L IBMX、0.1 μM/L 地塞米松、1 μM/L 罗格列酮、10 nmol/L 三碘甲腺原氨酸及1 μg/mL 胰岛素）处理培养的细胞2天。用PBS洗涤细胞2次，更换为新鲜培养基（HDMEM、10% FBS、1% v/v PS、1 μM/L 罗格列酮、10 nmol/L 三碘甲腺原氨酸及1 μg/mL 胰岛素）。每2天更换一次该培养基，共更换3–5次。
  3. 对于白色脂肪向诱导，首先使用白色脂肪向诱导培养基（HDMEM、10% FBS、1% v/v PS、0.5 mM/L IBMX、0.1 μM/L 地塞米松及1 μg/mL 胰岛素）处理细胞2天。用PBS洗涤细胞2次，更换为新鲜培养基（HDMEM、10% FBS、1% v/v PS及1 μg/mL 胰岛素）。每2天更换一次该培养基，共更换3–5次。
  4. 根据需要对脂肪向分化细胞进行分析。
    注意：使用PBS洗涤细胞时操作应轻柔。已分化的脂肪细胞容易被冲洗脱落。

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结果

采用上述方案，我们从5–6只Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+小鼠（48周龄，雄性或雌性）获得了约0.5–1.0 × 106个ADSCs。

从小鼠中采集PAAT的流程图见图1。NCADSCs的形态与其他小鼠脂肪组织来源的ADSC相似。培养7–8天后，NCADSCs达到80–90%融合度，且呈现出伸展的成纤维细胞样形态（图2B,C）。

为进一步证实NCADSCs具有成脂分化潜能，诱导NCADSCs向白色或棕色脂肪细胞分化。采用油红O染色检测成熟脂肪细胞（图2）。诱导后，NCADSCs在白色和棕色脂肪细胞方向均表现出较强的成脂分化潜能。在白色或棕色成脂诱导8天后可观察到成熟脂肪细胞，超过60%的NCADSCs显示出成脂分化（

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讨论

本研究中，我们介绍了一种可靠的方法，用于分离、培养及诱导来自Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+转基因小鼠PVAT组织的NCADSCs，该小鼠模型可产生RFP+ ADSCs。既往研究表明，NCADSCs与非NCADSCs在多种通用的多能间充质干细胞（MSCs）标志物表达上无显著差异22，且NCADSCs在体外具有较强的向脂肪细胞分化潜能15,22,23。因此，采用本方案分离获得的NCADSCs适用于大多数ADSC相关研究。

本方法的优势在于，转基因NCADSCs中固有的荧光报告基因使得细胞分离过程简便且经济，无需使用抗体或基于探针的流式细胞术分选（FACS），也无需磁珠激活细胞分选24。此外，RFP的荧光强度强于FITC，进一...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

国家重点研发计划&中国国家重点研发计划（2018YFC1312504）、国家自然科学基金（81970378、81670360、81870293）以及上海市科学技术委员会（17411971000、17140902402）为本研究提供了资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4% PFABBI life sciencesE672002-0500批号 #: EC11FA0001
琼脂糖ABCONE (中国)A47902工作浓度 1%
抗 cebp/αABclonalA0904工作浓度 1:1000
抗小鼠 IgG，HRP 标记CST7076工作浓度 1:5000
抗 perilipinAbcamAB61682工作浓度 1 μg/mL；批号 #: GR66486-54
抗 PPARySANTA CRUZsc-7273工作浓度 0.2 μg/mL
抗兔 IgG，HRP 标记CST7074工作浓度 1:5000
抗β-微管蛋白CST2146工作浓度 1:1000
牛血清白蛋白（BSA）VWR life sciences0332-100G工作浓度 50 mg/mL；批号 #: 0536C008
胶原酶 I 型Gibco17018029
地塞米松Sigma-AldrichD4902工作浓度 0.1 µM
红细胞裂解液Invitrogen00-4333
胎牛血清（FBS）CorningR35-076-CV工作浓度 50 mg/mL；批号 #: R2040212FBS
HBSSGibco14025092
高糖 DMEM（HDMEM）GelifesciencesSH30243.01批号 #: AD20813268
IBMXSigma-AldrichI7018工作浓度 0.5 mM
胰岛素Sigma-AldrichI3536工作浓度 1 μg/mL
显微外科镊苏州明仁医疗器械有限公司（中国）MR-F201A-1
显微外科剪苏州明仁医疗器械有限公司（中国）MR-H121A
油红 O 溶液Sigma-AldrichO1516工作浓度 0.3%
PBS（磷酸盐缓冲液）ABCONE (中国)P41970
青霉素-链霉素Gibco15140122
PrimeScript RT 试剂盒TAKARARR047A批号 #: AK4802
RNeasy 试剂盒TAKARA9767批号 #: AHF1991D
Rosa26RFP/+ 小鼠JAXNo.007909C57BL/6 背景；雄性和雌性
罗格列酮Sigma-AldrichR2408工作浓度 1 μM
标准镊子苏州明仁医疗器械有限公司（中国）MR-F424
手术剪苏州明仁医疗器械有限公司（中国）MR-S231
SYBR Premix Ex TaqTAKARARR420A批号 #: AK9003
三碘甲腺原氨酸Sigma-AldrichT2877工作浓度 10 nM
Wnt1-Cre+;PPARγflox/flox 小鼠JAXNo.009107C57BL/6 背景；雄性和雌性

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